碳酸酐酶靶向探針的研究進展

楊燕玲，葉德舉

（南京大學化學化工學院,生命分析化學國家重點實驗室,化學和生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究院,南京 210023）

碳酸酐酶（Carbonic anhydrases，CAs）是一類細胞中普遍存在的金屬酶，其主要包括5種細胞基質(zhì)形式（CA I，CA II，CA III，CA VII和CA XIII）、5種膜結合同工酶（CA IV，CA IX，CA XII，CA XIV和CA XV）、2種線粒體形式（CA VA和CA VB）和一種分泌的CA同工酶（CA VI）［1～7］.研究發(fā)現(xiàn)，CAs的活性主要是由活性口袋的氨基酸殘基與金屬Zn2+形成的配合物決定［8］.以人體中含量最豐富、研究最多的CA II為例［9］，其由260個氨基酸組成，是一種單結構域單體蛋白，具有混合α/β的球狀結構蛋白質(zhì)折疊形式［圖1（A）］.CA II中心由8個β股折疊組成，中心兩側(cè)為7個α螺旋結構.活性位點Zn2+與3個組氨酸殘基（H94，H96，H119）及1個羥基離子形成四面體配位.活性口袋主要由親水性氨基酸（Y7，N62，H64，N67，T199和T200）和疏水性氨基酸（V121，V143，L198，T199，V207和W209）兩種不同的環(huán)境組成.CA II調(diào)節(jié)pH的機理如圖1（B）所示，活性口袋中Zn2+所絡合的OH-親核進攻CO2產(chǎn)生HCO3-；由于HCO3-與Zn2+的結合力較弱，易被水分子取代，釋放出HCO3-，而與Zn2+絡合的水分子進一步被活化為高活性的OH-，從而恢復CAs對CO2的催化活性.

研究表明，CAs的活性與腫瘤的乏氧微環(huán)境密切相關.在多種類型的惡性腫瘤（如膠質(zhì)母細胞瘤［10］、結直腸癌［11］、乳腺癌［12］和腎癌［13］等）中，CAs的表達量會比正常組織細胞上調(diào)150～200倍［14］.在腫瘤細胞中，CAs通過催化CO2形成HCO3-的轉(zhuǎn)換過程，參與調(diào)節(jié)腫瘤組織的微酸性環(huán)境［15］.以CA IX為例，作為跨膜蛋白，可催化細胞膜外CO2轉(zhuǎn)化為HCO3-和H+，使CO2在細胞膜內(nèi)外垂直方向保持濃度梯度［圖1（C）］.這有利于CO2從胞內(nèi)擴散到胞外，從而產(chǎn)生偏酸性的細胞外環(huán)境（pHe=6.5～6.8）和中性的細胞內(nèi)環(huán)境（pHi=7.2～7.4）.此外，在細胞膜外產(chǎn)生的HCO3-被相鄰的HCO3-轉(zhuǎn)運蛋白（如NBCe1，NBCn1）重新轉(zhuǎn)運進入細胞，進而在細胞質(zhì)中與H+結合產(chǎn)生CO2，有助于降低細胞內(nèi)的H+濃度，維持細胞內(nèi)中性環(huán)境.

Fig.1 Crystal structure of human CA II[Ribbon cartoon representation of the crystal structure of CA II(PDB ID:3KS3),blue spheres:Zn2+ion](A),proposed mechanism of CA II-catalyzed conversion of CO2 to HCO3-(B)[9],cartoon illustration of the role of CAs in regulating extracellular(pHe)and intracellular pH(pHi)(C)[15]

鑒于CAs在腫瘤中的關鍵生物學功能，CAs已成為腫瘤診斷與治療的一類關鍵生物靶標.快速、準確地檢測CAs的活性對于腫瘤的早期診斷與及時治療具有重要意義.通過抑制CAs的活性，可以有效改善腫瘤的酸性微環(huán)境和乏氧環(huán)境，有助于產(chǎn)生對腫瘤的協(xié)同治療效果.近年來，針對CAs已構建了不同類型的分子探針，并成功應用于腫瘤的成像與治療.目前，已有一些針對CAs靶向探針或抑制劑的報道，但它們主要集中在介紹CAs的生物功能［16］、靶向CAs的單光子發(fā)射計算機斷層成像（Singlephoton emission computerized tomography，SPECT）或正電子發(fā)射斷層掃描成像（Positron emission tomography，PET）造影劑［17］、抑制CAs活性的小分子化合物［18，19］.CAs靶向熒光探針和診療探針的研究進展尚未見報道.因此，本綜述首先簡要介紹了CAs的結構、活性及生物學功能；然后，重點介紹了CAs靶向熒光探針的構建與腫瘤成像應用和CAs靶向分子探針的構建與腫瘤協(xié)同治療應用；最后，對靶向CAs的熒光探針和分子探針在腫瘤成像與治療應用中所面臨的挑戰(zhàn)和未來研究方向進行了展望.

