宏基因組高通量測序檢測自體造血干細(xì)胞移植后感染嗜肺軍團(tuán)菌1 例及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)

趙海濤 王瑞芳 鄭永青 孫明東

嗜肺軍團(tuán)菌是軍團(tuán)菌病的主要病原體，大多為社區(qū)獲得性感染，該菌培養(yǎng)條件苛刻，培養(yǎng)時間長、陽性率低，是一種常見的誤診病原體，特別是應(yīng)用免疫抑制劑及免疫力低下的患者，易導(dǎo)致重癥肺炎，甚至死亡，因此及時準(zhǔn)確的診療具有重要意義。宏基因組高通量測序（mNGS）技術(shù)具有無偏移性、廣覆蓋、高效率、陰性預(yù)測價值高等理論優(yōu)勢，對混合感染、罕見病原體和苛養(yǎng)病原體的鑒定優(yōu)勢較大，為臨床診療提供了有力保障。

病例介紹：男，26 歲，既往體??；2020-07-04 因“乏力2 周，活動后明顯”入院，無心慌、胸悶等不適；查體：神志清、精神可，貧血貌，面色蒼白，眼瞼結(jié)膜蒼白，多處淺表淋巴結(jié)腫大，活動可，無壓痛。心肺聽診（-），腹軟，無壓痛及反跳痛，肝脾肋下未及；輔助檢查：2020-07-04 血常規(guī):WBC 6.66×109/L，HGB 61.00g/L，PLT 138.00×109/L；2020-07-05 外周血幼稚粒細(xì)胞易見；EB-DNA 4.02E+02（Copies/ml）、CMV-DNA（-）；CD55、CD59 均為陰性；胸腹部CT示：頸部、鎖骨上下區(qū)、縱隔、椎旁、腹膜后、右側(cè)腹股溝區(qū)多發(fā)腫大淋巴結(jié)，脾大，提示淋巴瘤；病理學(xué)檢查（左頸部淋巴結(jié)）提示可見淋巴組織增生性病變，結(jié)合免疫表型：CD15（-）、CD30（+）、PAX-5（+）、CD3（+）、CD20（散在陽性）、CD21（提示濾泡樹突網(wǎng)破壞）、BCL-6（-）、MUM-1（+）、Ki-67 增殖指數(shù)約20%；考慮為經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤（結(jié)節(jié)硬化型）；原位雜交：EBER1/2-ISH（大細(xì)胞+）；骨髓細(xì)胞學(xué)檢查提示：增生活躍骨髓象，細(xì)胞形態(tài)未見明顯異常；骨髓流式免疫學(xué)送檢標(biāo)本流式分析未檢測到明顯的急性白血病、NHL 和高危MDS 相關(guān)免疫表型改變；染色體：46，XY；診斷為：經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤（結(jié)節(jié)硬化型 Ⅳ期A 組 EBER+）；先后給予一線治療：ABVD 方案行2 個療程，2020-09-21 行CT 提示PR，繼續(xù)行ABVD 方案化療2 療程，2021-10-30 行PET-CT 評估療效為：Deauvile 4 分；CT 提示病灶仍為PR；考慮屬于難治性淋巴瘤，二線治療：PD-1 單抗+ICE（異環(huán)磷酰胺+卡鉑+依托泊苷）方案化療2 療程（2020-12-03～2021-02-16），行胸腹部CT 檢查提示疾病明顯改善，但肺部出現(xiàn)結(jié)節(jié)，繼續(xù)完成2 個療程方案化療，行PET-CT 提示完全代謝緩解（CR），CT 提示未見殘留病灶。根據(jù)2020版中國淋巴瘤專家共識及2020 版NCCN 指南推薦，屬于難治性淋巴瘤，建議血自體外周造血干細(xì)胞移植，暫未同意；于2021-04-12 復(fù)查胸部CT 提示：右肺片狀陰影，考慮不排除真菌感染（圖1），給予頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉+卡泊芬凈抗感染治療，鑒于嚴(yán)重的骨髓抑制及肺部感染先后2 次行PD-1 單藥維持治療；治療后復(fù)查胸部CT 提示：右肺下葉結(jié)節(jié)消失；并再次建議自體外周血造血干細(xì)胞移植；于2021-07-21 給予HD-CTX+G-CSF，并行外周血干細(xì)胞CD34+1.96×106/kg 采集基本成功；2021-08-05 給予完善PET-CT 檢查，提示CR。于2021-09-13 復(fù)查胸部CT 提示右肺片狀陰影較前明顯消退（圖2）；充分評估病情，完善移植前評估，無移植禁忌證，完成移植前卡氏肺囊腫、寄生蟲等的預(yù)防。