基于高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用方法評價透析器對蛋白結(jié)合類尿毒癥毒素的清除效果

牟倡駿，許 潔，張潔敏，王 磊，王禹峰，江君杰

（山東威高血液凈化制品股份有限公司，山東 威海 264200）

2020年國際腎臟病學會和國際腎臟基金聯(lián)合會公布的一項數(shù)據(jù)顯示，全球約有十分之一的成年人患有慢性腎臟病，預計到2040年該病將成為全世界第五大死亡原因［1］。慢性腎衰竭是其發(fā)展到后期的一種臨床綜合征，主要有腎小球濾過率下降、水電解質(zhì)和酸堿平衡失調(diào)以及代謝產(chǎn)物潴留等臨床表現(xiàn)［2］。這些代謝產(chǎn)物通常稱為尿毒癥毒素，根據(jù)生化特征及清除方式，可分為三大類：小分子物質(zhì)（＜ 500 Da）、中分子物質(zhì)（＞ 500 Da）和蛋白結(jié)合類毒素（PBUTs）［3］。硫酸吲哚酚（IS）、硫酸對甲酚（PCS）和馬尿酸（HA）是PBUTs的主要代表物質(zhì)，它們與心血管疾病和腎功能損傷具有高度相關性，容易誘發(fā)多種并發(fā)癥［4-7］。提高透析器對PBUTs的清除效果，已成為血液凈化領域關注的重點［4］。目前因缺乏簡單有效的PBUTs檢測方法，透析器的清除性能僅通過部分中小分子毒素進行評價，并未將PBUTs作為指標性物質(zhì)［8-9］。因此，建立一種評價透析器對PBUTs清除效果的方法，對于開發(fā)具有高效清除性能的產(chǎn)品，提高透析患者的生存質(zhì)量具有重要意義。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜具有樣品用量少、檢測靈敏度高、定量準確等優(yōu)點［10-11］，已逐漸成為生物樣品分析的主要技術手段［12-13］，被廣泛應用于透析患者血液中PBUTs的定量檢測［14-20］。Prokopienko等［18］建立了一種同時測定患者血清中4種腸源性尿毒癥毒素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。Wang等［20］建立了一種同時測定腹膜透析患者血清中8種PBUTs的超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜方法，醫(yī)生通過患者體內(nèi)PBUTs的濃度評估其發(fā)生并發(fā)癥的可能性，但該方法準確度均較低，HA的準確度只有60%左右。上述文獻報道只是將高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法應用于患者體內(nèi)PBUTs的濃度檢測，在體外評價透析器對PBUTs清除效果方面的應用尚未見報道。

本研究以與透析患者體內(nèi)PBUTs濃度相當?shù)呐Ｑ灏椎鞍姿芤鹤鳛槟M液代替血液，不僅降低了實驗成本，而且有效解決了臨床血液樣品來源困難以及因患者個體差異導致樣品不平行的問題，采用一步沉淀蛋白的前處理方法和高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用檢測技術，建立了一種同時評價透析器對IS、P-CS和HA 3種PBUTs清除效果的分析方法。該方法應用于透析前后模擬液中PBUTs濃度的檢測，3種待測物質(zhì)均可在10 min內(nèi)出峰，具有快速、準確、靈敏等優(yōu)勢，為透析器研發(fā)階段的測試以及臨床處方的選擇提供了技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo Vanquish色譜儀、Thermo TSQ Quantis三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Thermo公司）；DV215CD電子分析天平（美國OHAUS公司）；Centrisart G-16C冷凍離心機（德國Sartorius公司）；Milli-Q10純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；KQ-500DB超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；VORTEX1渦旋振蕩器（德國IKA公司）；超濾離心管（10 kDa，德國Sartorius公司）。

硫酸吲哚酚鹽（97%，美國Sigma公司）；馬尿酸（98%，美國Sigma公司）；硫酸對甲酚鹽（≥ 98%，日本TCI公司）；3-吲哚基硫酸鹽-D4鉀鹽（IS-D4，＞ 95%，百靈威科技有限公司）；乙酸銨、甲醇、乙腈（色譜純，美國Sigma公司）；牛血清白蛋白（廣州蕊特生物科技有限公司）；實驗用水為Milli-Q10超純水機制備的超純水。