1 CAs靶向熒光探針的構建與腫瘤成像應用

熒光成像技術由于具有操作簡便、靈敏度高等優(yōu)點，已被廣泛應用于細胞與生物活體內(nèi)各種生物標志物的成像分析.為了檢測CAs，構建了具有CAs特異性靶向的熒光探針，并成功應用于腫瘤細胞的高靈敏熒光成像.如2014年，Hamachi等［20］以羅丹明衍生物為熒光團，以CAs的抑制劑苯磺酰胺作為CAs的識別位點，通過引入可改善親疏水性質(zhì)的連接基團，構建了兩親性熒光探針1.探針1在水溶液中自組裝形成納米聚集體，使得羅丹明的熒光由于發(fā)生聚集誘導猝滅效應而降低.當聚集態(tài)與人乳腺癌MCF7細胞上高表達的CA II結合后，自組裝的聚集體發(fā)生解組裝，從而打開羅丹明的熒光信號［圖2（A）］.溶液實驗結果顯示，探針1與CA II孵育30 min后，可以在585 nm處產(chǎn)生約30倍的熒光信號增強［圖2（B）］.進一步的熒光成像實驗結果顯示，探針1與MCF7細胞孵育4 h后，在細胞質(zhì)和細胞核中均產(chǎn)生明亮的羅丹明的熒光信號；當加入CA II抑制劑（Ethoxazolamide，EZA）后，細胞中產(chǎn)生的熒光信號被顯著抑制［圖2（C）］，證實細胞中的羅丹明熒光是通過探針1中的磺酰胺官能團與CA II之間的特異性結合而產(chǎn)生的.基于細胞中點亮的熒光，他們進一步將探針1應用于活細胞上CA II抑制劑活性的快速篩選.2015年，Tan等［21］基于類似的分子自組裝與解組裝方法，構建了CA IX可激活的近紅外熒光探針，應用于乏氧環(huán)境中腫瘤細胞表面CA IX的檢測和腫瘤細胞的免洗熒光成像.

Fig.2 Chemical structure and schematic illustration of probe 1 for the detection of CA II(A),fluorescence spectra change of probe 1 upon addition of CA II(B),confocal laser scanning microscope(CLSM)images of MCF7 cells incubated with probe 1 in the absence or presence of EZA(C)[20],chemical structures of AZ-BPS and BPS(D),fluorescence imaging of MDA-MB-231 tumor-bearing nude mice after intravenous injection of AZ-BPS or BPS(left),ex vivo fluorescence imaging of main organs resected from MDA-MB-231 tumor-bearing mice in the left[i:tumor(yellow circle),ii:liver,iii:lung,iv:kidney,v:heart,vi:spleen,vii:testis](right)(E)[22]

為了在活體上檢測CAs的活性，Kim等［22］將CAs的抑制劑乙酰唑胺（Acetazolamide，AZ）與近紅外光敏劑（Boron-dipyrromethene，BODIPY）通過點擊化學方法共價鏈接，構建了可靶向CA IX的近紅外光敏探針AZ-BPS［圖2（D）］.借助AZ對CA IX高的親和力和抑制作用，AZ-BPS能高效結合人乳腺癌MDA-MB-231細胞上高表達的CA IX，產(chǎn)生明亮的近紅外熒光，從而點亮MDA-MB-231細胞.活體熒光成像結果顯示，與不含AZ的對照探針BPS相比，AZ-BPS通過尾靜脈注射到荷瘤小鼠體內(nèi)后，可以在MDA-MB-231腫瘤部位產(chǎn)生顯著增強的近紅外熒光信號.離體器官的熒光成像結果表明，AZ-BPS主要蓄積在腫瘤組織中，而在其它主要器官（如肝臟、腎臟等）攝取較少［圖2（E）］.由于BODIPY在近紅外光照射下能產(chǎn)生具有細胞毒性的單線態(tài)氧，進一步將AZ-BPS成功應用于CA IX靶向的腫瘤光動力治療（Photodynamic therapy，PDT）.

