右美托咪定對(duì)大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷的影響

陳湘姣，楊 豪，梁 輝

（湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院/湖南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙 410000）

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是常見的腦血管疾病之一，是多種病因所致腦底部或腦及脊髓表面血管破裂，血液直流入蛛網(wǎng)膜下腔的急性出血性腦血管病，其不同于腦實(shí)質(zhì)出血直接破入或經(jīng)腦室進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔引起的繼發(fā)出血，占所有腦血管疾病的5%～10%[1]，具有較高的預(yù)后不良和死亡風(fēng)險(xiǎn)[2]。既往研究認(rèn)為[3，4]，腦血管痙攣是導(dǎo)致SAH 預(yù)后不良的主要原因，而近年關(guān)于干預(yù)腦血管痙攣的研究發(fā)現(xiàn)其并不能明顯改善SAH 患者預(yù)后，并認(rèn)為引起SAH 預(yù)后不良的一個(gè)重要原因可能為SAH 后早期腦損傷。右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）具有較高的選擇性，可選擇性作用于腦干藍(lán)斑及脊髓的α2A 受體激動(dòng)劑，發(fā)揮鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜的作用，同時(shí)其還具有神經(jīng)保護(hù)作用[5，6]。本研究主要探討DEX 在SAH 早期腦損傷中的作用及其可能的作用機(jī)制，以期為SAH 的治療方案提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 健康雄性SD 大鼠，體重280～320 g，購買于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[生產(chǎn)許可證：SCXK（湘）2019-0004]。右美托咪定購買于aladdin 公司，3-MA 購買于APExBIO 公司，伊文思藍(lán)染色液、戊二醛固定液購買于Abiowell 公司，Tunel 試劑盒購買于上海翊圣生物公司，Beclin-1、LC3B、β-actin 試劑盒購買于美國proteintech 公司。本實(shí)驗(yàn)獲湖南省人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，審批號(hào)：2021 第24 號(hào)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及模型制備 將48 只SD 大鼠隨機(jī)分為4 組：Sham 組、SAH 組、SAH+DEX 組、SAH+3-MA 組，每組各12 只；各組再分為SAH 后24 h 和SAH 后72 h 兩個(gè)亞組，每組6 只。參照孟晗等[7]視交叉前池注血法制備大鼠SAH 模型。按照0.4 ml/100 g的劑量抽取10%的水合氯醛溶液進(jìn)行麻醉。取俯臥位，消毒備皮后于頭頂正中部行縱行切口，充分暴露冠狀縫、矢狀縫，在Bregma 點(diǎn)前7.5 mm 偏左1 mm鉆取一直徑為1 mm 的孔，注入大鼠自體尾靜脈血0.3 ml 于視交叉前池內(nèi)，封閉鉆孔，再次消毒后縫合創(chuàng)口。Sham 組向視交叉前池內(nèi)注射同等劑量的生理鹽水。

1.3 神經(jīng)功能評(píng)分 于造模后24、72 h，參照Garcia JH等[8]的方法對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，評(píng)分包括籠內(nèi)自發(fā)活動(dòng)（在籠內(nèi)觀察5 min）、四肢活動(dòng)的對(duì)稱性、前肢伸展運(yùn)動(dòng)情況、攀爬能力及持抓力度、觸碰身體反應(yīng)、觸碰胡須反應(yīng)共6 個(gè)方面，總分3～18 分，評(píng)分越高表明大鼠神經(jīng)功能受損越小。

1.4 干濕比重法測(cè)定腦含水量 于造模后24、72 h 將大鼠斷頭取腦，取大鼠左側(cè)大腦半球，稱濕重后置于110 ℃恒溫干燥箱中，持續(xù)烘干24 h，稱干重，并計(jì)算干濕比重[干濕比重=（濕重-干重）/濕重×100%]。

1.5 ELISA 法測(cè)定腦組織中伊文思藍(lán)溶液的含量于造模后23、71 h，將大鼠麻醉，經(jīng)股靜脈注射伊文思藍(lán)溶液，1 h 后取0.038 g 大鼠右側(cè)腦組織配置樣品溶液，配置標(biāo)準(zhǔn)溶液，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為630 nm處測(cè)量樣品溶液及標(biāo)準(zhǔn)溶液光密度（OD 值），繪制伊文思藍(lán)-標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算腦組織中伊文思藍(lán)的含量。

1.6 TUNEL 染色觀察細(xì)胞凋亡 于造模后24、72 h，將大鼠斷頭取腦，取大鼠右側(cè)腦組織，經(jīng)切片、蛋白酶K 工作液孵育、Equilibration Buffer 孵育、TdT 孵育、DAPI 工作液核染等過程制作制作切片，于熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞；在400 高倍鏡視野下，每個(gè)切片隨機(jī)選擇5 個(gè)不交叉的視野，計(jì)數(shù)腦細(xì)胞總的數(shù)及凋亡細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算腦細(xì)胞凋亡率（腦細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)目/細(xì)胞總的數(shù)目×100%）。