1.2 標準溶液的配制

混合標準工作液：精密稱取IS、P-CS、HA標準品各10 mg，分別用甲醇溶解并定容至10 mL，得到質(zhì)量濃度為1 mg∕mL的標準儲備液。分別取上述標準儲備液適量，用水配制成2．5、5．0、10、25、50、75、100 μg∕mL的混合標準工作液，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

內(nèi)標標準儲備液：精密稱取IS-D4標準品2．5 mg，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為1 mg∕mL的儲備液。取上述儲備液適量，用水配制成10 μg∕mL的內(nèi)標工作液，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 模擬液的制備

稱取適量的牛血清白蛋白，用水配制成質(zhì)量濃度為50 g∕L的蛋白水溶液；稱取適量的IS、P-CS、HA標準品加入上述溶液，使其質(zhì)量濃度分別為30、40、50 μg∕mL，37 ℃水浴，磁力攪拌4 h，即得模擬液。同法平行制備12份。

1.4 樣品前處理

參照透析器的臨床使用說明，按照圖1連接透析器、體外循環(huán)血路和透析設備。通過滾壓泵將模擬液引入整個系統(tǒng)，設定模擬液流量（QB）為200 mL∕min，透析液流量（QD）為500 mL∕min，脫水量（QF）為10 mL∕min，循環(huán)10 min后，分別在透析器血液入口和出口處取樣作為待測樣品。

圖1 模擬血液透析示意圖Fig．1 Schematic diagram of simulated hemodialysis

游離蛋白結(jié)合類毒素樣品配制：取200 μL樣品置于超濾離心管（2 mL，10 kDa）中，4 ℃下14 000 r∕min離心10 min；棄去套管，取濾液10 μL，置于2 mL EP管中，加10 μL內(nèi)標工作液和980 μL超純水，渦旋1 min，取10 μL混合溶液上機。

總蛋白結(jié)合類毒素樣品配制：取50 μL樣品加入50 μL水和50 μL內(nèi)標工作液，渦旋1 min，加入350 μL乙腈，渦旋2 min，4 ℃下14 000 r∕min離心10 min；取100 μL上清液，置于2 mL EP管中，加入900 μL水，渦旋1 min，取10 μL混合溶液上機。

1.5 色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD VANQUISH C18（100 mm × 2．1 mm，1．9 μm）；流動相：A為5 mmol∕L乙酸銨溶液，B為甲醇；梯度洗脫：0 ～ 2 min，20% B；2 ～ 8 min，20% ～ 80% B；8 ～ 10 min，80% B；10 ～10．1 min，80% ～ 20% B；10．1 ～ 15 min，20% B。柱溫：30 ℃；流速：0．2 mL∕min；進樣量：10 μL。

1.6 質(zhì)譜條件

Thermo TSQ Quantis三重四極桿質(zhì)譜儀；電噴霧離子源（ESI），噴霧電壓：3 000 V，鞘氣流速：4．58 L∕min，輔氣流速：10．08 L∕min，毛細管溫度：325 ℃，負離子掃描模式，選擇反應監(jiān)測（SRM）；各物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 3種PBUTs的保留時間（RT）與質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention times（RT） and mass spectrometric parameters of 3 PBUTs

2 結(jié)果與討論

2.1 模擬液制備條件的優(yōu)化

本研究選擇含有適量PBUTs的牛血清白蛋白溶液模擬患者血液進行實驗。參照文獻［15］，透析患者體內(nèi)HA的含量最高，其次是P-CS和IS，且質(zhì)量濃度均在30 ～ 50 μg∕mL范圍內(nèi)，因此本實驗配制的模擬液中IS、P-CS和HA的質(zhì)量濃度分別設定為30、40、50 μg∕mL。文獻報道成人血液中白蛋白的質(zhì)量濃度在35 ～ 50 g∕L范圍內(nèi)［21］，為最大程度接近人體血液中PBUTs的蛋白結(jié)合率水平，因此考察了牛血清白蛋白質(zhì)量濃度（40、50 g∕L）和反應時間（2、4、8 h）對IS、P-CS、HA蛋白結(jié)合率的影響。由圖2可知，當牛血清白蛋白質(zhì)量濃度為50 g∕L時，加入IS、P-CS、HA，37 ℃下反應4 h，其蛋白結(jié)合率最接近透析患者血液中的水平（IS、P-CS、HA的蛋白結(jié)合率分別為90%、95%、45%）［15，22］?；谏鲜隹疾?，實驗最終選擇此條件制備模擬液。

