楊燕玲,葉德舉
(南京大學化學化工學院,生命分析化學國家重點實驗室,化學和生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究院,南京 210023)
碳酸酐酶(Carbonic anhydrases,CAs)是一類細胞中普遍存在的金屬酶,其主要包括5種細胞基質(zhì)形式(CA I,CA II,CA III,CA VII和CA XIII)、5種膜結(jié)合同工酶(CA IV,CA IX,CA XII,CA XIV和CA XV)、2種線粒體形式(CA VA和CA VB)和一種分泌的CA同工酶(CA VI)[1~7].研究發(fā)現(xiàn),CAs的活性主要是由活性口袋的氨基酸殘基與金屬Zn2+形成的配合物決定[8].以人體中含量最豐富、研究最多的CA II為例[9],其由260個氨基酸組成,是一種單結(jié)構(gòu)域單體蛋白,具有混合α/β的球狀結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)折疊形式[圖1(A)].CA II中心由8個β股折疊組成,中心兩側(cè)為7個α螺旋結(jié)構(gòu).活性位點Zn2+與3個組氨酸殘基(H94,H96,H119)及1個羥基離子形成四面體配位.活性口袋主要由親水性氨基酸(Y7,N62,H64,N67,T199和T200)和疏水性氨基酸(V121,V143,L198,T199,V207和W209)兩種不同的環(huán)境組成.CA II調(diào)節(jié)pH的機理如圖1(B)所示,活性口袋中Zn2+所絡(luò)合的OH-親核進攻CO2產(chǎn)生HCO3-;由于HCO3-與Zn2+的結(jié)合力較弱,易被水分子取代,釋放出HCO3-,而與Zn2+絡(luò)合的水分子進一步被活化為高活性的OH-,從而恢復(fù)CAs對CO2的催化活性.
研究表明,CAs的活性與腫瘤的乏氧微環(huán)境密切相關(guān).在多種類型的惡性腫瘤(如膠質(zhì)母細胞瘤[10]、結(jié)直腸癌[11]、乳腺癌[12]和腎癌[13]等)中,CAs的表達量會比正常組織細胞上調(diào)150~200倍[14].在腫瘤細胞中,CAs通過催化CO2形成HCO3-的轉(zhuǎn)換過程,參與調(diào)節(jié)腫瘤組織的微酸性環(huán)境[15].以CA IX為例,作為跨膜蛋白,可催化細胞膜外CO2轉(zhuǎn)化為HCO3-和H+,使CO2在細胞膜內(nèi)外垂直方向保持濃度梯度[圖1(C)].這有利于CO2從胞內(nèi)擴散到胞外,從而產(chǎn)生偏酸性的細胞外環(huán)境(pHe=6.5~6.8)和中性的細胞內(nèi)環(huán)境(pHi=7.2~7.4).此外,在細胞膜外產(chǎn)生的HCO3-被相鄰的HCO3-轉(zhuǎn)運蛋白(如NBCe1,NBCn1)重新轉(zhuǎn)運進入細胞,進而在細胞質(zhì)中與H+結(jié)合產(chǎn)生CO2,有助于降低細胞內(nèi)的H+濃度,維持細胞內(nèi)中性環(huán)境.
Fig.1 Crystal structure of human CA II[Ribbon cartoon representation of the crystal structure of CA II(PDB ID:3KS3),blue spheres:Zn2+ion](A),proposed mechanism of CA II-catalyzed conversion of CO2 to HCO3-(B)[9],cartoon illustration of the role of CAs in regulating extracellular(pHe)and intracellular pH(pHi)(C)[15]
鑒于CAs在腫瘤中的關(guān)鍵生物學功能,CAs已成為腫瘤診斷與治療的一類關(guān)鍵生物靶標.快速、準確地檢測CAs的活性對于腫瘤的早期診斷與及時治療具有重要意義.通過抑制CAs的活性,可以有效改善腫瘤的酸性微環(huán)境和乏氧環(huán)境,有助于產(chǎn)生對腫瘤的協(xié)同治療效果.近年來,針對CAs已構(gòu)建了不同類型的分子探針,并成功應(yīng)用于腫瘤的成像與治療.目前,已有一些針對CAs靶向探針或抑制劑的報道,但它們主要集中在介紹CAs的生物功能[16]、靶向CAs的單光子發(fā)射計算機斷層成像(Singlephoton emission computerized tomography,SPECT)或正電子發(fā)射斷層掃描成像(Positron emission tomography,PET)造影劑[17]、抑制CAs活性的小分子化合物[18,19].CAs靶向熒光探針和診療探針的研究進展尚未見報道.因此,本綜述首先簡要介紹了CAs的結(jié)構(gòu)、活性及生物學功能;然后,重點介紹了CAs靶向熒光探針的構(gòu)建與腫瘤成像應(yīng)用和CAs靶向分子探針的構(gòu)建與腫瘤協(xié)同治療應(yīng)用;最后,對靶向CAs的熒光探針和分子探針在腫瘤成像與治療應(yīng)用中所面臨的挑戰(zhàn)和未來研究方向進行了展望.