2 CAs靶向分子探針的構建與腫瘤協(xié)同治療應用

PDT具有無創(chuàng)、副作用小及時空可控等優(yōu)勢.PDT的療效與光敏劑在腫瘤細胞中產(chǎn)生活性氧物種（Reactive oxygen species，ROS）的能力密切相關，而腫瘤組織的乏氧微環(huán)境會限制ROS的生成，降低PDT的療效.為了克服腫瘤乏氧影響，2019年，Pu等［23］設計了一種有機光動力納米抑制劑（Organic photodynamic nanoinhibitor，OPNi）用于腫瘤的協(xié)同治療.OPNi由有機半導體聚合物（PCVB，光敏劑）和共價修飾CA IX抑制劑（CAIs）的兩親性聚合物（CAi-b-PEG-b-PPG-b-PEG-CAi）通過納米沉淀制備而成［圖3（A）］.OPNi能夠選擇性地與CA IX高表達的腫瘤細胞結合，一方面提高其在腫瘤組織的攝取，另一方面調(diào)節(jié)CA IX調(diào)控的相關通路，發(fā)揮協(xié)同治療效果.近紅外熒光成像結果顯示，OPNi經(jīng)尾靜脈注射進荷瘤小鼠體內(nèi)后，在MDA-MB-231腫瘤部位產(chǎn)生的熒光信號顯著高于未含有CAIs的對照納米顆粒OPNc［圖3（B）］.接著，在近紅外光照射下，OPNi能夠顯著抑制腫瘤生長，效果明顯優(yōu)于對照探針［圖3（C）］.Caspase-3的免疫熒光染色實驗結果顯示，OPNi介導的PDT可以在腫瘤組織上調(diào)更多的Caspase-3活性，證實OPNi通過靶向CA IX活性和PDT協(xié)同治療可以產(chǎn)生顯著的抗腫瘤效果［圖3（D）］.

Fig.3 Schematic illustration of preparation of OPNi via nanoprecipitation approach(A),in vivo near-infrared fluorescence imaging of MDA-MB-231 tumors in living mice after intravenous administration of OPNi or OPNc(B),tumor growth curves in mice after treatment with indicated conditions(C),immunofluorescent staining(green fluorescence)of caspase-3 in tumor tissues resected from mice after different treatments(blue fluorescence:nuclei)(D)[23]

近年來，基于短肽小分子的自組裝體系在生物組織工程、分子影像和藥物遞送等方面逐漸引起了人們的廣泛興趣［24～27］.2019年，Chen等［28］利用生物相容性較高的氨基酸短肽［2-Naphthaleneacetic acid-（D）-Phe-（D）-Phe-（D）-Lys-OH，N-pep］與CA IX抑制劑［4-（2-Aminoethyl）benzenesulfonamide，ABS］進行共價連接，構建了能靶向CA IX的短肽小分子化合物N-pepABS［圖4（A）和（B）］.由于腫瘤細胞在乏氧條件下會顯著上調(diào)細胞膜表面的CA IX表達，因此，N-pepABS可以在細胞膜表面高表達的CA IX作用下，發(fā)生自組裝，堆積形成納米纖維而粘附在細胞膜表面，表現(xiàn)出更強的CA IX結合能力和滯留效果，產(chǎn)生顯著的CA IX的抑制活性，從而阻斷乏氧腫瘤細胞的代謝及下游信號通路.粘附在細胞表面的納米纖維進一步通過CA IX介導的內(nèi)吞作用攝取進入乏氧腫瘤細胞的溶酶體中（Stage I），接著在溶酶體中酸性環(huán)境作用下，納米纖維發(fā)生結構膨脹，進一步堆積形成尺寸更長的纖維（Stage II），戳破溶酶體（Stage III），引起溶酶體損傷和保護性自噬阻斷（Stage IV），從而誘導腫瘤細胞死亡.因此，N-pepABS可以通過CA IX介導的自組裝過程，有效靶向并殺傷乏氧腫瘤細胞，從而抑制腫瘤增殖.小動物實驗結果表明，N-pepABS通過瘤內(nèi)注射到荷瘤小鼠體內(nèi)后，能夠抑制4T1腫瘤的生長［圖4（C）］.進一步與化療藥物阿霉素（Doxorubicin，DOX）聯(lián)用，N-pepABS顯著提高了對MDA-MB-231腫瘤的治療效果［圖4（D）］.

