胚胎種植前遺傳學(xué)檢測助孕妊娠結(jié)局的影響因素研究

王博雅 ，何英明 ，薛吟霜 ，向卉芬 ，5*

植入前遺傳學(xué)檢測（preimplantation genetic testing，PGT）是以體外受精-胚胎移植（in vitro fertilizationembryo transfer，IVF-ET）為基礎(chǔ)，在胚胎植入前從獲得的囊胚中取出3～8個細胞，對其進行活檢和遺傳學(xué)診斷，篩選正常胚胎植入子宮，從而提高胎兒健康概率的一種孕前診斷技術(shù)。1990年HANDYSIDE等［1］報道了人類第1例PGT嬰兒的出生。隨后，在臨床輔助生殖領(lǐng)域PGT扮演了重要的角色。隨著PGT技術(shù)在人類輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）中的應(yīng)用越來越多，全球范圍內(nèi)應(yīng)用該技術(shù)治療不孕不育的患者逐漸增多。胚胎異常（基因或染色體結(jié)構(gòu)異常）是導(dǎo)致種植失敗及流產(chǎn)比較公認的原因之一［2］。然而經(jīng)PGT篩選后的正常胚胎仍有可能出現(xiàn)種植失敗，其原因目前并沒有形成統(tǒng)一的結(jié)論。因此本研究回顧性分析了行PGT治療患者的一般資料及輔助檢查結(jié)果、促排卵及體外胚胎發(fā)育情況，以探討影響PGT患者種植失敗及流產(chǎn)的危險因素，為降低PGT患者種植失敗率及流產(chǎn)率提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性分析2018年12月至2021年2月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心行PGT助孕的329例患者的臨床資料。根據(jù)患者是否臨床妊娠分為臨床妊娠組（218例）和種植失敗組（111例），臨床妊娠率66.26%（218/329）。其中臨床妊娠組再根據(jù)妊娠結(jié)局分為活產(chǎn)亞組（175例）和流產(chǎn)亞組（43例），流產(chǎn)率19.72%（43/218）。

診斷標準：（1）臨床妊娠診斷標準，IVF-ET術(shù)后5周行陰道超聲檢查，若宮腔內(nèi)可見孕囊則診斷為臨床妊娠；（2）流產(chǎn)診斷標準，妊娠不足28周、胎兒體質(zhì)量不足1 000 g而終止妊娠者診斷為流產(chǎn)。

本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準（審批號：20200838）。所有患者對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 研究方法 患者應(yīng)用促排方案前禁食8 h以上，次日清晨于本中心測量身高、體質(zhì)量，并計算體質(zhì)指數(shù)（body mass index，BMI）。患者應(yīng)用促排方案前分別于月經(jīng)第2～3天及非月經(jīng)期空腹抽取靜脈血，測定各項生化指標，包括基礎(chǔ)卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、基礎(chǔ)黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）、空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）、 糖 類 抗 原 125（carbohydrate antigen 125，CA125）、25羥維生素D〔25-hydroxyvitamin D，25-（OH）D〕。

1.3 促排方案及PGT技術(shù) 患者均采用控制性促排卵方案，陰道超聲提示卵泡有1個直徑≥18 mm或2個直徑≥17 mm或3個直徑≥16 mm時注射10 000 U人絨毛膜促性腺激素（HCG，珠海麗珠），36 h后行超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵術(shù)。取卵后4～6 h行卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射。受精卵體外培養(yǎng)5～6 d至囊胚階段，抽取3～8個滋養(yǎng)層細胞活檢，活檢的囊胚進行玻璃化冷凍。應(yīng)用微陣列比較基因組雜交技術(shù)或高通量測序分析染色體情況［3］。

1.4 胚胎移植 患者月經(jīng)第2～5天予以補佳樂2 mg（德國拜耳），2次/d，口服。當陰道超聲監(jiān)測到內(nèi)膜厚度≥8 mm 時，予以黃體酮60 mg，1次/d，肌肉注射轉(zhuǎn)化內(nèi)膜。5 d后胚胎解凍移植1枚PGT檢測結(jié)果正?；蚱胶庑偷呐咛ィㄖ甘芫阎?條不同源的染色體各發(fā)生斷裂后，互相變位重接而形成兩條結(jié)構(gòu)上重排的染色體，這種易位大多數(shù)保留了原有基因總數(shù)，對基因作用和個體發(fā)育一般無嚴重影響）。

