自組裝多肽探針在磁共振成像中的應(yīng)用

徐海東，王 睿，梁高林

（東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院,生物電子學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210096）

近年來，隨著計(jì)算機(jī)科學(xué)、物理學(xué)、分子生物學(xué)和材料化學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，已有多種無創(chuàng)生物成像技術(shù)被開發(fā)并廣泛應(yīng)用于疾病診斷，如計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）［1］、磁共振成像（MRI）［2］、光學(xué)成像（OI）［3］、正電子發(fā)射斷層掃描（PET）［4］和超聲成像（US）［5］等.其中，MRI利用核磁共振原理，通過被檢測(cè)組織的物理和生物學(xué)特征（如水分子、鐵離子、脂肪及血管外血液等）進(jìn)行成像，從而評(píng)估病變過程，具有深組織穿透和高空間分辨率等優(yōu)點(diǎn)［6］.目前，多種自旋核被應(yīng)用于MRI，如1H，2H，11B，13C，19F，23Na，31P和35Cl等［7］.1H核具有核自旋磁矩，因在人體內(nèi)廣泛分布而被廣泛應(yīng)用.19F是1H后最適合應(yīng)用于MRI的原子核，具有100%的自然豐度，且沒有放射性，旋磁比和靈敏度分別為1H的94%和83%；而且腫瘤微環(huán)境的微小變化可以顯著影響氫核（1H）和氟核（19F）的弛豫參數(shù)，從而反映疾病的發(fā)生，因此，基于1H MRI和19F MRI的腫瘤早期診斷和定位成為了研究熱點(diǎn)［8］.

1H大部分存在于人體內(nèi)的水和脂肪中，產(chǎn)生的活體磁共振信號(hào)較強(qiáng)，具有高檢測(cè)靈敏度.因此，1H MRI可提供大量的病理信息，對(duì)臨床中一些疾病的診斷和預(yù)后都有顯著的幫助，是生物醫(yī)學(xué)研究和臨床上最常用的成像技術(shù)之一［9］.相比之下，正常生物體內(nèi)氟的含量很少，因此19F MRI中信號(hào)受到的干擾較少，使其具有很高的選擇性［10，11］（表1）.目前，19F MRI已經(jīng)被應(yīng)用于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)的離子（如Ca2+和Mg2+）［12］、pH值［13］及膜電位等生物指標(biāo).雖然基于1H和19F核的MRI已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，但是臨床上腫瘤組織與正常組織的磁共振信號(hào)有時(shí)差異不大，導(dǎo)致圖像分辨率較低從而影響診斷的準(zhǔn)確性.為了進(jìn)一步提升診斷的準(zhǔn)確性，臨床上經(jīng)常使用造影劑來提高腫瘤區(qū)域的成像對(duì)比度.傳統(tǒng)MRI造影劑往往局限于小分子探針，它們雖然能夠被細(xì)胞攝取，有一定的優(yōu)勢(shì)，但其信號(hào)強(qiáng)度通常較弱，使得腫瘤病灶區(qū)域的成像對(duì)比度有限.隨著納米技術(shù)的迅速發(fā)展，已設(shè)計(jì)出大量新型納米材料用于提高M(jìn)RI成像的對(duì)比度［14］.尤其是對(duì)于腫瘤的MRI造影而言，實(shí)體瘤組織的高通透和滯留（Enhanced permeability and retention，EPR）效應(yīng)可以使納米成像探針靶向腫瘤并在瘤內(nèi)富集［15］，從而放大信號(hào)并提高成像對(duì)比度.

Table 1 Comparisons between the 1H MRI and the 19F MRI[9,10]