熒光成像技術(shù)由于具有操作簡便、靈敏度高等優(yōu)點,已被廣泛應(yīng)用于細胞與生物活體內(nèi)各種生物標志物的成像分析.為了檢測CAs,構(gòu)建了具有CAs特異性靶向的熒光探針,并成功應(yīng)用于腫瘤細胞的高靈敏熒光成像.如2014年,Hamachi等[20]以羅丹明衍生物為熒光團,以CAs的抑制劑苯磺酰胺作為CAs的識別位點,通過引入可改善親疏水性質(zhì)的連接基團,構(gòu)建了兩親性熒光探針1.探針1在水溶液中自組裝形成納米聚集體,使得羅丹明的熒光由于發(fā)生聚集誘導(dǎo)猝滅效應(yīng)而降低.當聚集態(tài)與人乳腺癌MCF7細胞上高表達的CA II結(jié)合后,自組裝的聚集體發(fā)生解組裝,從而打開羅丹明的熒光信號[圖2(A)].溶液實驗結(jié)果顯示,探針1與CA II孵育30 min后,可以在585 nm處產(chǎn)生約30倍的熒光信號增強[圖2(B)].進一步的熒光成像實驗結(jié)果顯示,探針1與MCF7細胞孵育4 h后,在細胞質(zhì)和細胞核中均產(chǎn)生明亮的羅丹明的熒光信號;當加入CA II抑制劑(Ethoxazolamide,EZA)后,細胞中產(chǎn)生的熒光信號被顯著抑制[圖2(C)],證實細胞中的羅丹明熒光是通過探針1中的磺酰胺官能團與CA II之間的特異性結(jié)合而產(chǎn)生的.基于細胞中點亮的熒光,他們進一步將探針1應(yīng)用于活細胞上CA II抑制劑活性的快速篩選.2015年,Tan等[21]基于類似的分子自組裝與解組裝方法,構(gòu)建了CA IX可激活的近紅外熒光探針,應(yīng)用于乏氧環(huán)境中腫瘤細胞表面CA IX的檢測和腫瘤細胞的免洗熒光成像.
Fig.2 Chemical structure and schematic illustration of probe 1 for the detection of CA II(A),fluorescence spectra change of probe 1 upon addition of CA II(B),confocal laser scanning microscope(CLSM)images of MCF7 cells incubated with probe 1 in the absence or presence of EZA(C)[20],chemical structures of AZ-BPS and BPS(D),fluorescence imaging of MDA-MB-231 tumor-bearing nude mice after intravenous injection of AZ-BPS or BPS(left),ex vivo fluorescence imaging of main organs resected from MDA-MB-231 tumor-bearing mice in the left[i:tumor(yellow circle),ii:liver,iii:lung,iv:kidney,v:heart,vi:spleen,vii:testis](right)(E)[22]
為了在活體上檢測CAs的活性,Kim等[22]將CAs的抑制劑乙酰唑胺(Acetazolamide,AZ)與近紅外光敏劑(Boron-dipyrromethene,BODIPY)通過點擊化學方法共價鏈接,構(gòu)建了可靶向CA IX的近紅外光敏探針AZ-BPS[圖2(D)].借助AZ對CA IX高的親和力和抑制作用,AZ-BPS能高效結(jié)合人乳腺癌MDA-MB-231細胞上高表達的CA IX,產(chǎn)生明亮的近紅外熒光,從而點亮MDA-MB-231細胞.活體熒光成像結(jié)果顯示,與不含AZ的對照探針BPS相比,AZ-BPS通過尾靜脈注射到荷瘤小鼠體內(nèi)后,可以在MDA-MB-231腫瘤部位產(chǎn)生顯著增強的近紅外熒光信號.離體器官的熒光成像結(jié)果表明,AZ-BPS主要蓄積在腫瘤組織中,而在其它主要器官(如肝臟、腎臟等)攝取較少[圖2(E)].由于BODIPY在近紅外光照射下能產(chǎn)生具有細胞毒性的單線態(tài)氧,進一步將AZ-BPS成功應(yīng)用于CA IX靶向的腫瘤光動力治療(Photodynamic therapy,PDT).
