產(chǎn)ACC脫氨酶細菌的篩選及對低溫脅迫下垂穗披堿草生長的影響

李明源 ，王繼蓮 ，姚拓 ，王振龍 ，張惠榮 ，柴加麗 ，劉曉婷 ，李青璞

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅省草業(yè)工程實驗室，中‐美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.喀什大學生命與地理科學學院，新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)自治區(qū)重點實驗室，新疆 喀什 844006）

1‐氨基環(huán)丙烷‐1‐羧酸（1‐aminocyclopropane‐1‐car‐boxylic acid，ACC）是高等植物內(nèi)源激素乙烯合成的直接前體，當植物遭受生物（如病原體感染）或非生物（如高溫、鹽漬、重金屬等）脅迫時，往往會引起體內(nèi)乙烯的大量合成［1-3］。但高濃度的乙烯會嚴重抑制植物生長，對農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)極為不利。有研究表明，一些土壤有益菌可分泌ACC脫氨酶，能將ACC水解成a-酮丁酸鹽和氨，從而降低逆境中植物體內(nèi)的乙烯水平［1，4-5］?，F(xiàn)已證實，通過微生物來源的 ACC 脫氨酶降低植物內(nèi)源乙烯水平是植物與土壤微生物共同進化過程中應對逆境脅迫的一項關鍵策略［6-8］。微生物通過水解其直接前體ACC降低植物乙烯濃度，增強植物抗逆性。作為回報，ACC可被這些微生物用作營養(yǎng)來源。植物和微生物之間的這種互惠關系有望被用于緩解植物在逆境環(huán)境中的生長壓力。

植物促生菌（Plant Growth-Promoting Bacteria，PGPB）是一類能對植物產(chǎn)生直接或間接促生作用的土壤有益菌［9］。產(chǎn)ACC脫氨酶是PGPB促進植物生長和增強抗逆性的重要機制之一［2］。植物遭受逆境時，體內(nèi)會積累大量的ACC，其中部分ACC通過ACC氧化酶轉(zhuǎn)化為乙烯；同時，大量的ACC以根系分泌物的形式釋放到根際土壤中，吸引能以ACC為營養(yǎng)的微生物在根際集聚［10］。這些微生物通過分解ACC，在實現(xiàn)自身營養(yǎng)繁殖的同時降低了根際的ACC濃度，致使植物根系內(nèi)外形成ACC濃度差，促使體內(nèi)ACC順濃度梯度釋放到土壤中，最終減少植物體內(nèi)的乙烯積累并產(chǎn)生促進作用［10-11］。

祁連山是我國西北地區(qū)重要的生態(tài)安全屏障。為獲得適用于該地區(qū)農(nóng)牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展所需生物肥料的優(yōu)良菌種，本研究以前期從祁連山高寒草地優(yōu)勢牧草根際或根內(nèi)分離的具有固氮、溶磷功能的PGPB為材料，篩選產(chǎn)ACC脫氨酶菌株，并通過盆栽接種實驗評估其對低溫脅迫下植物生長的影響。研究結(jié)果將對深入理解PGPB作用機制以及研制適用于高寒草地的生物菌肥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌種來源

供試菌株為實驗室前期從甘肅農(nóng)業(yè)大學天祝高山草原生態(tài)系統(tǒng)試驗站（代號TZ），地理位置為N 37°11′、E 102°48′，海拔 2 884 m、中國科學院海北高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)定位研究站（代號MY），地理位置N 37°37'、E 109°11'，3 240 m 的高寒草地優(yōu)勢牧草根際或根內(nèi)分離保存的PGPB，共821株（表1）。所有菌株經(jīng)LB培養(yǎng)基活化后備用。

表1 供試菌株來源Table 1 Information of tested strains

1.2 培養(yǎng)基

采用DF和ADF培養(yǎng)基［12］篩選有ACC脫氨酶活性的菌株，ADF培養(yǎng)基即用ACC（3.0 mmol/L，過濾滅菌）代替DF培養(yǎng)基中的（NH4）2SO4。Hogland's營養(yǎng)液參照文獻［1］配制。

1.3 主要試劑與設備

實驗所用試劑和設備為：ACC和α‐丁酮酸（分析純）購自Sigma公司；MDA、SOD、POD和CAT檢測試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒（OMEGA，USA）；紫外可見分光光度計（TU‐1901，北京普析通用儀器有限責任公司），光照培養(yǎng)箱（SPX‐GB‐300F，上海躍進醫(yī)療器械有限公司）。