在各種納米探針中，基于自組裝多肽的納米探針因其合成簡單、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)［16］而備受關(guān)注.自組裝多肽可以負(fù)載藥物［17］、熒光分子［18］和磁共振分子等基團(tuán)，在響應(yīng)一些在病灶區(qū)域表達(dá)異常的活性酶后可使特定肽段序列被特異性剪切.如，利用凋亡細(xì)胞高度表達(dá)Caspase-3酶的特性，Shi等［19］設(shè)計(jì)了含有Caspase-3底物Ac-DEVD序列的多肽分子，在酶切后疏水殘基聚集誘導(dǎo)熒光增強(qiáng)，由于Caspase-3在腫瘤中高表達(dá)，因此該探針具有腫瘤特異性，可以增強(qiáng)對(duì)比度，并減少假陽性的干擾.設(shè)計(jì)能夠響應(yīng)酶的多肽序列后，利用特定多肽序列或點(diǎn)擊反應(yīng)后產(chǎn)物的分子間非共價(jià)相互作用［20］，如氫鍵［21］、π-π堆積［22］、范德華力［23］和靜電力［24］等作用，自發(fā)原位形成納米結(jié)構(gòu)（如納米纖維或納米顆粒等）［25］，從而實(shí)現(xiàn)病灶區(qū)域的靶向和累積.為了在多肽上負(fù)載藥物，可以在多肽序列中加入側(cè)鏈帶有氨基的氨基酸.如，Wang等［26］基于CBT-Cys點(diǎn)擊縮合反應(yīng)，設(shè)計(jì)了在Lys側(cè)鏈上負(fù)載光聲藥物Cypate的探針Val-Cit-Cys（SEt）-Lys（Cypate）-CBT，該探針經(jīng)腫瘤高表達(dá)的CTSB特異性激活，其上的特定底物序列Val-Cit被剪切，使得分子間發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng)生成二聚體，然后通過π-π堆積作用自組裝成尺寸較大的納米粒子.此外，Gao等［17］設(shè)計(jì)了多肽-羥基氯喹（HCQ）探針Cypate-Phe-Phe-Lys（SA-HCQ）-Tyr（H2PO3）-OH，其磷酸根在堿性磷酸酶（ALP）的作用下被去除，親水的Tyr與疏水的Phe-Phe多肽之間通過疏水相互作用和氫鍵相互作用自組裝成納米顆粒，促進(jìn)了近紅外染料Cypate在腫瘤區(qū)域的積累，增強(qiáng)了近紅外光照射下的光熱效應(yīng).同時(shí)，釋放出的HCQ可以抑制細(xì)胞自噬過程，降低細(xì)胞耐熱性，提高其對(duì)溫和PTT的敏感度.Xu等［27，28］研究了小分子自組裝形成水凝膠的機(jī)制，在超分子水平上開發(fā)出新的生物材料和治療方法.此外，他們還利用酶響應(yīng)的多肽自組裝來選擇性地殺死未分化的人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC），從而降低iPSCs臨床應(yīng)用中的致癌風(fēng)險(xiǎn)［29］.除了用于腫瘤治療和藥物遞送，一些研究組還利用自組裝多肽探針進(jìn)行成像研究，如自組裝多肽磁共振探針.自組裝多肽磁共振探針由成像功能分子和自組裝序列組成，在病灶區(qū)域活性酶的酶切作用下，對(duì)應(yīng)多肽序列的自組裝/解組裝過程可以控制成像信號(hào)的“開”或“關(guān)”，減少細(xì)胞內(nèi)其它環(huán)境的干擾，從而顯著提高成像的對(duì)比度和靈敏度.同時(shí)，自組裝多肽探針具有較高的穩(wěn)定性.為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，Hai等［30］測(cè)試了自組裝多肽探針7 d內(nèi)的紫外-可見光譜和高效液相色譜，兩者均無明顯變化，證明了自組裝多肽探針具有很高的理化穩(wěn)定性.Yan等［31］測(cè)試了探針在不同pH值或含10%血清的Tris緩沖溶液中形成的納米顆粒的水動(dòng)力尺寸，發(fā)現(xiàn)均無明顯變化，即在不同的生理?xiàng)l件下，以多肽-酶為原理的造影劑分子具有良好的穩(wěn)定性.本文綜述了這些自組裝多肽磁共振探針應(yīng)用于不同MRI模式的最新進(jìn)展，并展望了該領(lǐng)域未來的發(fā)展方向.

