近紅外光譜用于注射用復(fù)方甘草酸苷質(zhì)量控制研究

汪義程，郭志永，閆 宇，薛洪寶，*，陳 鵬，宮文武

（1．蚌埠醫(yī)學(xué)院 公共基礎(chǔ)學(xué)院，安徽 蚌埠 233030；2．安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司 生產(chǎn)技術(shù)部，安徽 蚌埠 233045；3．安徽省藥品監(jiān)督管理局第五分局，安徽 蚌埠 233000）

近紅外光的發(fā)現(xiàn)已有兩百余年的歷史，隨著科技的發(fā)展和時(shí)代的進(jìn)步，近紅外光譜（Near infrared spectrum，NIRS）分析技術(shù)在許多行業(yè)中均發(fā)揮著重要作用，特別是在藥物分析領(lǐng)域中的應(yīng)用較為廣泛［1-2］。NIRS在制藥行業(yè)中可用于不同狀態(tài)和不同類型的藥物分析，包括原料藥純度檢測、包裝材料質(zhì)量的監(jiān)測以及對藥品加工全過程和生產(chǎn)工藝進(jìn)行在線連續(xù)分析、監(jiān)控，還可對藥物流通中的劣藥、假藥進(jìn)行鑒別和成分分析。特別是對于一些成分含量較為復(fù)雜的藥品，使用傳統(tǒng)的化學(xué)方法進(jìn)行藥品分析時(shí)程序繁多且耗時(shí)長，而近紅外分析技術(shù)可根據(jù)藥物特性進(jìn)行定性或定量分析，大大提高分析效率。

藥品生產(chǎn)時(shí)的工序一般較為復(fù)雜，要?dú)v經(jīng)混合、加工、成型和包裝等步驟才能完成生產(chǎn)，而要對藥品生產(chǎn)過程中的質(zhì)量進(jìn)行有效的控制，需在藥品加工全過程對所有組分進(jìn)行全面、系統(tǒng)地檢測和分析［3］，這種檢測方法速度慢，效率低，不利于提高企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。近紅外光主要是C—H、O—H、N—H、S—H等含氫基團(tuán)振動(dòng)光譜倍頻及合頻等的吸收光譜，譜帶上不同基團(tuán)的近紅外吸收不同，有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)、組成信息可在譜圖中進(jìn)行顯示［4-5］。近紅外光譜分析技術(shù)是對標(biāo)準(zhǔn)樣品的光譜進(jìn)行采集后，運(yùn)用合適的算法計(jì)算，并建立檢驗(yàn)分析模型，同時(shí)進(jìn)行相關(guān)性驗(yàn)證。當(dāng)檢測樣品時(shí)，用被檢測樣品的圖譜與標(biāo)準(zhǔn)模型進(jìn)行比對和分析，可得到檢測結(jié)果。近紅外光譜具有便捷、無損檢測、測量及結(jié)果傳遞快等特點(diǎn)［6］，避免了液相色譜法和氣相色譜法樣品預(yù)處理復(fù)雜、檢測時(shí)間長、成本高等問題，適合在大規(guī)模生產(chǎn)的情況下對藥品的質(zhì)量進(jìn)行全面監(jiān)控，其在制藥領(lǐng)域的應(yīng)用前景光明，發(fā)展?jié)摿薮螅?］。

本研究通過采集某公司注射用復(fù)方甘草酸苷產(chǎn)品70批次的近紅外光譜圖，基于其中甘氨酸、甘草酸苷、鹽酸半胱氨酸3種組分的含量數(shù)據(jù)，建立了可快速、準(zhǔn)確預(yù)測這3種組分含量的近紅外定量分析模型，優(yōu)化了模型［8］并進(jìn)行了可靠性驗(yàn)證。該方法為復(fù)方甘草酸苷的質(zhì)量控制提供了一種參考方法，有望作為生產(chǎn)過程中產(chǎn)品質(zhì)量控制的輔助手段，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測的全覆蓋，最大限度降低產(chǎn)品質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)，為醫(yī)藥生產(chǎn)企業(yè)創(chuàng)造較高的間接經(jīng)濟(jì)效益。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及樣品

Thermo Antaris Ⅱ近紅外光譜儀（鹵鎢燈光源）；Agilent Technologies分析型高效液相色譜儀（HPLC，1260 Infinity Ⅲ Prime）；Origin8．0專業(yè)函數(shù)繪圖軟件、TQ Analyst光譜分析軟件、SPSS數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件。