于2021-09-22 開始給予標(biāo)準(zhǔn)BEAM 方案為預(yù)處理方案；鑒于既往真菌感染病史，給予口服泊沙康唑口服液 5ml tid 預(yù)防真菌感染。于2021-09-30 開始輸注外周血造血干細(xì)胞：CD34+1.96×106/kg；輸注后第5d，大便偏稀，不成形，略有低熱，體溫37.9℃，無咳嗽、咳痰，無心慌、胸悶等不適癥狀，查體：雙肺聽診未聞及明顯干濕性啰音，心率80～90次/min，心律齊，未聞及雜音；輔助檢查：血常規(guī)示：WBC 0.04×109/L、HGB 117g/L、PLT 290.04×109/L；降鈣素原：0.104ng/ml；G-脂多糖：＜5pg/ml；半乳甘露聚糖（galactomannan，GM）試驗：0.184μg/L 并留取血培養(yǎng)；根據(jù)2020 版中國中性粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱患者抗菌藥物臨床應(yīng)用指南提示患者屬于高危組，給予美羅培南，并輔以退熱抗感染治療，患者體溫一過性好轉(zhuǎn)，于第10d 患者出現(xiàn)再次發(fā)熱，最高體溫38.3℃，伴有咳嗽，無畏寒，聽診雙肺下葉可聞及濕性啰音，左肺明顯，心率90～100 次/min，血常規(guī)示：WBC 0.67×109/L、HGB 92g/L、PLT 29×109/L，提示白細(xì)胞開始植入，患者行美羅培南抗感染療效差，不排除球菌感染可能，給予萬古霉素1.0g q12h抗感染治療，并輔以退熱治療，于2021-10-11（第11d），復(fù)查血常規(guī)提示：WBC 2.00×109/L、HGB 94g/L、PLT 19×109/L；CRP 248.77mg/L；血清淀粉樣蛋白A（SAA）：300.00mg/L；降鈣素原：0.159ng/ml；EB 病毒陰性、巨細(xì)胞病毒陰性；第12d 復(fù)查血常規(guī)示：WBC 3.29×109/L、HGB 104g/L、PLT 21×109/L；提示中性粒細(xì)胞植活，脫離粒細(xì)胞缺乏，仍有反復(fù)高熱不退，行胸部CT 提示：右肺下葉大片炎性占位，左側(cè)為著（圖3）。先后2 次行血培養(yǎng)、痰培養(yǎng)均為陰性，鑒于患者既往真菌感染病史，不排除真菌感染加重、卡氏肺囊腫及耐碳青霉烯類感染可能，停美羅培南、萬古霉素抗感染治療后調(diào)整為替加環(huán)素聯(lián)合頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉抗感染治療，給予伏立康唑聯(lián)合卡泊芬凈抗感染治療；于第14d 查血常規(guī)示：WBC 4.23×109/L、HGB 96g/L、PLT 34×109/L；CRP 289.85mg/L；SAA 300.00mg/L；降鈣素原：8.35ng/ml；痰檢陰性；復(fù)查胸部CT 提示：雙肺炎癥較前明顯進(jìn)展，行抗感染治療后，體溫較前略有降低，但降鈣素原嚴(yán)重偏高，第18d（2021-10-18）行血常規(guī)示：WBC 3.15×109/L、HGB 81g/L、PLT 36×109/L；（1-3）-β-D 葡聚糖：＜10 pg/ml；GM 試驗：0.385μg/L，CRP 238.85mg/L；SAA 189.41mg/L，降鈣素原1.460 ng/ml；EB 病毒1.17E+02、巨細(xì)胞病毒陰性;痰檢陰性；血培養(yǎng)陰性；降鈣素原明顯降低，但患者仍有反復(fù)發(fā)熱，伴有喘憋，鼻導(dǎo)管吸氧，心率120～130次/min，輕微活動即感胸悶不適，積極聯(lián)系呼吸科行肺泡灌洗聯(lián)合NGS 檢查明確病原菌；于第19d（2021-10-19）患者行胸部CT 提示肺炎進(jìn)展（圖4），肺泡灌洗及NGS 檢測，支氣管鏡下圖像提示：支氣管、氣管可見散在出血點(diǎn)，伴有粘液痰栓（圖5）；第23d NGS 提示：嗜肺軍團(tuán)菌；調(diào)整治療方案為左氧氟沙星0.6g qd，聯(lián)合伏立康唑、舒普深抗感染治療，癥狀明顯改善；于2021-11-18 出院；鑒于患者自體造血干細(xì)胞移植后免疫重建約3 個月，出院后繼續(xù)口服左氧氟沙星片鞏固治療，于2021-12-01門診隨診胸部CT 提示雙肺炎癥明顯改善（圖6），目前患者仍處于隨訪觀察中。