Fig.4 Schematic illustration of CA IX-targeting self-assembly of N-pepABS for the treatment of hypoxia tumors(A),the chemical structure of N-pepABS(B),photographs and average tumor weight of non-treated 4T1 tumors(Con)and N-pepABS-treated 4T1 tumors(C),the changes of tumors volumes in MDA-MB-231 tumor-bearing mice upon nontreatment(Con)or treatment with DOX,N-pepABS,N-pepABS together with DOX(D)[28]

與光動力治療和短肽小分子自組裝體系相比，化療藥物在臨床上使用更為廣泛.然而，當前化療藥物在臨床使用時還面臨腫瘤靶向性不足、副作用較大、易產(chǎn)生耐藥性等挑戰(zhàn).為了提高鉑類藥物（如順鉑、奧沙利鉑）的抗腫瘤效果，降低對正常組織的毒副作用，Mao等［29］設計并合成了兩個CAs靶向的四價鉑［Pt（IV）］前藥分子Pt1和Pt2［圖5（A）］，用于調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境和代謝，進而增強鉑類藥物對實體瘤的治療效果.Pt1和Pt2為分別將四價順鉑前藥和四價奧沙利鉑前藥與兩分子的CA IX抑制劑苯磺酰胺共價連接制備得到.一方面，Pt1和Pt2通過兩個苯磺酰胺基團選擇性地靶向腫瘤細胞表面高表達的CA IX，增強探針在腫瘤細胞的攝取，進而在腫瘤細胞內(nèi)高濃度的谷胱甘肽（Glutathione，GSH）還原作用下，釋放出順鉑和奧沙利鉑原藥，殺傷腫瘤細胞；另一方面，Pt1和Pt2通過抑制腫瘤細胞的CA IX活性，克服腫瘤組織的乏氧和微酸性環(huán)境，產(chǎn)生抗腫瘤血管生成的效果.因此，Pt1和Pt2能夠發(fā)揮針對腫瘤的協(xié)同治療效果，從而能有效抑制腫瘤生長［圖5（B）］.

Fig.5 Chemical structures of Pt1 and Pt2(A),changes of the tumor volume in mice following nontreatment(control)of tail vein injection with Pt1,Pt2,Cisplatin or Oxaliplatin(B)[29],illustration of DOX@MSNs-CAIX for CA IX-targeted drug delivery and GSH-controlled release of DOX in tumors(C),the average tumor weight on 11 d after treatment with PBS,DOX@MSNs or DOX@MSNs-CAIX(D)[30]

2020年，Zhang等［30］以介孔硅（Mesoporous silica nanoparticles，MSNs）為載體，負載了化療藥物DOX，進一步通過二硫鍵將CA IX抗體（A-CA IX Ab）連接在MSNs表面，構建了DOX@MSNs-CAIX納米顆粒，并應用于CA IX靶向腫瘤和GSH觸發(fā)DOX釋放的聯(lián)合治療［圖5（C）］.DOX@MSNs-CAIX表面所連接的CA IX抗體能夠與腫瘤細胞表面高表達的CA IX特異性結合，提高納米顆粒在腫瘤部位的攝取.當DOX@MSNs-CAIX攝取進入腫瘤細胞內(nèi)，進一步在腫瘤細胞內(nèi)高濃度的GSH還原作用下，引起二硫鍵斷裂，使得共價連接在MSNs表面上的A-CA IX Ab與MSNs解離，釋放出MSNs內(nèi)部的DOX，從而達到靶向腫瘤及化療的協(xié)同作用.活體治療效果顯示，與只注射PBS或不含有A-CA IX Ab的DOX@MSNs相比，DOX@MSNs-CAIX可以更有效地抑制腫瘤生長［圖5（D）］.

3 總結與展望

簡要概述了近年來CAs靶向分子探針的研究進展，主要圍繞CAs靶向的腫瘤熒光成像和CAs靶向的腫瘤協(xié)同治療兩部分內(nèi)容進行總結.盡管這些基于CAs的分子探針在腫瘤的成像與治療應用中取得了較好的效果，但仍然面臨以下挑戰(zhàn)：（1）基于CAs靶向的熒光成像探針的熒光發(fā)射波長主要在可見及近紅外第一窗口（400～900 nm），在活體應用時難以實現(xiàn)深組織穿透深度、高信背比的成像效果；（2）大部分報道的分子探針主要與細胞膜上的CAs相互作用，較少能靶向細胞內(nèi)的CAs；（3）靶向CAs的分子探針與化療、PDT聯(lián)合治療時仍然面臨腫瘤的多藥耐藥、腫瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā)等問題.針對這些挑戰(zhàn)，未來針對CAs的研究將需要解決以下幾方面問題：（1）開發(fā)能特異性靶向CAs的近紅外II區(qū)（1000～1700 nm）熒光探針或多模態(tài)成像探針，以提高組織成像深度、信背比和成像分辨率；（2）構建能夠靶向細胞內(nèi)CAs的分子探針；（3）發(fā)展CAs靶向治療與免疫治療相結合的協(xié)同治療，克服腫瘤的轉(zhuǎn)移和復發(fā).此外，系統(tǒng)研究這些靶向CAs的分子探針在體內(nèi)的性能（包括藥代動力學和毒理等），推動臨床應用，也是未來需要進一步研究的方向.