PDT具有無創(chuàng)、副作用小及時空可控等優(yōu)勢.PDT的療效與光敏劑在腫瘤細胞中產(chǎn)生活性氧物種(Reactive oxygen species,ROS)的能力密切相關(guān),而腫瘤組織的乏氧微環(huán)境會限制ROS的生成,降低PDT的療效.為了克服腫瘤乏氧影響,2019年,Pu等[23]設(shè)計了一種有機光動力納米抑制劑(Organic photodynamic nanoinhibitor,OPNi)用于腫瘤的協(xié)同治療.OPNi由有機半導(dǎo)體聚合物(PCVB,光敏劑)和共價修飾CA IX抑制劑(CAIs)的兩親性聚合物(CAi-b-PEG-b-PPG-b-PEG-CAi)通過納米沉淀制備而成[圖3(A)].OPNi能夠選擇性地與CA IX高表達的腫瘤細胞結(jié)合,一方面提高其在腫瘤組織的攝取,另一方面調(diào)節(jié)CA IX調(diào)控的相關(guān)通路,發(fā)揮協(xié)同治療效果.近紅外熒光成像結(jié)果顯示,OPNi經(jīng)尾靜脈注射進荷瘤小鼠體內(nèi)后,在MDA-MB-231腫瘤部位產(chǎn)生的熒光信號顯著高于未含有CAIs的對照納米顆粒OPNc[圖3(B)].接著,在近紅外光照射下,OPNi能夠顯著抑制腫瘤生長,效果明顯優(yōu)于對照探針[圖3(C)].Caspase-3的免疫熒光染色實驗結(jié)果顯示,OPNi介導(dǎo)的PDT可以在腫瘤組織上調(diào)更多的Caspase-3活性,證實OPNi通過靶向CA IX活性和PDT協(xié)同治療可以產(chǎn)生顯著的抗腫瘤效果[圖3(D)].
Fig.3 Schematic illustration of preparation of OPNi via nanoprecipitation approach(A),in vivo near-infrared fluorescence imaging of MDA-MB-231 tumors in living mice after intravenous administration of OPNi or OPNc(B),tumor growth curves in mice after treatment with indicated conditions(C),immunofluorescent staining(green fluorescence)of caspase-3 in tumor tissues resected from mice after different treatments(blue fluorescence:nuclei)(D)[23]
近年來,基于短肽小分子的自組裝體系在生物組織工程、分子影像和藥物遞送等方面逐漸引起了人們的廣泛興趣[24~27].2019年,Chen等[28]利用生物相容性較高的氨基酸短肽[2-Naphthaleneacetic acid-(D)-Phe-(D)-Phe-(D)-Lys-OH,N-pep]與CA IX抑制劑[4-(2-Aminoethyl)benzenesulfonamide,ABS]進行共價連接,構(gòu)建了能靶向CA IX的短肽小分子化合物N-pepABS[圖4(A)和(B)].由于腫瘤細胞在乏氧條件下會顯著上調(diào)細胞膜表面的CA IX表達,因此,N-pepABS可以在細胞膜表面高表達的CA IX作用下,發(fā)生自組裝,堆積形成納米纖維而粘附在細胞膜表面,表現(xiàn)出更強的CA IX結(jié)合能力和滯留效果,產(chǎn)生顯著的CA IX的抑制活性,從而阻斷乏氧腫瘤細胞的代謝及下游信號通路.粘附在細胞表面的納米纖維進一步通過CA IX介導(dǎo)的內(nèi)吞作用攝取進入乏氧腫瘤細胞的溶酶體中(Stage I),接著在溶酶體中酸性環(huán)境作用下,納米纖維發(fā)生結(jié)構(gòu)膨脹,進一步堆積形成尺寸更長的纖維(Stage II),戳破溶酶體(Stage III),引起溶酶體損傷和保護性自噬阻斷(Stage IV),從而誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡.因此,N-pepABS可以通過CA IX介導(dǎo)的自組裝過程,有效靶向并殺傷乏氧腫瘤細胞,從而抑制腫瘤增殖.小動物實驗結(jié)果表明,N-pepABS通過瘤內(nèi)注射到荷瘤小鼠體內(nèi)后,能夠抑制4T1腫瘤的生長[圖4(C)].進一步與化療藥物阿霉素(Doxorubicin,DOX)聯(lián)用,N-pepABS顯著提高了對MDA-MB-231腫瘤的治療效果[圖4(D)].