1 自組裝多肽探針在1H MRI中的應(yīng)用

應(yīng)用于1H MRI中的造影劑有縱向弛豫造影劑（T1造影劑）和橫向弛豫造影劑（T2造影劑）兩種.T1造影劑通過水分子中的氫核與順磁金屬離子的直接作用，縮短了縱向弛豫時(shí)間（T1），從而增強(qiáng)了磁共振信號(hào)，使腫瘤區(qū)域更亮［32］，在觀察解剖結(jié)構(gòu)方面具有優(yōu)勢(shì).在眾多T1造影劑中，釓離子（Gd3+）具有7個(gè)不成對(duì)電子的特性，使其具有較長的電子弛豫時(shí)間，有利于增加附近水分子的1H弛豫速率，從而獲得較大的MRI信號(hào)增強(qiáng)倍數(shù)［33］，因此釓基造影劑已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床T1MRI［34］.T2造影劑縮短了橫向弛豫時(shí)間（T2），病灶區(qū)域顯得更暗，有利于觀察病變，尤其是在判斷出血點(diǎn)的位置時(shí)會(huì)更為明顯.以超順磁性氧化鐵顆粒（SPIO）為例的T2造影劑可以顯著縮短T2，在T2加權(quán)成像上表現(xiàn)為更暗，因此也得到了廣泛應(yīng)用［35］.多肽自組裝探針在兩種模式下都有較好的表現(xiàn)，下面將分別介紹多肽自組裝探針在兩種模式下的應(yīng)用.

Fig.1 Schematic illustration of P-CyFF-Gd and fluorogenic reaction and in situ self-assembly of P-CyFF-Gd into NPs mediated by ALP that show increased NIR FL and r1 relaxivity(A),TEMand AFMimages of NPs after incubating P-CyFF-Gd(200μmol/L)with ALP(2 U/mL,37℃)for 30 min(Scale bars:200 nm)(B),T1-weighted MR images and T1 values(0.5 T)of P-CyFF-Gd(200μmol/L)in Tris buffer by incubating with ALP(2 U/mL)for 0—40 min(C),T1-weighted MR images of HeLa tumor-bearing mice receiving i.p.injection of P-CyFF-Gd(I),P-Cy-Gd(II),P-CyFF-Gd(III)together with Na3VO4.Images were acquired before(Pre)or 2,4,6,10 h after injection using TE/TR=15/446 ms at 1.0 T.White arrows indicate the Dotarem solution(1 mmol/L)as the internal standard.Red arrows point the tumor locations in mice(D)[31]

1.1 自組裝多肽T1造影劑在1H MRI中的應(yīng)用

在T1加權(quán)MRI中，傳統(tǒng)小分子Gd造影劑在給藥后會(huì)被快速清除，導(dǎo)致成像對(duì)比度較低，成像時(shí)間窗口較短.而通過生物標(biāo)志物（如活性酶等）響應(yīng)的多肽自組裝使其原位聚集成納米結(jié)構(gòu)，即可達(dá)到腫瘤靶向和延長滯留時(shí)間的目的.如，利用腫瘤細(xì)胞膜高表達(dá)堿性磷酸酶的特性，2019年，Yan等［31］設(shè)計(jì)了一種ALP激活的近紅外（NIR）熒光/MRI雙模探針P-CyFF-Gd［圖1（A）］.該探針包含了被預(yù)猝滅的NIR熒光基團(tuán)（部花青素，Cy-Cl）、用于MRI的順磁性DOTA-Gd螯合物、能夠被ALP特異性識(shí)別的磷酸基團(tuán)（—PO3H）和促進(jìn)自組裝的疏水性二肽Phe-Phe（FF）的多肽結(jié)構(gòu).P-CyFF-Gd具有分子尺寸小和親水性強(qiáng)的特點(diǎn)，因此可以滲入并彌散至腫瘤組織深處，并被腫瘤組織中高表達(dá)的ALP酶切，釋放出具有疏水性結(jié)構(gòu)的去磷酸化產(chǎn)物CyFF-Gd.由于這個(gè)產(chǎn)物具有FF的二肽結(jié)構(gòu)，可以依靠分子間作用力π-π堆積自組裝成納米顆粒，動(dòng)態(tài)光散射分析組裝后的納米顆粒的水動(dòng)力尺寸約為66 nm，TEM和AFM測(cè)試結(jié)果驗(yàn)證了單分散納米顆粒的形成［圖1（B）］.