1.4 產(chǎn)ACC脫氨酶菌株的篩選

參照Penrose等［12］方法，以點種法將供試菌株分別接種至DF和ADF培養(yǎng)基上，15 ℃培養(yǎng)3~5 d，每天觀察菌落生長情況。在連續(xù)3次傳代培養(yǎng)過程中，若ADF培養(yǎng)基上的菌落生長情況明顯好于DF培養(yǎng)基，則說明該菌株能夠以ACC為唯一氮源生長，即能合成ACC脫氨酶。

定量分析：將陽性菌株接入5 mL液體LB培養(yǎng)基 ，15 ℃ 、180 r/min 培 養(yǎng) 36 h，8 000×g、4 ℃ 離 心10 min棄上清。沉淀經(jīng)不含（NH4）2SO4的DF液體洗滌2次后重懸于7.5 mL的ADF液體中，15 ℃、180 r/min培養(yǎng) 36 h，8 000×g、4 ℃離心 10 min棄上清液。沉淀再經(jīng)0.1 mol/L Tris‐HCl（pH值7.6）洗滌2次，加入600 μL的0.1 mol/L Tris‐HCl（pH值8.5）重懸菌體沉淀，加入30 μL甲苯后渦旋振蕩30 s以裂解菌體。取100 μL甲苯化的菌液通過Bradford法測定菌體蛋白量表征其生物量。剩余的甲苯化菌液參照Glick等［12］方法測定ACC脫氨酶活性。分別以牛血清白蛋白和α‐丁酮酸為標準物繪制標準曲線計算菌株ACC脫氨酶活性。酶活性是指單位時間內(nèi)，菌體蛋白催化ACC脫氨分解為a‐丁酮酸的微摩爾數(shù)，單位：μmol/（mg?h）。

1.5 產(chǎn)ACC脫氨酶菌株16S rRNA基因擴增與系統(tǒng)發(fā)育分析

通過細菌基因組DNA提取試劑盒提取陽性菌株DNA，以通用引物27F和1 492R［13］擴增 16S rRNA基因，PCR產(chǎn)物送由楊凌天潤奧科生物科技有限公司完成測序。測序結(jié)果提交http：//ezbiocloud.net/數(shù)據(jù)庫比對分析，利用MEGA 7.0軟件以鄰近法（Neighbor-Joining）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 值為 1000。

1.6 植物促生實驗

選用祁連山高寒草地人工補播主要牧草品種—垂穗披堿草（Elymus nutans）為供試植物，栽培方式為沙培。種子經(jīng)1%的NaClO溶液表面消毒5 min，無菌水沖洗3遍后均勻播種于塑料杯中（口徑9.5 cm×底徑6.0cm×杯高13 cm，每杯裝約500 g滅菌河沙），置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)（25 ℃，光照14 h、黑暗10 h，濕度為60%~70%，光強度為4 000 lx）。實驗分接種處理（接種產(chǎn)ACC脫氨酶菌株）和對照（接種無菌LB液體）。待幼苗生長至14 d后進行接種和低溫脅迫。供試菌株先經(jīng)LB液體培養(yǎng)基于15 ℃、180 r/min培養(yǎng)36~48 h，調(diào)整培養(yǎng)液D600nm值為0.8（細胞濃度約1×1010CFU/mL）。細菌接種量為3 mL/杯，每種菌接種5杯。設置 25、18、12、8、4 ℃共 5個溫度梯度，不同溫度下脅迫處理48 h后，取樣通過試劑盒測定植株地上部莖、葉中主要抗氧化酶（SOD、CAT和POD）活性及MDA含量，以無水乙醇浸提取法測定葉綠素含量。實驗結(jié)束后收獲幼苗，每個塑料杯中隨機選取5株，采用卷尺測定株高；利用游標卡尺測量莖粗；采用根系掃描儀（LA2400 Scanner，Epson Expression 10000XL）掃描根系，得到總根長、根表面積、平均根直徑和根尖數(shù)等數(shù)據(jù)；分別將植株地上和地下部分裝入紙袋，于烘箱105 ℃殺青30 min后調(diào)至70 ℃烘干至恒重，用分析天平測定地上和地下部干重。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 25.0和Origin 2021軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和繪圖；通過One Way ANOVA和Dun‐can法進行方差分析和多重比較（α=0.05）。圖表數(shù)據(jù)為平均值±標準差。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)ACC脫氨酶菌株的篩選