圖1 右肺下葉結(jié)節(jié)性占位（2021-04-12）

圖2 右肺下葉結(jié)節(jié)性病灶較前明顯消退（2021-09-13）

圖3 患者左肺下葉團(tuán)塊樣占位（2021-10-12）

圖4 患者肺部感染明顯加重，右下肺占位增大，并出現(xiàn)左側(cè)肺部炎癥感染（2021-10-19）

圖5 支氣管內(nèi)可見散在出血點(diǎn)，伴有絲狀粘液栓

圖6 雙肺炎癥明顯好轉(zhuǎn)，左肺下葉仍可見實變，伴有空洞（2021-12-01）

討論軍團(tuán)菌是一種需氧、革蘭氏陰性、寄生于人體單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)的機(jī)會性致病菌，大致分為嗜肺軍團(tuán)菌和非嗜肺軍團(tuán)菌，往往導(dǎo)致重癥肺炎，特別是免疫力低下的患者，90%以上的致病菌是由嗜肺軍團(tuán)菌引起的，主要分Lp1、Lp4 和Lp6等3 個血清群，Lp1 導(dǎo)致50%～80%的軍團(tuán)菌病。軍團(tuán)菌廣泛存在于自然環(huán)境中，包括水源和土壤等，水源是軍團(tuán)菌的主要感染源，包括飲用水供水系統(tǒng)、人工氣溶膠的冷卻塔等，人類主要通過吸入霧化氣溶膠的含菌飛沫或飲用含菌水源而得病，人體主要通過體液免疫及細(xì)胞免疫對抗軍團(tuán)菌，其中細(xì)胞免疫起主導(dǎo)作用，當(dāng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫受損的患者（例如移植受者）更易感染軍團(tuán)菌；在一項長達(dá)13年的回顧性研究中分析了49 例伴嗜肺軍團(tuán)菌肺炎腫瘤患者，其中82%為血液腫瘤患者，37%為接受骨髓移植的患者[1]。本研究中該患者屬于難治性霍奇金淋巴瘤，根據(jù)2020 年NCCN 指南[2]及中國霍奇金淋巴瘤專家CSCO 共識具有行自體外周血造血干細(xì)胞移植治療指征，行自體造血干細(xì)胞移植治療后患者三系嚴(yán)重低下，粒細(xì)胞缺乏，伴有腹部不適，大便偏稀，發(fā)熱，根據(jù)2020 版中國中性粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱患者抗菌藥物臨床應(yīng)用指南提示屬于高危組，具有碳青霉烯類抗生素抗感染治療指征，同時既往具有肺部真菌感染病史，給予泊沙康唑預(yù)防真菌治療，治療過程中略有好轉(zhuǎn)后體溫再次反復(fù)高熱，聯(lián)合萬古霉素抗感染治療，療效欠佳，且病情未見好轉(zhuǎn)，降鈣素原8.35ng/ml，多次咽拭子、痰培養(yǎng)、血培養(yǎng)均為陰性，不排除耐碳青霉烯類病原菌可能，給予調(diào)整抗生素為替加環(huán)素聯(lián)合頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉抗感染治療，復(fù)查炎癥指標(biāo)，降鈣素原較前明顯改善，但患者癥狀未見明顯好轉(zhuǎn)，考慮疾病及影像學(xué)的滯后性，為進(jìn)一步明確診斷，聯(lián)系呼吸科行肺泡灌洗聯(lián)合NGS 檢測，肺泡灌洗培養(yǎng)提示陰性，NGS提示嗜肺軍團(tuán)菌，參考2016 中國社區(qū)獲得性肺炎抗感染治療指南[3]，喹諾酮類或大環(huán)內(nèi)酯類藥物被認(rèn)為是軍團(tuán)菌肺炎患者的一線治療選擇，對于危重或免疫功能低下的患者推薦聯(lián)合治療[4]?；颊呓?jīng)喹諾酮類藥物抗感染治療后，癥狀明顯改善。