1.5 觀察指標 分別比較臨床妊娠組與種植失敗組以及活產(chǎn)亞組與流產(chǎn)亞組的臨床資料，包括年齡、BMI、不孕年限、不孕因素、既往流產(chǎn)次數(shù)（分為＜2次和≥2次）、內(nèi)膜厚度、基礎(chǔ)FSH、基礎(chǔ)LH、LH/FSH、TSH、TC、TG、HDL-C、LDL-C、FINS、FPG、CA125、25-（OH）D等一般情況，及促排卵、胚胎發(fā)育情況，包括促性腺激素藥物（gonadotropins，Gn）天數(shù)、Gn用量、第2次減數(shù)分裂中期（MII）卵率（MII卵數(shù)/取卵數(shù)）、受精率（受精數(shù)/MII卵數(shù)）、卵裂率（卵裂數(shù)/受精數(shù)）、D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、胚胎活檢正常率（活檢胚胎正常個數(shù)/活檢胚胎總數(shù)）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗；計數(shù)資料以相對數(shù)表示，兩組間比較采用χ2檢驗；將單因素分析中P＜0.1的變量納入多因素Logistic回歸分析探討PGT患者發(fā)生種植失敗及流產(chǎn)的影響因素；繪制受試者工作特征（ROC）曲線探討多因素Logistic回歸分析篩選出的危險因素對PGT患者發(fā)生種植失敗及流產(chǎn)的預(yù)測價值，并計算靈敏度、特異度、約登指數(shù)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床妊娠組和種植失敗組患者臨床資料比較 種植失敗組年齡、BMI、既往流產(chǎn)次數(shù)≥2次占比、TG水平高于臨床妊娠組，HDL-C水平、D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)低于臨床妊娠組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。兩組患者不孕年限、不孕因素占比、內(nèi)膜厚度、基礎(chǔ)FSH、基 礎(chǔ) LH、LH/FSH、TSH、TC、LDL-C、FINS、FPG、CA125、25-（OH）D、Gn天數(shù)、Gn用量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。臨床妊娠組MII卵率83.00%（3 311/3 989），受精率81.55%（2 700/3 311），卵裂率95.30%（2 573/2 700），胚胎活檢正常率33.33%（472/1 416）；種植失敗組MII卵率81.93%（1 600/1 953），受精率83.19%（1 331/1 600），卵裂率91.96%（1 224/1 331），胚胎活檢正常率31.04%（219/625）；兩組MII卵率、受精率、卵裂率、胚胎活檢率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

效果分為顯效、有效以及無效3個等級，顯效是指患者治療后的臨床癥狀明顯改善，透析過程中無低血壓發(fā)生；有效是指患者的臨床癥狀有所緩解，收縮壓在透析的過程中基本正常；無效則為患者在治療的過程中臨床癥狀和體征無明顯好轉(zhuǎn)，并出現(xiàn)低血壓[5]。

表1 臨床妊娠組與種植失敗組患者臨床資料比較Table 1 Clinical data and examination findings in women with clinical pregnancy and implantation failure after preimplantation genetic testing assisted reproduction

2.2 活產(chǎn)亞組和流產(chǎn)亞組臨床資料比較 流產(chǎn)亞組患者既往流產(chǎn)次數(shù)≥2次占比以及FINS水平高于活產(chǎn)亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。兩組年齡、BMI、不孕年限、不孕因素占比、內(nèi)膜厚度、基礎(chǔ)FSH、基礎(chǔ) LH、LH/FSH、TSH、TC、TG、HDL-C、LDL-C、FPG、CA125、25-（OH）D、Gn天 數(shù)、Gn用 量、D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2?；町a(chǎn)亞組MII卵率82.97%（2 679/3 229），受精率81.56%（2 185/ 2 679），卵裂率95.10%（2 078/2 185），胚胎活檢正常率35.32%（403/1 141）；流產(chǎn)亞組MII卵率83.16%（632/760），受精率81.49%（515/632），卵裂率96.12%（495/515），胚胎活檢正常率25.09%（69/275）；兩組MII卵率、受精率、卵裂率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），活產(chǎn)亞組胚胎活檢正常率高于流產(chǎn)亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 活產(chǎn)亞組與流產(chǎn)亞組患者臨床資料比較Table 2 Clinical data in the live birth subgroup and abortion subgroup

