布魯氏菌、弓形蟲及巴爾通體多重TaqMan 熒光PCR 檢測方法的建立及應(yīng)用

趙 冉，蔡振鴻，陳 瓊，徐 曄，陳永鋒，連玉華，李謂娟，溫亞萍，呂菊香

（1.廈門市動物疫病預(yù)防控制中心，福建廈門 361009；2.廈門市思明區(qū)市政中心，福建廈門 361005；3.連云港海關(guān)綜合技術(shù)中心，江蘇連云港 222000；4.廈門市同安區(qū)農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法大隊，福建廈門 361000；5.廈門市翔安區(qū)農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法大隊，福建廈門 361100）

布魯氏菌是一種胞內(nèi)寄生小球桿狀細(xì)菌，可造成感染動物生殖器官炎癥及生殖障礙，動物感染后以長期發(fā)熱、多汗、關(guān)節(jié)痛及肝脾腫大為主要特征。世界上已有170 多個國家和地區(qū)報告發(fā)生人畜布魯氏菌?。ㄒ韵潞喎Q“布病”）。1993—2021 年，我國新發(fā)布病人數(shù)從329 人增加到71 268 人，其中2021 年人間新發(fā)布病人數(shù)是歷史上記載最多的一年，并且有3 例死亡病例的報告[1-2]。弓形蟲又稱弓形體，是一種廣泛寄生于人和動物有核細(xì)胞內(nèi)的原蟲，呈世界范圍內(nèi)分布，動物宿主種類廣泛，幾乎所有溫血動物均可被感染，主要引起感染動物眼病、肝病、肺炎、心包心肌炎、流產(chǎn)等疾病[3]。貓既是弓形蟲的終末宿主又是中間宿主，在弓形蟲傳播中起著重要作用。巴爾通體是一種胞內(nèi)寄生的小球桿菌，有40 多個種和亞種，人和動物普遍易感，可導(dǎo)致淋巴結(jié)炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎等疾病，重者危及生命[4]。我國北京、上海、浙江、山東、河南、安徽、云南、福建等省市均有巴爾通體感染的報道，涉及的動物包括犬、貓、鼠、猴、虎和豬等。

布魯氏菌、弓形蟲和巴爾通體均為重要的人獸共患病病原。目前城市人群雖然與家畜接觸的機會較少，但隨著犬貓等寵物數(shù)量的增多，老人和低齡兒童等自身免疫水平較低人群的感染風(fēng)險增大。本研究旨在建立一種高通量、高靈敏、高特異的多重TaqMan 熒光PCR 檢測方法，用于寵物及家畜布魯氏菌、弓形蟲及巴爾通體感染的早期檢測及篩查，以期及時消除潛在的致病風(fēng)險，保障公共衛(wèi)生安全。

1 材料與方法

1.1 菌株核酸及臨床樣本

金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、表皮葡萄球菌（CMCC26069）、痢疾志賀桿菌（CMCC51105）、傷寒沙門氏菌（CMCC50071）、腸炎沙門氏菌（CMCC50335）、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（CICC10869）、大腸桿菌（ATCC25922）、弗氏枸櫞酸桿菌（ATCC43864）、奇異變型桿菌（Pro.mira1401）陽性核酸，由廈門海關(guān)技術(shù)中心惠贈；犬鉤端螺旋體、犬巴貝斯焦蟲陽性核酸，由連云港海關(guān)技術(shù)中心惠贈；布魯氏菌（A19 疫苗株）陽性核酸，由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心惠贈；弓形蟲（RH）陽性核酸，由上海寄生蟲研究所惠贈；巴爾通體（ATCC49882）陽性核酸，由上海交通大學(xué)惠贈。304 份犬貓抗凝全血樣品，來自廈門市備案的70 家寵物診療機構(gòu)。

1.2 主要試劑與儀器

探針法熒光PCR 試劑（Premix ExTaqTM），購自大連寶生物工程有限公司；核酸提取試劑盒（RD21062C），購自南京中科拜爾醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司；熒光定量PCR 儀（QuantStudio 6 Flex），購自美國ABI 公司；小型臺式冷凍離心機（MIKRO 220R），購自德國HETTICH 公司；全自動核酸提取儀（KINGFISHER），購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 樣本核酸提取