1.7 透射電子顯微鏡觀察自噬體 于大鼠造模后24 h，將大鼠斷頭取腦，取大鼠右側(cè)海馬組織，經(jīng)固定、脫水、浸透、包埋、聚合、切片、染色等過程制作切片，用透射電子顯微鏡觀察自噬體形態(tài)及數(shù)目。

1.8 Western bolt 檢測(cè)Beclin-1 和LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)水平 于大鼠造模24、72 h，將大鼠斷頭取腦，取0.025 g 大鼠右側(cè)腦組織進(jìn)行蛋白提取及蛋白定量，依次進(jìn)行制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗及二抗孵育、顯色/曝光，用quantity one 專業(yè)灰度分析軟件測(cè)量分析灰度值，以Beclin1 和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值代表蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)（Student’sttest）進(jìn)行組內(nèi)兩樣本間比較，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行多組間樣本比較，采用LSD 檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間樣本比較。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)功能評(píng)分比較 Sham 組無明顯神經(jīng)功能缺損癥狀，神經(jīng)功能評(píng)分均為18 分；SAH 組、SAH+DEX 組、SAH+3-MA 組造模后24、72 h 神經(jīng)功能評(píng)分均低于Sham 組（P＜0.05）；SAH+DEX 組、SAH+3-MA 組造模后24 h 神經(jīng)功能評(píng)分高于SAH組（P＜0.05），但SAH+DEX 組與SAH+3-MA 組造模后24、72 h 神經(jīng)功能評(píng)分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；SAH 組、SAH+DEX 組、SAH+3-MA 組造模后72 h 神經(jīng)功能評(píng)分高于造模后24 h（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較

2.2 各組腦含水量比較 SAH 組、SAH+DEX 組、SAH+3-MA 組大鼠造模后24、72 h 腦含水量均高于Sham 組（P＜0.05）；SAH 組造模后24、72 h 腦組織含水量高于SAH+DEX 組和SAH+3-MA 組（P＜0.05），但SAH+DEX 組與SAH+3-MA 組造模后24、72 h腦含水量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各組大鼠造模后24 h 與造模后72 h 腦組織含水量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 各組大鼠腦含水量比較

2.3 各組伊文思藍(lán)含量比較 SAH 組、SAH+DEX 組、SAH+3-MA 組造模后24、72 h 腦組織中EB 含量均高于Sham 組（P＜0.05）；SAH 組造模后24、72 h 腦組織EB 含量高于SAH+DEX 組和SAH+3-MA 組（P＜0.05），但SAH+DEX 組和SAH+3-MA 組大鼠造模后24、72 h 腦組織EB 含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各組造模后24 h 與造模后72 h 腦組織內(nèi)伊文思藍(lán)含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 各組大鼠腦內(nèi)伊文思藍(lán)含量比較

2.4 各組大鼠細(xì)胞凋亡率比較 SAH 組、SAH+DEX組、SAH+3-MA 組造模后24 h 腦細(xì)胞凋亡率高于Sham 組（P＜0.05）；SAH 組造模后24 h 腦細(xì)胞凋亡率高于SAH+DEX 組、SAH+3-MA 組（P＜0.05）；各組造模后72 h 腦細(xì)胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；SAH+DEX 組與SAH+3-MA 組造模后24、72 h 腦細(xì)胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1、圖4、圖5。

圖4 各組造模后24 h 大鼠TUNEL 熒光染色結(jié)果（×400）

圖5 各組造模后72 h 大鼠TUNEL 熒光染色結(jié)果（×400）

表1 各組大鼠細(xì)胞凋亡率比較（±s，%）

表1 各組大鼠細(xì)胞凋亡率比較（±s，%）

注：同一時(shí)間點(diǎn)與Sham 組比較，#P＜0.05；同一時(shí)間點(diǎn)與SAH 組比較，*P＜0.05；造模后24 h 與造模后72 h 各組組內(nèi)比較，□P＜0.05

2.5 各組SAH 大鼠右側(cè)海馬CA1 區(qū)透射電子顯微鏡下自噬體情況比較 透射電子顯微鏡下可見到大小不等的自噬空泡及自噬小體，其中Sham 組可見較多結(jié)構(gòu)較完整的細(xì)胞器，偶可見自噬體；SAH 組大鼠腦組織中自噬體數(shù)目多于Sham 組；SAH 組大鼠腦組織中有大量自噬體形成，并可見較多的線粒體腫脹、變性；SAH+DEX 組、SAH+3-MA 組自噬體數(shù)目較SAH 組明顯減少；SAH+DEX 組與SAH+3-MA 組大鼠腦組織中自噬體數(shù)量無明顯差異，見圖6。