隨著ALP作用時(shí)間的增加，組裝后含Gd的納米顆粒尺寸變大，在0.5 T的場(chǎng)強(qiáng)下逐漸縮短水質(zhì)子的T1，以產(chǎn)生更亮的T1加權(quán)磁共振圖像，從而顯著增強(qiáng)腫瘤區(qū)域的成像對(duì)比度［圖1（C）和（D）］.DOTA-Gd的穩(wěn)定性和安全性都較高，屬于一種低風(fēng)險(xiǎn)的造影劑.細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，該探針對(duì)細(xì)胞活性的影響不大，是一種生物相容性探針，經(jīng)體內(nèi)給藥后最終可經(jīng)肝臟代謝出體外.而將MRI與熒光成像結(jié)合，可以通過監(jiān)測(cè)ALP的活性來監(jiān)測(cè)疾病.除了Gd3+之外，高自旋數(shù)且具有生物相容性的T1造影劑錳離子（Mn2+）也可以被設(shè)計(jì)成自組裝多肽T1造影劑.2018年，Zhang等［36］設(shè)計(jì)了一個(gè)超分子納米平臺(tái)，從而將MRI造影劑（Mn2+）和光敏藥物（Ce6）結(jié)合在一起，并由兩親性的氨基酸Fmoc-L-L和Mn2+協(xié)同作用自組裝.該探針既有良好的生物相容性和優(yōu)異的穩(wěn)定性，還能在谷胱甘肽（GSH）的作用下發(fā)生分解.在腫瘤病灶區(qū)中，Mn2+和Ce6可在細(xì)胞內(nèi)高水平GSH的還原作用下釋放，因此表現(xiàn)出增強(qiáng)的T1加權(quán)對(duì)比度以及滯留時(shí)間的延長.游離的光敏藥物Ce6能夠通過腎臟以及肝臟代謝，該超分子納米平臺(tái)連接Ce6后同樣能夠通過腎臟和肝臟代謝.該探針可以通過有效遞送光敏劑，并原位產(chǎn)生GSH/Mn2+復(fù)合物以降低細(xì)胞內(nèi)的活性GSH水平，從而促進(jìn)活性氧（ROS）的累積，改善還原性腫瘤微環(huán)境，實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)型光動(dòng)力治療（PDT）損傷腫瘤細(xì)胞和組織.同時(shí)，該探針通過釋放到腫瘤組織中的Mn2+提升T1MRI對(duì)比度，從而利用MRI進(jìn)行長期觀察和臨床評(píng)估.以上研究證明了基于多肽自組裝的T1造影劑在MRI中的實(shí)用性.

1.2 自組裝多肽T2造影劑在1H MRI中的應(yīng)用

作為一種常用的T2加權(quán)MRI造影劑，SPIO納米粒子具有尺寸分布窄、弛豫性強(qiáng)和靶向能力強(qiáng)等特點(diǎn)［37］，這些特性使得SPIO納米粒子在腫瘤檢測(cè)中的靈敏度和精度相對(duì)較高［38，39］.尤其是近期研究表明，當(dāng)SPIO納米粒子粒徑較小，成為超小超順磁氧化鐵（USPIO）時(shí)，其飽和磁化強(qiáng)度和橫向弛豫率均得到大幅提高，加之其具有很高的生物相容性和體內(nèi)安全性，因此被廣泛研究［40，41］.而酶響應(yīng)多肽自組裝的策略可以進(jìn)一步增強(qiáng)其成像對(duì)比度，延長其腫瘤病灶滯留時(shí)間，并賦予其生物標(biāo)志物特異性成像的能力.2016年，Yuan等［42］設(shè)計(jì)了一種Caspase 3/7響應(yīng)的USPIO納米顆粒（Fe3O4@1納米顆粒）胞內(nèi)共價(jià)聚集的智能策略，用于增強(qiáng)腫瘤凋亡細(xì)胞的T2加權(quán)MRI.Fe3O4@1納米顆粒探針包含了能夠被Caspase 3/7特異性識(shí)別并切割的Ac-Asp-GluVal-Asp（DEVD）底物、側(cè)鏈上結(jié)合了Fe3O4納米粒子的賴氨酸（Lys）、用于CBT-Cys縮合的半胱氨酸（Cys）基序和2-氰基苯并噻唑（CBT）基序.當(dāng)探針Fe3O4@1納米顆粒進(jìn)入Caspase 3/7過度表達(dá)的細(xì)胞（如凋亡的HepG2細(xì)胞）后，被保護(hù)的巰基會(huì)被胞內(nèi)高水平的谷胱甘肽（GSH）還原，且DEVD結(jié)構(gòu)的肽底物被Caspase 3/7切斷，從而引發(fā)CBT與Cys發(fā)生縮合反應(yīng)，使得Fe3O4納米顆粒聚集.聚集后的納米顆粒顯著縮短了周圍水質(zhì)子的T2值，其橫向弛豫率（r2）比對(duì)照組增強(qiáng)了約65.2%［圖2（A）］.9.4 T場(chǎng)強(qiáng)的1H MRI活體成像顯示，F(xiàn)e3O4@1納米顆粒在體內(nèi)的響應(yīng)性聚集能夠明顯增強(qiáng)凋亡腫瘤的T2加權(quán)MRI［圖2（B）和（C）］，并且無明顯的細(xì)胞毒性.在注射阿霉素（DOX）后的小鼠腫瘤中，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯大于注射生理鹽水的小鼠腫瘤中的凋亡細(xì)胞數(shù)量；在注射Fe3O4@1納米顆粒后，能夠明顯觀察到DOX治療后的小鼠T2磁共振信號(hào)增強(qiáng).該工作證明了基于多肽自組裝的智能探針可以在活體生物上實(shí)現(xiàn)高效的T2加權(quán)MRI，還可以通過MRI監(jiān)測(cè)腫瘤的化療效率［圖2（D）］.