將全血樣品反復(fù)凍融2 次后，用核酸提取試劑盒和全自動核酸提取儀提取核酸。獲得的核酸樣本于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物、探針及陽性質(zhì)粒序列

利用生物信息學(xué)軟件BLAST 及primer premier 5.0，對參考文獻[5-7]中多對引物及探針序列進行比對和篩選，最終選擇布魯氏菌BCSP3l基因、弓形蟲GRA7基因、巴爾通體ssrA基因作為靶基因，相應(yīng)的引物及探針序列見表1。使用前分別將引物和探針用滅菌ddH2O 稀釋至終濃度為10 μmol/L，分裝后置-20 ℃保存?zhèn)溆?。陽性質(zhì)粒序列參考的GenBank 登錄號依次為MG457034.1、MT361128.1、MN276422.1。

表1 引物、探針及陽性質(zhì)粒序列

1.5 陽性模板制備

分別取3 種陽性質(zhì)粒各4 μg 用400 μL 滅 菌ddH2O 溶解。根據(jù)質(zhì)?？截悢?shù)濃度（copies/μL）=（質(zhì)粒濃度×10-9× 稀釋倍數(shù)×6.02×1023）/（660 道爾頓/堿基×堿基數(shù)），得到布魯氏菌、弓形蟲和巴爾通體陽性質(zhì)粒的拷貝數(shù)濃度依次為3.27×109、3.20×109、3.04×109copies/μL。

1.6 反應(yīng)條件優(yōu)化

以拷貝數(shù)濃度為104copies/μL 的陽性質(zhì)粒為模板，引物及探針濃度采用矩陣組合方式進行篩選；分別設(shè)置退火溫度為56～64 ℃，延伸時間為34～60 s，循環(huán)數(shù)為35～50 次，進行反應(yīng)條件優(yōu)化。以得到典型“S”形擴增曲線及最高熒光信號強度的條件為最佳反應(yīng)條件。

1.7 交叉干擾性試驗

以拷貝數(shù)濃度為104copies/μL 的陽性質(zhì)粒為模板，采用建立的多重TaqMan 熒光PCR 檢測方法分別對3 種病原的雙重模板和三重模板進行檢測，驗證多對引物、探針、模板間是否存在交叉干擾現(xiàn)象。

1.8 特異性試驗

采用建立的多重TaqMan 熒光PCR 檢測方法分別對布魯氏菌、弓形蟲和巴爾通體的陽性核酸及犬鉤端螺旋體、犬巴貝斯蟲等11 種對照核酸進行檢測，驗證該方法的特異性。

1.9 靈敏性試驗

分別對布魯氏菌、弓形蟲和巴爾通體陽性模板進行10 倍梯度稀釋，拷貝數(shù)濃度范圍為100～105copies/μL。采用建立的多重TaqMan 熒光PCR 檢測方法，對上述系列稀釋樣品進行測定，驗證該方法的靈敏性。

1.10 重復(fù)性試驗

以拷貝數(shù)濃度為104copies/μL 的陽性質(zhì)粒為模板，采用同批次配制的反應(yīng)體系重復(fù)檢測3 次，計算批內(nèi)變異系數(shù)；采用3 個不同批次配制的反應(yīng)體系，計算批間變異系數(shù)。

1.11 臨床樣品檢測

采用建立的多重TaqMan 熒光PCR 檢測方法，對304 份臨床寵物犬貓全血樣品進行布魯氏菌、弓形蟲和巴爾通體的核酸檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)條件優(yōu)化

優(yōu)化后的反應(yīng)體系共20.0 μL：Premix ExTaqTM（Probe qPCR）10.0 μL，布魯氏菌上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，探 針（10 μmol/L）1.0 μL，弓形蟲上下游引物（10 μmol/L）各0.7 μL，探針（10 μmol/L）1.4 μL，巴爾通體上下游引物（10 μmol/L）各0.3 μL，探針（10 μmol/L）0.6 μL，同等工作濃度的單重或混合核酸模板（104copies/μL）4.0 μL。

優(yōu)化后的反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、58 ℃60 s（收集信號），共40 個循環(huán)。被檢樣品擴增曲線呈現(xiàn)典型“S”形且Ct ≤35，判定為陽性；Ct ＞40，判為陰性；介于兩者之間判為可疑，需進行重復(fù)試驗，結(jié)果一致且有明顯的“S”形擴增曲線時，判為陽性。