樣品為注射用復(fù)方甘草酸苷（標(biāo)示含量規(guī)格（參考值）：每瓶含甘草酸苷40 mg，甘氨酸400 mg，鹽酸半胱氨酸20 mg）凍干粉針劑，由10 mL中性硼硅玻璃管制西林瓶包裝。

1.2 樣品分組

將采集的70批次注射用復(fù)方甘草酸苷樣品的近紅外光譜圖及其中甘氨酸、甘草酸苷、鹽酸半胱氨酸3種組分的含量數(shù)據(jù)作為樣品集，按照校正集與驗(yàn)證集樣品比例4∶1建立分析模型；同時(shí)在保證驗(yàn)證集樣品含量在校正集樣品含量范圍內(nèi)的前提下，選擇校正集樣品和驗(yàn)證集樣品。最終從70批次樣品集中選取13批次作為驗(yàn)證集。校正集樣品中甘氨酸、甘草酸苷、鹽酸半胱氨酸的含量分布范圍分別為：0．23% ～ 4．0%、0．40% ～ 5．1%、0．10% ～ 3．9%；驗(yàn)證集中相應(yīng)為：0．25% ～ 7．2%、0．05% ～ 0．65%、0．05% ～ 1．8%。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理流程見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理流程圖Fig．1 The processing chart of experimental data

2 結(jié)果與討論

2.1 近紅外光譜的采集及譜段選擇

采用積分球漫反射采樣模塊直接掃描測定樣品的NIRS圖譜。光譜采集條件：以儀器內(nèi)置空白背景為參比，用近紅外光譜儀采集所有NIRS及CSV格式的數(shù)據(jù)矩陣；波長范圍10 000 ～ 4 000 cm-1，掃描累加次數(shù)32次，分辨率8 cm-1；分別測定各批樣品，得到3種組分的原始光譜圖（圖2A），其一階和二階導(dǎo)數(shù)光譜圖見圖2B、C。由圖2可見，復(fù)方甘草酸苷中3種組分的譜圖在9 000 ～ 8 200 cm-1和6 700 ～5 000 cm-1范圍內(nèi)存在較大差異。最終選擇8 928．80 ～ 8 776．70 cm-1、6 520．77 ～ 5 134．44 cm-1和8 921．02 ～ 8 411．80 cm-1譜段建立3種組分的定量分析模型。

2.2 模型評價(jià)及預(yù)處理

分別從每個(gè)批次的樣品中隨機(jī)選取2組數(shù)據(jù)，共得到140個(gè)紅外光譜圖作為建模分析用樣本，建立注射用復(fù)方甘草酸苷的偏最小二乘回歸（PLS）［8］定量分析模型。

2.2.1 模型評價(jià)以70批次樣品為標(biāo)準(zhǔn)樣品，隨機(jī)選取兩組樣品作為驗(yàn)證樣品進(jìn)行分析，將分析結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較，根據(jù)窗口中模型參數(shù)選擇，計(jì)算其指標(biāo)特征。其中相關(guān)系數(shù)（R）反映預(yù)測值與參考值的相關(guān)性，該值越高則相關(guān)性越高；校正均方根誤差（RMSEC）、預(yù)測均方根誤差（RMSEP）作為評價(jià)所建定量模型性能的指標(biāo)，其結(jié)果越接近0，說明模型適用性越強(qiáng)，預(yù)測結(jié)果越準(zhǔn)確。根據(jù)以上數(shù)值對模型的預(yù)測效果進(jìn)行綜合評價(jià)。

2.2.2 預(yù)處理方法的選擇光譜預(yù)處理方法有平滑、位移校正、導(dǎo)數(shù)校正、小波變換等，合適的光譜預(yù)處理方法可以有效消除物理因素的干擾，提高NIRS與待測化學(xué)成分的相關(guān)性。不同預(yù)處理方法結(jié)合使用有望得到更好的模型效果［9］，本研究發(fā)現(xiàn)，樣品光譜經(jīng)過一階導(dǎo)數(shù)+S-G（3，3）點(diǎn)平滑處理后，不僅能有效消除光譜漂移和噪音，且8 928．80 ～8 776．70 cm-1、6 520．77 ～ 5 134．44 cm-1和8 921．02 ～8 411．80 cm-1譜段內(nèi)的曲線波動(dòng)明顯，數(shù)據(jù)變異性增強(qiáng)，能夠最大限度地體現(xiàn)不同品種光譜的差別。以該譜段作為特征區(qū)間，考察了全譜段與特征區(qū)間譜段的建模效果。由表1可知，一階導(dǎo)數(shù)分別結(jié)合S-G（3，5）、S-G（3，4）、S-G（3，3）、S-G（3，2）、S-G（3，1）點(diǎn)平滑處理時(shí)的結(jié)果一致，為減小實(shí)驗(yàn)誤差，確保模型的準(zhǔn)確性和可靠性，取中間的S-G（3，3）點(diǎn)平滑結(jié)合一階導(dǎo)數(shù)作為預(yù)處理方法。