除了Caspase 3/7外，2020年，Wang等［43］還使用弗林酶（furin）來誘導(dǎo)多肽自組裝.SPIO@1NPs具有良好的生物相容性，在furin酶過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中，SPIO@1納米顆粒經(jīng)過furin酶介導(dǎo)發(fā)生縮合反應(yīng)產(chǎn)生自聚集，實(shí)現(xiàn)了比單分散SPIO更高的磁共振的r2值，從而增強(qiáng)T2加權(quán)MRI.

Fig.2 Schematic illustration of intracellular Casp3/7-instructed aggregation of Fe3O4@1 NPs(A),T2-weighted MR phantom images(echo time:75 ms)and T2 relaxation times of Fe3O4@1 NPs treated with 1 mmol/L GSH for 2 h at 37℃or 1 mmol/L GSH and 5 unit Casp3 for 8 h at 37℃,Fe3O4@1-Scr NPs treated with 1 mmol/L GSH for 2 h at 37℃or 1 mmol/L GSH and 5 unit Casp3 for 8 h at 37℃on a 9.4 T MR scanner(TR 5,500 ms,TE 15—180 ms)(B),transverse relaxation rates(1/T2)of Fe3O4@1 NPs or Fe3O4@1-Scr NPs at different concentrations in the presence/absence of Casp3(C),T2-weighted coronal MR images of Fe3O4@1 NPs-injected saline-treated mice,Fe3O4@1 NPs-injected DOX-treated mice,Fe3O4@1-Scr NPs-injected saline-treated mice,and Fe3O4@1-Scr NPs-injected DOX-treated mice after 0 h or 3 h injection(D)[42]

1.3 自組裝多肽T1/T2造影劑在1H MRI中的應(yīng)用

T1造影模式和T2造影模式都有其特有的優(yōu)勢(shì)和局限性，為了拓寬MRI的應(yīng)用場(chǎng)景，研究者們開發(fā)出各種T1/T2雙模態(tài)造影劑［44，45］，以及T1/T2可切換造影劑［46，47］來提高特定場(chǎng)景（如低磁場(chǎng)或強(qiáng)磁場(chǎng)）下的MRI對(duì)比度，從而獲得更精確的診斷.2017年，Dong等［46］研究發(fā)現(xiàn)Gd造影劑雖然通常被用作T1加權(quán)MRI，但是在高磁場(chǎng)下，自組裝形成的Gd納米纖維也可以作為T2加權(quán)MRI造影劑.他們將Gd-DOTA與ALP可激活的短肽共價(jià)結(jié)合，開發(fā)了一種ALP激活的自組裝多肽前體Nap-FFFYp-EDADOTA（Gd）.當(dāng)被細(xì)胞膜過表達(dá)的ALP激活后，該前體被轉(zhuǎn)化為水凝膠劑，并在腫瘤病灶周圍自組裝形成Gd納米纖維，可以對(duì)周圍水質(zhì)子的橫向弛豫率（r2）而非縱向弛豫率（r1）產(chǎn)生較大影響，實(shí)現(xiàn)了在9.4 T高磁場(chǎng)下的T2加權(quán)MRI對(duì)比度增強(qiáng).