圖2 牛血清白蛋白質(zhì)量濃度和反應時間對IS、P-CS、HA蛋白結(jié)合率的影響Fig．2 Effects of concentrations of bovine serum albumin and reaction times on the protein binding rate of IS，P-CS and HA

2.2 前處理條件的優(yōu)化

沉淀蛋白最常用的方法是鹽析法和有機試劑沉淀法［23］。鹽析法會將高濃度不揮發(fā)性的鹽引入樣品中，干擾質(zhì)譜檢測，因此選擇乙腈進行蛋白沉淀處理。本研究進一步比較了樣品稀釋和沉淀的先后順序?qū)z測結(jié)果的影響，結(jié)果表明，先稀釋樣品再經(jīng)乙腈沉淀蛋白后直接上機檢測，干擾峰較多、峰形分叉；而先經(jīng)乙腈沉淀蛋白再用水稀釋后上機檢測，峰形尖銳、干擾少，且IS、P-CS、HA的回收率為97．1% ～ 112%，故選擇后者作為最終的樣品前處理方法。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

分別考察了水-甲醇、水-乙腈、5 mmol∕L乙酸銨-甲醇和5 mmol∕L乙酸銨-乙腈4種流動相體系的分離效果。結(jié)果表明，有機相為乙腈時，其洗脫能力過強，導致待測物的保留時間過于集中，色譜峰不能完全分離。由于3種待測PBUTs是帶有磺酸或羧酸官能團的化合物，在流動相中加入一定量的乙酸銨，可提高待測物的離子化效率，有利于峰形的改善。經(jīng)綜合比較，確定流動相為5 mmol∕L乙酸銨溶液-甲醇，通過優(yōu)化梯度洗脫程序，減少了色譜峰拖尾現(xiàn)象，實現(xiàn)了待測物的快速分離和高信號響應。3種PBUTs和IS-D4的提取離子流色譜圖如圖3所示。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用注射泵方式以5 μL∕min流速將1 μg∕mL的IS、P-CS、HA和IS-D4混合標準溶液注入質(zhì)譜儀。由于待測化合物含有磺酸基或羧基，因此選擇負離子模式進行一級質(zhì)譜Q1全掃描，以確定其母離子；然后進行二級質(zhì)譜掃描，每種化合物選擇2個特征碎片離子分別作為定性和定量離子。3種PBUTs的子離子掃描質(zhì)譜圖見圖4。在SRM監(jiān)測模式下，對各項質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化，使目標分析物的離子信號達到最佳。根據(jù)IS、P-CS、HA和IS-D4的特征碎片離子豐度確定最佳碰撞能量（CE），優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

圖4 3種PBUTs的子離子掃描質(zhì)譜圖Fig．4 Product ion mass spectra of 3 PUBTs

2.5 蛋白結(jié)合率

蛋白結(jié)合率（B%）根據(jù)下式計算：

式中，Cs和Cf分別代表模擬液中溶質(zhì)的總質(zhì)量濃度和游離溶質(zhì)的質(zhì)量濃度（μg∕mL），均由優(yōu)化后的色譜質(zhì)譜條件測得。經(jīng)計算，根據(jù)“1．3”方法所制備的12份模擬液中，IS、P-CS和HA的蛋白結(jié)合率分別為90% ± 3%、93% ± 3%和40% ± 5%，與血液透析患者體內(nèi)的蛋白結(jié)合率基本一致［15，22］。因此，本實驗配制的模擬液可以代替血液進行模擬透析實驗。