圖6 各組SAH 大鼠右側(cè)海馬CA1 區(qū)透射電子顯微鏡下自噬體情況（×18 500）

2.6 各組Beclin-1 和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平比較SAH 組、SAH+DEX 組、SAH+3-MA 組造模后24、72 h Beclin-1 蛋白表達(dá)量高于Sham 組（P＜0.05）；SAH 組造模后24、72 h Beclin-1 和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量均高于SAH+DEX 組及SAH+3-MA 組（P＜0.05）；SAH組、SAH+3-MA 組造模后24、72 h LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量高于Sham 組（P＜0.05），但SAH+DEX 組和Sham組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；且SAH+DEX 組和SAH+3-MA 組造模后24、72 h Beclin-1 和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖7～圖9。

圖7 各組大鼠腦組織Beclin-1 和LC3 蛋白表達(dá)條帶

圖8 各組大鼠腦組織中Beclin-1 蛋白表達(dá)量比較

圖9 各組大鼠腦組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值比較

3 討論

目前認(rèn)為，SAH 后早期腦損傷程度與SAH 患者的預(yù)后有關(guān)，減輕SAH 后早期腦損傷，改善患者預(yù)后是臨床研究的重要方向。Fang Y 等[9]研究表明，自噬參與了SAH 后早期腦損傷。自噬是一種細(xì)胞自消化途徑，正常水平的自噬可以維持胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，并實(shí)現(xiàn)自身蛋白的循環(huán)再利用；而過度自噬則可能會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，導(dǎo)致組織損傷。Beclin-1 及LC3-Ⅱ是與自噬密切相關(guān)的兩種蛋白，其表達(dá)量的高低提示自噬水平的高低，是目前實(shí)驗(yàn)中用于評(píng)估自噬程度較為常用的指標(biāo)[10]。有研究發(fā)現(xiàn)[11，12]，在SAH 后早期，SAH 組大鼠Beclin-1 及LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，這表明在SAH 后早期即可激活自噬。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，SAH 組、SAH+DEX 組造模后24、72 h Beclin-1 蛋白表達(dá)量高于Sham 組（P＜0.05），提示大鼠SAH 后早期腦細(xì)胞自噬即被激活。透射電子顯微鏡（TEM）是一種直接觀察自噬體微細(xì)結(jié)構(gòu)的方法，是觀察自噬最直觀的辦法，被認(rèn)為是明確自噬最準(zhǔn)確的方法[13]。在電鏡下，自噬體可表現(xiàn)為雙?；蚨嗄そY(jié)構(gòu)包裹細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器、胞漿、蛋白質(zhì)等結(jié)構(gòu)的液泡狀結(jié)構(gòu)[14]。本研究中透射電鏡下觀察自噬發(fā)現(xiàn)，Sham 組海馬組織內(nèi)偶可見自噬體，SAH 組自噬小體數(shù)目明顯增加，并可見自噬溶酶體，這也表明SAH 可激活細(xì)胞自噬。

DEX 是一種選擇性高的α2A 受體激動(dòng)劑，可選擇性的作用于腦干的藍(lán)斑及脊髓α2A 受體，發(fā)揮鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用。DEX 具有產(chǎn)生類似正常睡眠鎮(zhèn)靜、容易配合臨床各種神經(jīng)功能評(píng)估檢查、基本不影響呼吸功能、對(duì)循環(huán)穩(wěn)定影響小等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于臨床鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及手術(shù)麻醉治療。研究表明，DEX 可通過抑制自噬發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。Luo C 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在大腦中動(dòng)脈栓塞缺血（tMCAO）小鼠模型中Beclin-1 和LC3-Ⅱ的表達(dá)高于對(duì)照組，且透射電鏡可見自噬體明顯增多，予以DEX 處理組較tMCAO組LC3-Ⅱ蛋白和Beclin-1 蛋白的表達(dá)明顯下降，電鏡下自噬體數(shù)目也明顯減少，腦梗死面積縮小，神經(jīng)功能評(píng)分好轉(zhuǎn)，這表明DEX 能抑制腦缺血后自噬，減少神經(jīng)損傷。Li H 等[6]研究也發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）大鼠腦組織中可檢測(cè)到Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ比值明顯增加，而予以DEX 處理后抑制Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高，進(jìn)而減少了腦組織損傷。以上研究均表明，DEX 可通過抑制自噬發(fā)揮腦保護(hù)作用。本研究中SAH 組造模后24、72 h Beclin-1 和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量均高于SAH+DEX組及SAH+3-MA 組（P＜0.05）；SAH 組、SAH+3-MA組造模后24、72 h LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量高于Sham 組（P＜0.05），但SAH+DEX 組和Sham 組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；且SAH+DEX 組和SAH+3-MA 組造模后24、72 h Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），電鏡結(jié)果也顯示SAH+DEX 組和SAH+3-MA組自噬體數(shù)目少于SAH 組，提示3-MA 抑制了SAH大鼠早期自噬的激活，且DEX 與3-MA 的作用效果一致，均抑制了自噬的形成。此外，SAH 組、SAH+DEX 組、SAH+3-MA 組造模后24、72 h 神經(jīng)功能評(píng)分均低于Sham 組（P＜0.05），表明在SAH 大鼠早期腦損傷過程中，DEX 可能通過抑制自噬的激活發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。但本研究中大鼠SAH 后72 h內(nèi)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1 和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升降趨勢(shì)不一致，因而對(duì)SAH 后72 h 內(nèi)自噬的動(dòng)態(tài)變化暫不能得出結(jié)論，需選取更多的時(shí)間觀察點(diǎn)進(jìn)一步研究。