為了進(jìn)一步探究T1/T2可切換造影劑的可行性，2022年，Li等［47］探究了胞內(nèi)形成的Gd納米粒子在低、高磁場(chǎng)下的磁共振特性.他們?cè)O(shè)計(jì)的探針Glu-DOTA-Gd-CBT被肝臟腫瘤細(xì)胞攝取后首先被γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，GGT）激活，而后被細(xì)胞中的GSH還原后自組裝形成Gd納米顆粒［圖3（A）］.在低場(chǎng)強(qiáng)（1.0 T）下，該Gd納米顆粒DOTA-Gd-CBT-NP與前體分子Glu-DOTA-Gd-CBT相比，r1值增加了1.49倍，r2值增加了1.43倍，具有較低的r2/r1比值（0.91），表明了其可以特異性地增加肝臟腫瘤在1.0 T的T1加權(quán)MRI［圖3（B），（C），（F）］.而在高場(chǎng)強(qiáng)（9.4 T）下，聚集后形成的DOTA-Gd-CBT-NP與Glu-DOTA-Gd-CBT相比，r1值降低了0.74倍，r2反而顯著增加了15.7倍，r2/r1比值大幅提高至11.8，從而顯著增強(qiáng)肝腫瘤的T2加權(quán)MRI對(duì)比度［圖3（D），（E），（G）］.此工作將T1與T2加權(quán)MRI結(jié)合，拓寬了釓造影劑在臨床上的使用，當(dāng)9.4 T的MRI投入臨床使用后能夠同時(shí)對(duì)早期肝癌進(jìn)行T1和T2加權(quán)MRI診斷.

Fig.3 Schematic illustration of the formation of DOTA-Gd-CBT-NP guided by GGT to enhance T1 and T2 MR contrasts at low(1.0 T)and high(9.4 T)magnetic fields(A),longitudinal relaxation rates(1/T1)and transverse relaxation rates(1/T2)of Group Glu-DOTA-Gd-CBT+GGT,Group Glu-DOTA-Gd-CBT,and Group Gd-DTPA at low(1.0 T)or high(9.4 T)magnetic field(B—E),T1-weighted transverse MR images at 1.0 T and T2-weighted transverse MR images at 9.4 T of liver tumors in groups in(C)at 0 h and 2 h(F,G)[47]

2 自組裝多肽造影劑在19F MRI中的應(yīng)用

與1H MRI相比，19F MRI背景信號(hào)干擾小，具有較高的選擇性，但其靈敏度較低，為了達(dá)到與1H MRI相當(dāng)?shù)膱D像質(zhì)量通常需要注射高劑量的19F探針以增強(qiáng)其體內(nèi)成像信號(hào).相比之下，自組裝多肽19F磁共振探針可以在低注射劑量的情況下，通過在靶標(biāo)部位自組裝積累以實(shí)現(xiàn)19F的高局部濃度［48，49］，從而獲取高靈敏度的圖像，因此具有良好的應(yīng)用前景.2015年，Yuan等［50］將多肽自組裝與19F磁共振結(jié)合開發(fā)了一種雙功能的19F磁共振納米探針.該探針由Cys，CBT和DEVD底物以及側(cè)鏈上結(jié)合了19F核素3，5-雙三氟甲基苯甲酸（19F MBA）基序的Lys組成.探針在被GSH還原后通過縮合自組裝成納米顆粒，此時(shí)19F磁共振信號(hào)由于聚集效應(yīng)被猝滅，表現(xiàn)出關(guān)閉狀態(tài)；當(dāng)該納米粒子被Caspase 3/7分解后，可以很容易地原位獲得高濃度的19F，從而點(diǎn)亮19F磁共振信號(hào)［圖4（A）］.利用這一策略，該探針可以對(duì)凋亡細(xì)胞中的Caspase 3/7活性進(jìn)行檢測(cè)［圖4（B）］，并且在14.1 T低劑量磁場(chǎng)下實(shí)現(xiàn)凋亡斑馬魚體內(nèi)的Caspase 3/7活性成像.該工作開發(fā)了一種可以檢測(cè)GSH和Caspase3/7活性的高靈敏度成像探針，19F納米粒子在凋亡部位的解聚現(xiàn)象有效地阻止了由于局部19F聚集濃度過高而導(dǎo)致的信號(hào)猝滅，是一種良好的19F MRI方法，還可以應(yīng)用于腫瘤患者治療的預(yù)后評(píng)估［圖4（C）］.2016年，Zheng等［51］開發(fā)了另外一種由表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR，一種酪氨酸激酶）和ALP催化的19F磁共振納米探針，有助于藥物研究人員在沒有空間位阻的情況下篩選這兩種酶的新抑制劑.他們利用ALP誘導(dǎo)多肽自組裝以制備超分子水凝膠，通過磁自旋的快速橫向弛豫來預(yù)猝滅19F信號(hào).EGFR催化水凝膠的磷酸化將水凝膠分解到溶液中，使得19F探針處于自由狀態(tài)，從而開啟19F磁共振信號(hào)，監(jiān)測(cè)和檢測(cè)EGFR的酶活.這兩項(xiàng)工作都運(yùn)用了組裝/解組裝的策略，將原位可激活自組裝多肽納米探針用于檢測(cè)腫瘤部位特定酶的活性.