根據(jù)ADF與DF培養(yǎng)基上菌落生長情況，從821株供試菌株中初篩得到19株產(chǎn)ACC脫氨酶菌株（圖1）。通過定量分析菌株ACC脫氨酶活性，并按照Pen‐rose和Glick的建議，以ACC脫氨酶活性不低于20 nmol/（mg·h）作為活性菌株篩選標準，最終得到11株酶活性較高的菌株（表2）。其中TZnG2菌株的酶活性最高，達 3.42±0.12 μmol/（mg·h），但酶活性大于1 μmol/（mg·h）的菌株僅有 4株。

圖1 ACC脫氨酶活性菌株定性篩選Fig.1 Qualitative screening of ACC deaminaseproducing strains

2.2 產(chǎn)ACC脫氨酶菌株系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)16S rRNA基因測序和系統(tǒng)發(fā)育分析，11株產(chǎn)ACC脫氨酶菌株分別屬于歐文氏菌屬（Erwinia）、假單 胞 菌 屬（Pseudomonas）、黃 桿 菌 屬（Flavobacte?rium）、不動桿菌屬（Acinetobacter）和貪噬菌屬（Var?iovorax）5個不同細菌屬（表2，圖2），其中以歐文氏菌屬（4株）占比最多，占總菌數(shù)的36.36%；假單胞菌屬3株，占27.27%；黃桿菌屬2株，占18.18%；不動桿菌屬和貪噬菌屬各1株，分別占9.09%。

圖2 產(chǎn)ACC脫氨酶菌株系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of ACC deaminase-producing strains

表2 11株產(chǎn)ACC脫氨酶菌株的酶活性與分類地位Table 2 Enzyme activity and classification status of 11 ACC deaminase-producing strains

2.3 接種產(chǎn)ACC脫氨酶菌株對低溫脅迫下垂穗披堿草生長的影響

選取 ACC 脫氨酶活性大于 1 μmol/（mg?h）的 4株菌（TZnG2、MYnI4、MYnD11和TZnFn7）接種垂穗披堿草幼苗，結(jié)果表明，它們對垂穗披堿草生長和生物量積累均有積極影響（表3）。相比對照組，接菌處理顯著促進了株高、莖粗、地上干重和地下干重的增長。其中以MYnI4對株高促生作用最大，相比對照增加了22.96%。對莖粗、地上和地下干重促進作用最突出的均為菌株TZnG2，分別增長了29.09%、126.38%和186.67%。除接種菌株TZnFn7外，其他菌株均對根系發(fā)育有明顯促進作用，尤以MYnI4作用最明顯（表4）。但接種菌株TZnFn7減少了根尖數(shù)量，具體原因尚不明確。

表3 低溫脅迫下接種產(chǎn)ACC脫氨酶菌株垂穗披堿草的生長狀況Table 3 Growth states of E.nutans inoculated with ACC deaminase-producing strains under low temperature stress

表4 低溫脅迫下接種產(chǎn)ACC脫氨酶菌株垂穗披堿草的根系發(fā)育狀況Table 4 Root growth states of E.nutans inoculated with ACC deaminase-producing strains under low temperature stress

2.4 接種產(chǎn)ACC脫氨酶菌株對低溫脅迫下垂穗披堿草植株葉綠素含量的影響

隨溫度降低，對照組植株葉片葉綠素a含量逐漸減少（圖3‐A），相比25 ℃處理，4 ℃時下降了30.27%。但接種產(chǎn)ACC脫氨酶菌株后，葉綠素a呈現(xiàn)出隨溫度下降呈先降低后升高的趨勢，且變化幅度變小。比較之下，接種TZnFn7效果最顯著，相比25 ℃，葉綠素a含量在4 ℃僅下降了2.08%。

與葉綠素a含量變化趨勢相似，伴隨溫度降低，對照組葉綠素b含量顯著減少（圖3‐B）。葉綠素b含量在4℃時相比25 ℃下降了47.82%。但接種TZnFn7后葉綠素b含量表現(xiàn)出先降低后升高趨勢，其中在12℃時含量最低，僅為25 ℃時的84.55%，隨后逐漸升高，4 ℃時的葉綠素b含量達到25 ℃時的93.79%。其它接種處理呈現(xiàn)出與對照相似的規(guī)律，葉綠素b含量隨溫度降低而下降，但總體下降趨勢減緩。