2.6 專屬性

將空白模擬液經(jīng)前處理后得到空白模擬液樣品，添加IS、P-CS、HA和IS-D4的混合標準工作液上機測試。結(jié)果顯示，所有目標化合物的峰形尖銳對稱，分離良好；P-CS的保留時間處有干擾物質(zhì)，但該雜質(zhì)的響應低于定量下限20%，不影響定量［24］，其余目標化合物的出峰時間附近無干擾峰，說明該方法具有良好的專屬性。

2.7 線性關系與定量下限

空白模擬液經(jīng)處理后得到空白基質(zhì)溶液，以此溶液稀釋混合標準工作液得到質(zhì)量濃度分別為25、50、100、250、500、750、1 000 ng∕mL的混合標準溶液，IS-D4的質(zhì)量濃度為100 ng∕mL，在優(yōu)化的色譜-質(zhì)譜條件下進行測定，以各待測物和內(nèi)標物的峰面積比值為縱坐標（y），以對應的質(zhì)量濃度為橫坐標（x，ng∕mL）進行線性回歸（加權(quán)系數(shù)1∕x2）。如表2所示，3種PBUTs在25 ～ 1 000 ng∕mL范圍內(nèi)均呈良好線性關系，相關系數(shù)（r）大于0．99。根據(jù)信噪比（S∕N）大于10，確定IS、P-CS、HA的定量下限均為25 ng∕mL。

表2 3種PBUTs的線性范圍、線性方程及相關系數(shù)Table 2 Linear ranges，linear equations and correlation coefficients of 3 PBUTs

2.8 準確度與精密度

為驗證前處理方法對3種PBUTs定量檢測的可靠性，選擇空白基質(zhì)溶液進行低（75 ng∕mL）、中（250 ng∕mL）、高（750 ng∕mL）3個濃度水平的加標回收實驗（n= 3）。其中，中濃度樣品平行配制6份，以相對標準偏差（RSD）作為日內(nèi)精密度；該濃度樣品連續(xù)測定3 d，計算RSD，作為日間精密度，結(jié)果見表3。3種PBUTs的平均回收率為92．5% ～ 114%，日內(nèi)、日間RSD為1．6% ～ 3．5%，本方法的準確度和精密度均滿足實際樣品分析要求，可用于透析前后模擬液中PBUTs的定量檢測。

2.9 基質(zhì)效應

當采用質(zhì)譜方法檢測生物樣品時，常出現(xiàn)較嚴重的基質(zhì)干擾，因此應考察基質(zhì)效應。以超純水配制的IS、P-CS和HA混合標準溶液作為溶劑樣品；空白基質(zhì)配制的IS、P-CS和HA混合標準溶液作為基質(zhì)樣品；將IS、P-CS和HA混合標準溶液加入空白模擬液進行處理后得到的樣品溶液作為處理樣品。將上述樣品的響應值（A）進行比較，基質(zhì)效應（ME） =A基質(zhì)樣品∕A溶劑樣品× 100%，提取回收率 =A處理樣品∕A基質(zhì)樣品×100%，結(jié)果如表3所示。IS、P-CS和HA的基質(zhì)效應為80．6% ～ 105%，提取回收率為95．0% ～ 113%，表明基質(zhì)不影響PBUTs的檢測，可以滿足測定要求。

表3 3種PBUTs的回收率、相對標準偏差、基質(zhì)效應和提取回收率Table 3 Recoveries，relative standard deviations，matrix effects and extraction recoveries of 3 PBUTs

2.10 實際樣品分析

選取12支市售的同一規(guī)格高通量透析器進行透析模擬實驗，采用本方法對透析前后模擬液中PBUTs的濃度進行測定，根據(jù)測定結(jié)果計算清除率。結(jié)果顯示，3種PBUTs的清除率平行性均較好，RSD小于10%。表明該方法能夠快速、準確地評估透析器對PBUTs的清除效果。

3 結(jié) 論

本文基于高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術，以含有適當濃度PBUTs的牛血清白蛋白水溶液作為模擬液，采用有機溶劑沉淀蛋白和超濾離心前處理方法，建立了可同時評價透析器對3種PBUTs清除效果的方法。該方法前處理簡單、成本低廉、回收率高、重復性好，一次測定即可完成透析器對3種PBUTs清除效果的評價，可為血液凈化行業(yè)研發(fā)具有高效清除性能的透析器提供技術支持。