Fig.4 Schematic illustration of GSH-controlled self-assembly of 19F probe to turn 19F NMR signals“off”and Caspase 3/7-controlled disassembly of 19F NPs to turn 19F NMR signals“on”(A),19F MR imaging of 1 or 1-Scr in RIPA lysis buffer,in cell lysate after being incubated with HepG2 cells at 37℃for 30 min,and in cell lysate after being incubated with apoptotic HepG2 cells at 37℃for 30 min(B),2.1 g/kg of 1 and 1-Scr(10μL,dissolved in DMSO)injected into the enterocoelia of zebrafish 3 h after tail amputation and a healthy zebrafish(White arrows indicate the injection sites)(C)[50]

3 自組裝多肽造影劑在雙自旋核MRI中的應(yīng)用

近年來，研究者們發(fā)現(xiàn)將1H和19F兩種MRI方式結(jié)合起來能夠進(jìn)一步提高成像靈敏度和選擇性，并降低背景噪聲［52］.如，Hu等［53］提出了一種肝靶向和GSH誘導(dǎo)的三模態(tài)探針（GdNPs-Gal）.結(jié)合熒光成像、T1加權(quán)1H MRI和19F MRI，該探針可以通過對(duì)肝臟GSH水平的無創(chuàng)、實(shí)時(shí)成像，快速評(píng)估脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的急性肝臟炎癥.

2019年，Ding等［54］利用酶控多肽自組裝的策略，設(shè)計(jì)了一種雙自旋核MRI探針I(yè)ONP@1.IONP@1包含了可被furin裂解并提供19F MRI信號(hào)的多肽底物（TFMB）-Arg-Val-Arg-Arg（TFMB-RVRR），CBT，Cys和T2MRI造影劑IONP.Fe3O4納米顆粒具有非常好的生物相容性，所設(shè)計(jì)的MRI探針即使在高濃度下也只表現(xiàn)出了微弱的細(xì)胞毒性.通過集成IONP納米顆粒造影劑的高靈敏度和19F MRI探針的優(yōu)良選擇性，同時(shí)實(shí)現(xiàn)T2加權(quán)磁共振信號(hào)增強(qiáng)和19F磁共振信號(hào)的“點(diǎn)亮”.當(dāng)IONP@1被furin酶高表達(dá)的癌細(xì)胞攝取后，在胞內(nèi)GSH和furin酶作用下發(fā)生CBT-Cys點(diǎn)擊縮合反應(yīng)控制IONP@1縮合自組裝，形成IONP聚集物，“點(diǎn)亮”19F MRI信號(hào)并增強(qiáng)T21H MRI信號(hào).經(jīng)GSH處理后的IONP@1的T2值為28.8 ms，而經(jīng)GSH和furin處理后的IONP@1的T2值下降到16.3 ms［圖5（A）］.由于順磁松弛增強(qiáng)（Paramagnetic relaxation enhancement，PRE）效應(yīng)，IONP@1探針最初表現(xiàn)為關(guān)閉的19F MRI信號(hào).furin酶使得探針中的底物片段被剪切，引發(fā)CBT-Cys反應(yīng)，導(dǎo)致IONP聚集體的形成，從而顯著提高了水質(zhì)子的橫向弛豫，該策略在斑馬魚腫瘤中顯示出更強(qiáng)的T2磁共振信號(hào)［圖5（B）］.同時(shí)，由furin激活后，TFMB-RVRR與IONP分離緩解了PRE效應(yīng)，從而開啟19F磁共振信號(hào)；并且通過IONP的聚集，可對(duì)furin酶活性進(jìn)行體外檢測(cè)［圖5（C）和（D）］.該工作通過蛋白酶控制多肽觸發(fā)IONP聚集和PRE效應(yīng)緩解，可以應(yīng)用于精確的1H MRI和19F MRI，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了高選擇性和高靈敏度的腫瘤檢測(cè).