隨溫度降低，對照組類胡蘿卜素含量呈逐漸下降趨勢，相比25 ℃，在4 ℃時下降了18.65%。但接種菌株TZnFn7和MYnI4后表現(xiàn)出先下降后升高趨勢，在4 ℃時，類胡蘿卜素含量分別為25 ℃時的96.64%和105.01%（圖3‐C）。接種 TZnG2和MYnD11后植株類胡蘿卜素含量變化規(guī)律與對照相似，但相比對照下降趨勢平緩。

圖3 低溫脅迫下接種產(chǎn)ACC脫氨酶菌株垂穗披堿的草葉綠素含量Figure 3 Chlorophyll content of E.nutans inoculated with ACC deaminase-producing strains under low temperature stress

2.5 接種產(chǎn)ACC脫氨酶菌株對低溫脅迫下垂穗披堿草抗氧化酶活性的影響

2.5.1 對低溫脅迫下植株SOD的影響 SOD是植物體內(nèi)極為重要的抗氧化酶，隨著溫度降低，各處理植株莖葉中SOD酶活性均呈現(xiàn)出逐漸升高趨勢（圖4‐A）。但接種菌株處理后，SOD酶活性表現(xiàn)出一定規(guī)律的波動變化。接種TZnG2和TZnFn7后在25 ℃到12 ℃時SOD酶活性逐步升高，但在8 ℃時降低，4 ℃時又再次升高。而接種MYnD11和MYnI4在18 ℃時酶活性最低，后隨溫度降低而逐步升高。

2.5.2 對低溫脅迫下植株POD的影響 隨著溫度降低，無論對照還是接種處理，POD活性總體呈現(xiàn)出先升高后降低再上升的趨勢（圖4‐B）。接種TZnG2后在8 ℃時POD活性達到最高值，相比25 ℃時提高了42.98%。接 種 TZnFn7、MYnD11和 MYnI4后在25 ℃到12℃時POD活性逐漸升高，8 ℃時下降，而在4 ℃時又升高且達到最高值，相比25 ℃分別提高了9.48%、74.27%和42.55%。相比之下，對照組變化幅度更大，POD活性在12 ℃時最低，相比25 ℃時下降了21.97%，8 ℃時最高，相比25 ℃時提高了35.93%。

2.5.3 對低溫脅迫下植株內(nèi)CAT的影響 隨溫度降低，接種菌株與對照植株莖葉中CAT活性均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，且波動幅度均不大（圖4‐C）。除接種菌株MYnI4在8 ℃時酶活力變化較大外，其余菌株與對照在各溫度下均無顯著差異。

2.5.4 對低溫脅迫下植株內(nèi)MDA含量的影響MDA是植物細胞膜脂過氧化的分解產(chǎn)物，其含量變化可反映植物遭受逆境損傷的程度。隨著溫度降低，接種菌株和對照植株莖葉中MDA含量均呈上升趨勢（圖4‐D）。相比而言，對照植株內(nèi)MDA積累更快，除12 ℃外，其他溫度下接種菌株與對照之間無顯著差異。

圖4 低溫脅迫下接種產(chǎn)ACC脫氨酶菌株垂穗披堿草植株的抗氧化酶活性Fig.4 Antioxidant enzyme activity of Elymus nutans inoculated with ACC deaminase-producing strains under low temperature stress

3 討論

乙烯是一種重要的植物內(nèi)源激素，能作為信息分子在植物細胞之間傳遞進而實現(xiàn)對植物生長發(fā)育的調(diào)節(jié)。當植物遭受高溫、冷害、鹽堿等逆境脅迫時會增強細胞內(nèi)ACC合成酶活性，導致產(chǎn)生大量乙烯進而對植物生長不利。產(chǎn)ACC脫氨酶的PGPB能降解植物乙烯合成的直接前體ACC而賦予植物對鹽堿脅迫［1，2，11］、冷脅迫［14］及干旱脅迫［15］等多種逆境的耐受性，被認為是提高植物抗逆性的有效途徑。