Fig.4 Schematic illustration of CA IX-targeting self-assembly of N-pepABS for the treatment of hypoxia tumors(A),the chemical structure of N-pepABS(B),photographs and average tumor weight of non-treated 4T1 tumors(Con)and N-pepABS-treated 4T1 tumors(C),the changes of tumors volumes in MDA-MB-231 tumor-bearing mice upon nontreatment(Con)or treatment with DOX,N-pepABS,N-pepABS together with DOX(D)[28]
與光動力治療和短肽小分子自組裝體系相比,化療藥物在臨床上使用更為廣泛.然而,當前化療藥物在臨床使用時還面臨腫瘤靶向性不足、副作用較大、易產(chǎn)生耐藥性等挑戰(zhàn).為了提高鉑類藥物(如順鉑、奧沙利鉑)的抗腫瘤效果,降低對正常組織的毒副作用,Mao等[29]設(shè)計并合成了兩個CAs靶向的四價鉑[Pt(IV)]前藥分子Pt1和Pt2[圖5(A)],用于調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境和代謝,進而增強鉑類藥物對實體瘤的治療效果.Pt1和Pt2為分別將四價順鉑前藥和四價奧沙利鉑前藥與兩分子的CA IX抑制劑苯磺酰胺共價連接制備得到.一方面,Pt1和Pt2通過兩個苯磺酰胺基團選擇性地靶向腫瘤細胞表面高表達的CA IX,增強探針在腫瘤細胞的攝取,進而在腫瘤細胞內(nèi)高濃度的谷胱甘肽(Glutathione,GSH)還原作用下,釋放出順鉑和奧沙利鉑原藥,殺傷腫瘤細胞;另一方面,Pt1和Pt2通過抑制腫瘤細胞的CA IX活性,克服腫瘤組織的乏氧和微酸性環(huán)境,產(chǎn)生抗腫瘤血管生成的效果.因此,Pt1和Pt2能夠發(fā)揮針對腫瘤的協(xié)同治療效果,從而能有效抑制腫瘤生長[圖5(B)].
Fig.5 Chemical structures of Pt1 and Pt2(A),changes of the tumor volume in mice following nontreatment(control)of tail vein injection with Pt1,Pt2,Cisplatin or Oxaliplatin(B)[29],illustration of DOX@MSNs-CAIX for CA IX-targeted drug delivery and GSH-controlled release of DOX in tumors(C),the average tumor weight on 11 d after treatment with PBS,DOX@MSNs or DOX@MSNs-CAIX(D)[30]
2020年,Zhang等[30]以介孔硅(Mesoporous silica nanoparticles,MSNs)為載體,負載了化療藥物DOX,進一步通過二硫鍵將CA IX抗體(A-CA IX Ab)連接在MSNs表面,構(gòu)建了DOX@MSNs-CAIX納米顆粒,并應(yīng)用于CA IX靶向腫瘤和GSH觸發(fā)DOX釋放的聯(lián)合治療[圖5(C)].DOX@MSNs-CAIX表面所連接的CA IX抗體能夠與腫瘤細胞表面高表達的CA IX特異性結(jié)合,提高納米顆粒在腫瘤部位的攝取.當DOX@MSNs-CAIX攝取進入腫瘤細胞內(nèi),進一步在腫瘤細胞內(nèi)高濃度的GSH還原作用下,引起二硫鍵斷裂,使得共價連接在MSNs表面上的A-CA IX Ab與MSNs解離,釋放出MSNs內(nèi)部的DOX,從而達到靶向腫瘤及化療的協(xié)同作用.活體治療效果顯示,與只注射PBS或不含有A-CA IX Ab的DOX@MSNs相比,DOX@MSNs-CAIX可以更有效地抑制腫瘤生長[圖5(D)].
簡要概述了近年來CAs靶向分子探針的研究進展,主要圍繞CAs靶向的腫瘤熒光成像和CAs靶向的腫瘤協(xié)同治療兩部分內(nèi)容進行總結(jié).盡管這些基于CAs的分子探針在腫瘤的成像與治療應(yīng)用中取得了較好的效果,但仍然面臨以下挑戰(zhàn):(1)基于CAs靶向的熒光成像探針的熒光發(fā)射波長主要在可見及近紅外第一窗口(400~900 nm),在活體應(yīng)用時難以實現(xiàn)深組織穿透深度、高信背比的成像效果;(2)大部分報道的分子探針主要與細胞膜上的CAs相互作用,較少能靶向細胞內(nèi)的CAs;(3)靶向CAs的分子探針與化療、PDT聯(lián)合治療時仍然面臨腫瘤的多藥耐藥、腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等問題.針對這些挑戰(zhàn),未來針對CAs的研究將需要解決以下幾方面問題:(1)開發(fā)能特異性靶向CAs的近紅外II區(qū)(1000~1700 nm)熒光探針或多模態(tài)成像探針,以提高組織成像深度、信背比和成像分辨率;(2)構(gòu)建能夠靶向細胞內(nèi)CAs的分子探針;(3)發(fā)展CAs靶向治療與免疫治療相結(jié)合的協(xié)同治療,克服腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā).此外,系統(tǒng)研究這些靶向CAs的分子探針在體內(nèi)的性能(包括藥代動力學和毒理等),推動臨床應(yīng)用,也是未來需要進一步研究的方向.