Fig.5 Schematic illustration showing furin-mediated formation of IONP aggregates for enhanced r2 and release of TFMB-Arg-Val-Arg-Arg-OH to“turn on”19F NMR/MRI signal(A),19F NMR spectra recorded for IONP@1 or IONP@1-Scr before or after incubation with GSH,and after co-incubation with GSH followed with furin(B),T2 images of phantoms,and corresponding T2 value of samples in IONP@1 and IONP@1-Scr after treating with GSH,or GSH and furin(C),1H MRI and 19F MRI of the enterocoelia of a healthy zebrafish or tumor-bearing zebrafish using IONP@1 or IONP@1-Scr(D)[54]

4 總結(jié)與展望

本文綜述了酶響應(yīng)多肽自組裝MRI探針在不同磁共振模式（1H MRI，19F MRI和雙自旋核MRI）中的研究進(jìn)展.這些多肽自組裝策略利用能夠被酶激活的多肽結(jié)構(gòu)進(jìn)行原位自組裝，由于腫瘤組織中高表達(dá)的酶具有特異性，使得裝載在多肽上的造影劑分子能夠在特定酶高表達(dá)的區(qū)域聚集，提高造影劑的滯留時(shí)間，在腫瘤區(qū)域?qū)崿F(xiàn)精確和靈敏的MRI造影.多肽自組裝MRI探針具有很高的安全性和靶向性，不僅可以提高磁共振成像質(zhì)量還能夠與藥物、熒光試劑聯(lián)合作用，實(shí)現(xiàn)多功能作用.雖然針對(duì)多肽自組裝MRI探針的研究已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展，但是目前該領(lǐng)域仍存在一些關(guān)鍵問題和挑戰(zhàn)，在此我們給出了相應(yīng)的對(duì)策和發(fā)展方向：（1）多肽本身的生物相容性和生物可降解性很高，但在多肽結(jié)構(gòu)上連接了MRI材料后，其生物安全性仍然需要進(jìn)一步評(píng)估.在后續(xù)的研究中，研究者們應(yīng)進(jìn)一步改進(jìn)多肽的結(jié)構(gòu)和序列，減少毒副作用，增強(qiáng)穩(wěn)定性和在腫瘤細(xì)胞中的富集.（2）腫瘤的內(nèi)源性標(biāo)志物水平和活性可能會(huì)因?yàn)槟[瘤的類型和物種的不同而產(chǎn)生差異.本綜述中涉及到的探針只覆蓋了一小部分的酶標(biāo)志物及腫瘤，臨床上仍有大部分腫瘤類型無法用自組裝型探針識(shí)別出來.因此，仍需要針對(duì)不同的腫瘤，探索出其獨(dú)特的、高度特異性和高表達(dá)的生物標(biāo)志物，以設(shè)計(jì)更多具有高響應(yīng)性的多肽自組裝磁共振探針.（3）為了促進(jìn)研究向臨床的轉(zhuǎn)化，磁共振成像不僅需要注重放大成像信號(hào)，還要注意探針在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)，關(guān)注其生物毒性以及代謝方式.在設(shè)計(jì)探針時(shí)，應(yīng)當(dāng)避免使用重金屬造影劑，盡量選擇臨床上已經(jīng)使用或者確認(rèn)安全的造影劑分子，在最大程度上降低安全風(fēng)險(xiǎn).此外，研究者們也應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格控制給藥劑量，并關(guān)注探針的長期毒副作用，比如生殖毒性和致敏作用等.（4）以多肽-酶為原理的造影劑分子在細(xì)胞中可能會(huì)受到多種因素的影響，為了進(jìn)一步提高成像探針的穩(wěn)定性及抗干擾性，并減少測(cè)試假陽性，研究者們需要不斷優(yōu)化探針的設(shè)計(jì)，如設(shè)計(jì)多酶響應(yīng)探針、增強(qiáng)探針的腫瘤特異性及減少正常細(xì)胞的內(nèi)化等.（5）隨著越來越多的功能分子被開發(fā)出來，多模態(tài)成像成為了未來的腫瘤成像趨勢(shì).如將治療與成像結(jié)合，通過MRI實(shí)時(shí)監(jiān)控臨床療效.在未來的工作中，需要多學(xué)科的研究人員共同推進(jìn)多肽自組裝磁共振材料的開發(fā)和臨床應(yīng)用，從而實(shí)現(xiàn)非侵入性、實(shí)時(shí)、精確、高靈敏度的磁共振腫瘤成像.