當(dāng)組織細(xì)胞遭受損傷時(shí)，凋亡程序會(huì)被啟動(dòng)，將損傷細(xì)胞清除，而凋亡程序的過度激活將導(dǎo)致組織的損傷加重及疾病的發(fā)生[15]。有研究表明[16，17]，SAH后72 h 內(nèi)腦組織中凋亡細(xì)胞的表達(dá)較對(duì)照組相比明顯增多，并且研究發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞越多，大鼠神經(jīng)功能缺損越明顯，這提示SAH 后早期細(xì)胞凋亡即被激活，并且細(xì)胞凋亡程度越高，腦組織損傷越明顯。而DEX 被證明可以抑制細(xì)胞的凋亡。Xu D 等[18]將SHSY5Y 細(xì)胞經(jīng)葡萄糖剝奪/再給氧（OGD/R）處理后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比OGD/R 引起B(yǎng)cl2 表達(dá)下調(diào)，Bax和Caspase-3 裂解表達(dá)上調(diào)，TUNEL 染色發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞明顯增多，這表明OGD/R 處理可激活細(xì)胞凋亡；而予以DEX 處理后逆轉(zhuǎn)了OGD/R 導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。Huang GR 等[19]在創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）模型大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，TBI 組大鼠凋亡細(xì)胞較對(duì)照組明顯升高，而予以DEX 處理后可明顯減輕細(xì)胞的凋亡。Liu W 等[20]在腦缺血再灌注大鼠的研究中也有同樣的結(jié)果。本研究中SAH 組、SAH+DEX 組、SAH+3-MA 組造模后24 h 腦細(xì)胞凋亡率高于Sham 組（P＜0.05）；SAH 組造模后24 h 腦細(xì)胞凋亡率高于SAH+DEX 組、SAH+3-MA 組（P＜0.05），提示造模后24 h SAH 大鼠的細(xì)胞凋亡明顯升高，而予以DEX和3-MA 處理后細(xì)胞凋亡率顯著降低，與Yin D 等[21]研究結(jié)果類似，表明DEX 可減少SAH 后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，減輕腦組織的損傷。

血腦屏障是維持腦組織功能正常的一道非常重要的屏障。Gong P 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，SAH 大鼠較對(duì)照組大鼠中腦組織EB 含量明顯升高，ZO-1、claudin-3的表達(dá)明顯下降，神經(jīng)功能明顯受損，這提示SAH后可破壞血腦屏障功能，增加血腦屏障通透性，加重神經(jīng)損傷。Yin D 等[21]研究也發(fā)現(xiàn)，SAH 后大鼠與對(duì)照組大鼠相比，腦組織中EB 含量明顯升高，精密連接蛋白Claudin-5、Occludin、ZO-1 蛋白表達(dá)顯著降低，而予以DEX 處理后，大鼠腦組織中EB 含量顯著降低，Claudin-5、Occludin、ZO-1 蛋白表達(dá)顯著升高，提示右美托咪定可降低SAH 后血腦屏障通透性。本研究結(jié)果顯示，SAH 組、SAH+DEX 組、SAH+3-MA 組造模后24、72 h 腦組織中EB 含量均高于Sham 組（P＜0.05）；SAH 組造模后24、72 h 腦組織EB 含量高于SAH+DEX 組和SAH+3-MA 組（P＜0.05），提示SAH 后腦組織內(nèi)伊文思藍(lán)的含量和腦含水量明顯增多，而經(jīng)DEX 與3-MA 處理后大鼠腦組織內(nèi)伊文思藍(lán)含量及腦含水量降低，這表明DEX可降低血腦屏障的通透性，保護(hù)血腦屏障，減輕腦水腫，而這一作用可能與自噬抑制有關(guān)[23]。

綜上所述，DEX 可能通過抑制細(xì)胞自噬及凋亡和降低血腦屏障通透性以減輕大鼠SAH 后早期腦組織損傷程度，保護(hù)神經(jīng)功能。