2.3 建模結(jié)果及模型驗(yàn)證

2.3.1 建模結(jié)果通過優(yōu)化譜段和選擇不同預(yù)處理方法，并結(jié)合軟件自帶的光譜離群值剔除功能，剔除影響模型建立的樣本［8］，確定最終的建模參數(shù)為：譜圖預(yù)處理選擇一階導(dǎo)數(shù)+S-G（3，3）平滑，譜段分別選擇8 928．80 ～ 8 776．70 cm-1、6 520．77 ～ 5 134．44 cm-1和8 921．02 ～ 8 411．80 cm-1，通過RMSEC對主因子作圖優(yōu)化模型參數(shù)，分別得到甘氨酸、甘草酸苷，鹽酸半胱氨酸3種組分模型的最佳主因子數(shù)為10、3、10，模型相關(guān)系數(shù)（R）分別為0．999 54、0．947 01、0．999 95，RMSEC依次為0．289、0．098 0、0．001 07（表1）。相關(guān)系數(shù)值均接近1，表明預(yù)測值與參考值之間存在良好的相關(guān)性；均方根誤差較小，表明預(yù)測值與參考值之間產(chǎn)生的誤差較小。而模型相關(guān)系數(shù)0．947 01數(shù)值偏離1，可能原因如下：其一，受近紅外檢測限的影響。國際公認(rèn)檢測限為0．1%，若樣品濃度低于該閾值，將導(dǎo)致近紅外模型預(yù)測誤差較大；其二，受建模樣本代表性及數(shù)量的影響。理論上，建模樣本數(shù)量越多，統(tǒng)計(jì)模型可靠性越高，若建模樣本缺乏代表性，將導(dǎo)致化學(xué)性質(zhì)僅分布在一個(gè)很小的區(qū)間內(nèi)，使得該模型不具備廣泛代表性。

2.3.2 模型驗(yàn)證為確認(rèn)所建立的定量模型能適應(yīng)所測樣品，并能對實(shí)際樣品進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測，使用驗(yàn)證集中的13批樣品對所建立的模型進(jìn)行驗(yàn)證。使用驗(yàn)證集的相關(guān)系數(shù)（R）和均方根誤差對模型性能進(jìn)行評估［9］。3種組分驗(yàn)證集的R分別為0．999 34、0．949 00、0．989 23，RMSEP分別為1．86、0．302、0．191，預(yù)測值分別為397．396 2、19．810 0、40．210 8。將模型預(yù)測值與參考值進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，甘氨酸、甘草酸苷、鹽酸半胱氨酸的預(yù)測值與參考值之間的平均相對誤差分別為0．41%、0．72%、0．86%，且預(yù)測值與參考值在95%置信區(qū)間內(nèi)無顯著性差異（P＞ 0．05）。

以未用于建模的16批注射用復(fù)方甘草酸苷樣品及1份不合格樣品作為對照，分別掃描其近紅外光譜圖，利用所建模型預(yù)測其中3種成分的含量，表2為NIRS預(yù)測值與測定值的比較。測定值為各成分的實(shí)際含量［10］，其中，鹽酸半胱氨酸的檢測方法為高效液相色譜法，甘草酸苷為硫代硫酸鈉滴定法，甘氨酸為氫氧化鈉滴定法。由表2可知，測定值間的全譜段匹配度平均值為：鹽酸半胱氨酸99．19%、甘草酸苷99．73%、甘氨酸為98．64%；區(qū)段譜圖匹配度平均值為：鹽酸半胱氨酸為95．28%、甘草酸苷為99．81%、甘氨酸為99．63%；平均誤差率：鹽酸半胱氨酸為-0．37%、甘草酸苷為2．14%、甘氨酸為0．37%。結(jié)果表明，NIRS預(yù)測值與測定值間無顯著性差異，說明所建立的模型可用于注射用復(fù)方甘草酸苷的快速測定［11-13］。