軍團(tuán)菌病是一種非典型性肺炎，具有非特異性的影像學(xué)和臨床表現(xiàn)，除引起肺部感染外，直接或間接影響多個器官的系統(tǒng)性感染，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、肝、胃腸道和腎臟等，臨床診斷金標(biāo)準(zhǔn)仍是分離得到軍團(tuán)菌，因為軍團(tuán)菌在細(xì)胞內(nèi)寄生，營養(yǎng)要求較高，培養(yǎng)周期較長，陽性培養(yǎng)率僅為5%[5]，容易產(chǎn)生假陰性結(jié)果；目前軍團(tuán)菌的診斷幾乎完全依賴于尿抗原檢測，尿抗原檢測特異性較高，但僅能檢測嗜肺軍團(tuán)菌Lp1 型，且在專門的實驗室亦有30%假陰性率；同時為非Lp1 菌株引起的軍團(tuán)菌病創(chuàng)造了一個診斷性的“盲點(diǎn)”，存在漏檢的可能，仍需與其他檢測方法聯(lián)合檢驗；其次為血清學(xué)檢查，特異性抗體檢測操作簡便，特異性強(qiáng)，但血清學(xué)抗體增加大約需要2～4 周，且移植后患者免疫力低下，常在感染軍團(tuán)菌時早期難以產(chǎn)生足夠抗體可供檢測，在免疫缺陷患者的檢測中具有局限性[6]。本例患者移植后出現(xiàn)嚴(yán)重感染，多次血培養(yǎng)、痰及肺泡灌洗液培養(yǎng)均為陰性，進(jìn)一步從側(cè)面證實了傳統(tǒng)常規(guī)培養(yǎng)、檢測方法診斷軍團(tuán)菌的局限性；Cunha 等認(rèn)為可通過臨床表現(xiàn)，如體溫＞38.9℃伴相對心動過緩，低鈉、低磷血癥，鐵蛋白水平升高，肌酐磷酸激酶升高、顯微鏡下血尿等是特征性的臨床表現(xiàn)來判斷，每項賦值1 分，大于3 分診斷的可能性大，特征性表現(xiàn)越多，越具有診斷意義[7]。本例患者除了低鈉血癥外，未見典型的臨床表現(xiàn)，臨床診斷亦存在局限性；其他的檢測方法包括聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、免疫熒光探針、二代測序等。Erat 等[8]報道1 例重型地中海貧血異基因造血干細(xì)胞移植患者院內(nèi)獲得性軍團(tuán)菌感染，在供水系統(tǒng)中通過PCR 檢測到嗜肺軍團(tuán)菌，血清型為2-14，但PCR 檢測針對性強(qiáng)，目前在國內(nèi)大多數(shù)醫(yī)院還沒有開展。mNGS 技術(shù)具有無偏移性、廣覆蓋、高效率、陰性預(yù)測價值高等理論優(yōu)勢，對混合感染、罕見病原體和苛養(yǎng)病原體的鑒定優(yōu)勢較大，目前越來越多的報道均通過mNGS得到證實[9～11]；本例患者通過肺泡灌洗液檢測到嗜肺軍團(tuán)菌感染，未見其他菌群，給予左氧氟沙星抗感染治療后，患者癥狀明顯改善，為臨床診療提供了有力保障。

目前，血液惡性腫瘤患者仍需化療、聯(lián)合分子靶向治療，甚至移植才能治愈，常導(dǎo)致嚴(yán)重骨髓抑制、機(jī)體免疫力低下或應(yīng)用免疫抑制劑抑制急慢性GVHD 等，易導(dǎo)致細(xì)胞免疫及體液免疫功能不全，繼發(fā)嚴(yán)重感染，對于混合感染、罕見病原體及苛養(yǎng)菌診斷仍具有挑戰(zhàn)性，mNGS 技術(shù)是常規(guī)檢測方法的有益補(bǔ)充，但mNGS 技術(shù)成熟應(yīng)用于臨床尚有許多問題需要解決，如價格貴、分析方法缺乏規(guī)范性及標(biāo)準(zhǔn)化，如何質(zhì)控管理、剔除人類基因組干擾、背景雜菌污染等，有待于逐步解決這些問題后更好地應(yīng)用于臨床。