Li等［16］將陰溝腸桿菌Enterobacter cloacaeUW4中的ACC脫氨酶基因（acdS）導入大腸桿菌（Esch?erichia coli）、巴西固氮螺菌（Azospirillumbrasilense）及惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）等細菌中，發(fā)現(xiàn)陽性轉(zhuǎn)化菌株都能促進油菜幼苗根的生長。而失去ACC脫氨酶基因的負突變株也同時失去促生能力，說明產(chǎn)ACC脫氨酶是PGPB促進植物生長的關鍵機制之一。Onofre-Lemus等［17］研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)ACC脫氨酶是伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）的普遍特征，能調(diào)節(jié)番茄乙烯水平并促進其生長。本研究將產(chǎn)ACC脫氨酶菌株接種低溫脅迫下的垂穗披堿草幼苗獲得了相似結(jié)果，進一步驗證產(chǎn)ACC脫氨酶菌株能有效減緩低溫對垂穗披堿草幼苗的損害，增強其抵御低溫脅迫能力，發(fā)揮促生作用。

優(yōu)良菌種是研制功能性生物菌肥的基礎。目前，篩選產(chǎn)ACC脫氨酶菌株的方法主要有定向富集法［12］，即以ACC為唯一氮源配制培養(yǎng)基進行篩選與培養(yǎng)；或針對編碼ACC脫氨酶基因的acdS基因設計特異性引物，借助PCR手段進行篩選。相比之下，傳統(tǒng)的定向富集法耗時較長，工作量巨大而效率低；PCR法快捷、靈敏、高效，但依賴于特異性高的引物設計和PCR反應條件。因此，兩種方法各有利弊，需根據(jù)實際操作選擇應用。

低溫是影響植物生長和限制其地理分布的重要脅迫因素，它能通過破壞植物細胞結(jié)構和引起生理生化代謝紊亂而對植物產(chǎn)生傷害［18］。冷脅迫下，植物細胞葉綠素合成受阻，細胞膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛大量積累，活性氧增多而使細胞膜系統(tǒng)功能喪失和結(jié)構改變，為消除活性氧，細胞內(nèi)抗氧化酶（如SOD、POD、CAT等）活性迅速升高［19］。因此，MDA含量變化及抗氧化防御酶活性是低溫脅迫下植物應激反應的重要監(jiān)測指標。研究表明，分泌ACC脫氨酶的PGPB能通過誘導植物細胞抗氧化酶活性進而提升抗逆能力［20］。Singh將 ACC 脫氨酶菌株Stenotrophomonas maltophiliaSBP‐9接種小麥，發(fā)現(xiàn)其能提高小麥應對非生物脅迫的能力，促進其在逆境下的生長［21］。Habib等［22］將 產(chǎn) ACC 脫 氨 酶 菌 株Enterobactersp.UPMR18接種秋葵，可以提高幼苗在高鹽脅迫下的發(fā)芽率、生長參數(shù)和葉綠素含量，而且秋葵植株內(nèi)抗氧化酶（SOD、APX和CAT）活性也有效提高。

何敏等［23］從青藏高原北部退化草原的土壤中分離到的短桿菌屬Brevibacteriumsp.TS22和蕈狀芽孢桿菌Bacillus mycoidesTS27具有較高ACC脫氨酶活性，在10 ℃環(huán)境下接種早熟禾和老芒麥實驗表明，它們能有效促進株高、根長、地上和地下部干重的增長，但促生效果因植物和菌種的不同而有所不同。Tara等［24］從蘆薈根際分離得到1株具有多種促生屬性的耐冷短桿菌Brevibacterium frigoritoleransSMA23，在10 ℃低溫下對小麥生長有積極影響。李玫等［25］在低溫脅迫下對海欖雌幼苗進行接種PGPB試驗，結(jié)果表明接種PGPB能有效增強海欖雌幼苗抗寒能力并促進其生長，且PGPB的混合接種比單一接種效果更佳。劉維紅等［14］采用定向富集法從不同蔬菜根際篩選到多株ACC脫氨酶活性菌株，選取活性最高的LA1、XG32和YC1接種番茄幼苗，發(fā)現(xiàn)3株菌能明顯緩解低溫脅迫對番茄初生苗的傷害，促進其生長，且澆菌液接菌促生效果優(yōu)于浸種接菌。因此，土壤中產(chǎn)ACC脫氨酶菌株的開發(fā)應用是提升植物抗逆性的有效策略，對鹽堿地的高效應用以及增強植物應對生物或非生物脅迫有重要意義。

4 結(jié)論

從祁連山高寒草地的821株細菌中篩選得到11株有ACC脫氨酶活性的菌株，被區(qū)分為5個不同菌屬，其中有 4株酶活性大于 1 μmol/（mg·h），具有進一步開發(fā)應用價值。接種產(chǎn)ACC脫氨酶菌株能有效減緩低溫脅迫下垂穗披堿草葉綠素含量下降，提高SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性，促進植物生長。