表2 模型預(yù)測值與測定值的比較Table 2 Comparison of predicted values and measurement values

由3種成分的全譜圖匹配度和區(qū)段譜圖匹配度可知，所建模型具有一定的精密度和準(zhǔn)確度，16批樣品的個(gè)體誤差率值較小，均在± 5%以內(nèi)，平均誤差率在± 2．5%以內(nèi)，說明預(yù)測結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性均較高。不合格對照組中鹽酸半胱氨酸和甘草酸苷誤差率為3．13%和3．76%，相對較高，但符合要求；而甘氨酸的誤差率為6．13%，超出5%范圍，定量分析結(jié)果不符合要求。由此可見本定量分析方法模型穩(wěn)定、可靠、精密、準(zhǔn)確，可作為醫(yī)藥生產(chǎn)企業(yè)對注射用復(fù)方甘草酸苷質(zhì)量控制的有效輔助質(zhì)量控制手段。

2.4 討 論

以某公司注射用復(fù)方甘草酸苷產(chǎn)品70批次的質(zhì)量檢驗(yàn)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)建立數(shù)學(xué)模型，由于數(shù)據(jù)采集的時(shí)間跨度較大，儀器穩(wěn)定性、溫度、濕度、樣品含水量、pH值等外部因素存在差異，可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)存在差異，使得后期建模過程存在一些問題。因此，應(yīng)盡量在短時(shí)間內(nèi)采集數(shù)據(jù)，保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和精度。原始光譜是模型建立的基礎(chǔ)，標(biāo)準(zhǔn)樣品組分含量測定的準(zhǔn)確性和精度是影響NIRS定量分析準(zhǔn)確度的最主要因素。光譜采集和數(shù)據(jù)記錄的準(zhǔn)確性也決定了模型的真實(shí)性［14］。其次，建立定量分析鑒別模型是利用樣品的圖譜庫，因此樣本的代表性受圖譜庫大小的影響，并決定了模型的準(zhǔn)確性。一般要求建模的樣品量不少于50批，以降低樣品預(yù)測誤差。

通過選擇光程類型、導(dǎo)數(shù)處理、濾噪、平滑和基線校正等對光譜進(jìn)行預(yù)處理，可以提高模型的穩(wěn)健性。建模過程中，光譜范圍的選擇對模型的建立至關(guān)重要，可避免其它信息對有效光譜信息的干擾，不同建模波段下模型的性能結(jié)果（圖2）顯示，選擇8 928．80 ～ 8 776．70 cm-1、6 520．77 ～ 5 134．44 cm-1和8 921．02 ～ 8 411．80 cm-1譜段得到的3種組分的定量分析模型整體性能較好。因此要根據(jù)長期積累的經(jīng)驗(yàn)和對所分析樣品化學(xué)性質(zhì)的了解選擇合適的譜段建立模型，確保模型的準(zhǔn)確性和專屬性［15］。

NIRS定量分析模型的建立是一個(gè)反復(fù)循環(huán)優(yōu)化的復(fù)雜過程，需要不斷地檢查造成模型精度不合格的原因，并反復(fù)進(jìn)行分析和排除，直至驗(yàn)證結(jié)果滿意。在模型的反復(fù)優(yōu)化過程中，可選擇相關(guān)系數(shù)（R）和均方根誤差（RMSE）作為評價(jià)指標(biāo)對模型的效果進(jìn)行驗(yàn)證和評估［16］。

3 結(jié) 論

本研究建立了注射用復(fù)方甘草酸苷中3種組分的定量分析模型，結(jié)果顯示，該3種組分的預(yù)測值與測定值之間存在良好的相關(guān)性，所建模型穩(wěn)定、可靠，能有效地對未知樣品成分進(jìn)行含量預(yù)測。通過近紅外光譜技術(shù)不僅可實(shí)現(xiàn)注射用復(fù)方甘草酸苷凍干粉針劑生產(chǎn)過程的實(shí)時(shí)監(jiān)控，還可簡化其檢驗(yàn)工序，進(jìn)一步提升檢驗(yàn)精確度，保障注射用復(fù)方甘草酸苷凍干粉針劑的質(zhì)量。