2.2 交叉干擾性試驗

采用建立的多重TaqMan 熒光PCR 檢測方法，分別對3 種病原的雙重模板和三重模板進行檢測。結(jié)果（圖1）顯示，在檢測上述混合模板時，均能得到良好的特異性擴增曲線，未發(fā)現(xiàn)不同成分間存在交叉干擾反應(yīng)。

圖1 交叉干擾性試驗結(jié)果

2.3 特異性試驗

采用建立的多重TaqMan 熒光PCR 檢測方法檢測相關(guān)樣品。結(jié)果（圖2）顯示，布魯氏菌、巴爾通體和弓形蟲陽性核酸均出現(xiàn)典型“S”形擴增曲線，其余11 株對照菌株核酸均無擴增信號，說明本方法特異性較好。

圖2 特異性試驗結(jié)果

2.4 靈敏性試驗

采用建立的多重TaqMan 熒光PCR 方法檢測系列稀釋的陽性模板。結(jié)果（圖3）顯示，當(dāng)布魯氏菌、弓形蟲和巴爾通體模板的拷貝數(shù)濃度為3×100copies/μL 時，均可見明顯擴增曲線。

圖3 靈敏性試驗結(jié)果

2.5 重復(fù)性試驗

采用建立的多重TaqMan 熒光PCR 方法重復(fù)檢測系列稀釋的陽性模板。結(jié)果（表2）顯示，批內(nèi)及批間重復(fù)性試驗的變異系數(shù)（CV）均小于2%，說明該方法具有良好的重復(fù)性。

表2 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.6 臨床樣品檢測

該方法在4 h 內(nèi)完成了304 份寵物犬貓全血樣品的檢測，未檢出布魯氏菌、弓形蟲及巴爾通體陽性核酸。

3 討論

隨著人們公共衛(wèi)生意識的增強，人們對寵物中的人獸共患病更加關(guān)注。2018—2020 年，在我國16 個城市收集的1 368 份寵物犬血清中，光滑型布魯氏菌和粗糙型布魯氏菌的陽性率分別為0.36%和0.66%[1]；2019—2020 年，廈門市寵物醫(yī)院犬、貓弓形蟲陽性率分別為4.68%和5.24%[8]。此外，我國在多地犬貓血液中也檢出巴爾通體[9-10]。以上數(shù)據(jù)提示，廈門市寵物犬貓中亦可能存在布魯氏菌、弓形蟲及巴爾通體三種人獸共患病原菌共感染的風(fēng)險，應(yīng)及時進行流行病學(xué)調(diào)查，排除致病隱患。

科學(xué)準(zhǔn)確的檢測方法對疫病防控起到事半功倍的效果。熒光PCR 作為有效的檢測手段，已被成功運用于多種疾病的早期診斷及篩查。多重?zé)晒釶CR 方法的建立相對困難，既要解決不同引物、探針序列間相互干擾的問題，又要保證不同目的基因在同一反應(yīng)條件下能進行等量擴增，還要在提高靈敏性的同時，避免假陽性[11]。本研究通過對參考文獻[5-7]中多對引物及探針序列進行反復(fù)比對和篩選，最終選出針對布魯氏菌BCSP3l基因、弓形蟲GRA7基因及巴爾通體ssrA基因的3 對引物及探針進行組合及反應(yīng)體系優(yōu)化，成功建立了同時檢測布魯氏菌、弓形蟲及巴爾通體的多重TaqMan熒光PCR 方法。該方法特異性好，能同時檢測光滑型及粗糙型布魯氏菌、弓形蟲以及目前發(fā)現(xiàn)的40 多個巴爾通體種及亞種，對照菌株核酸均無擴增信號；抗干擾性強，可從單一模板及混合模板中檢出目標(biāo)基因，不同成分間無交叉干擾反應(yīng)；靈敏度高，對單一模板和三重模板的靈敏度均能達(dá)到3×100copies/μL；重復(fù)性好，批內(nèi)及批間重復(fù)試驗的變異系數(shù)均小于2%，同時具備抗干擾、操作簡便、特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好等特點，為臨床上布魯氏菌、弓形蟲及巴爾通體的檢測及流行病學(xué)調(diào)查提供了科學(xué)有效的技術(shù)手段。