2.3 PGT患者種植失敗的影響因素分析 以臨床妊娠結(jié)局（賦值：種植失敗=0，臨床妊娠=1）為因變量，以單因素分析中P＜0.1的變量（既往流產(chǎn)次數(shù)賦值：＜2次 =0，≥ 2次 =1；年齡、BMI、TG、HDL-L、Gn用量、D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)均為實測值）為自變量，納入多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，低Gn用量是PGT患者種植失敗的保護性因素（P＜0.05），既往流產(chǎn)次數(shù)≥2次和低HDL-C水平是PGT患者種植失敗的危險因素（P＜0.05），見表3。

表3 PGT患者種植失敗影響因素的多因素Logistic回歸分析Table 3 Multivariate Logistic regression analysis of risk factors for implantation failure after preimplantation genetic testing assisted reproduction

2.4 PGT患者流產(chǎn)的影響因素分析 以活產(chǎn)結(jié)局（賦值：流產(chǎn)=0，活產(chǎn)=1）為因變量，以單因素分析中P＜0.1的變量（既往流產(chǎn)次數(shù)賦值：＜2次=0，≥2次=1；FINS、胚胎活檢正常率均為實測值）為自變量納入多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，低FINS水平是PGT患者流產(chǎn)的保護因素（P＜0.05），既往流產(chǎn)次數(shù)≥2次和低胚胎活檢正常率是PGT患者流產(chǎn)的危險因素（P＜0.05），見表4。

表4 PGT患者流產(chǎn)影響因素的多因素Logistic回歸分析Table 4 Independent risk factors for live birth outcomes identified by multivariate logistic regression analysis

2.5 既往流產(chǎn)次數(shù)≥2次，HDL-C水平、Gn用量對PGT患者發(fā)生種植失敗的預(yù)測價值 繪制既往流產(chǎn)次數(shù)≥2次，HDL-C水平以及Gn用量預(yù)測PGT患者發(fā)生種植失敗的ROC曲線，結(jié)果顯示，既往流產(chǎn)次數(shù)≥2次、HDL-C水平以及Gn用量預(yù)測PGT患者發(fā)生種植失敗的曲線下面積（AUC）分別為0.650、0.579、0.561，靈敏度分別為70.3%、33.3%、60.4%，特異度分別為59.6%、80.3%、56.9%，約登指數(shù)分別為0.299、0.136、0.173，見圖1。

圖1 既往流產(chǎn)次數(shù)≥2次、HLD、Gn用量預(yù)測PGT患者發(fā)生種植失敗的ROC曲線Figure 1 ROC curves of two or more previous abortions，serum HDL-C level，and dosage of Gn for predicting implantation failure after preimplantation genetic testing assisted reproduction

2.6 既往流產(chǎn)次數(shù)≥2次、FINS水平以及胚胎活檢正常率對PGT患者發(fā)生流產(chǎn)的預(yù)測價值 繪制既往流產(chǎn)次數(shù)≥2次、FINS水平以及胚胎活檢正常率預(yù)測PGT患者發(fā)生流產(chǎn)的ROC曲線，結(jié)果顯示，既往流產(chǎn)次數(shù)≥2次、FINS水平以及胚胎活檢正常率預(yù)測PGT患者發(fā)生流產(chǎn)的AUC分別為0.648、0.629、0.641，靈敏度分別為66.2%、72.1%、65.1%，特異度分別為63.4%、52.6%、60.6%，約登指數(shù)分別為0.296、0.247、0.257，見圖2。

圖2 既往流產(chǎn)次數(shù)≥2次、FINS、活檢正常率預(yù)測PGT患者發(fā)生流產(chǎn)的ROC曲線Figure 2 ROC curves of two or more previous abortions，fasting insulin level，and normal rate of embryo biopsy for predicting abortion after preimplantation genetic testing assisted reproduction

3 討論

PGT是一種與體外受精相結(jié)合的方法，可在胚胎移植至母體之前檢測胚胎中基因情況。因此，PGT技術(shù)可以確保被移植的胚胎沒有可檢測到的遺傳畸變。隨著該技術(shù)近年來的發(fā)展，將PGT分為PGT-M、PGT-A、PGT-SR 3種，PGT-M可以用來檢測胚胎植入前單基因遺傳病，可以識別胚胎中家族攜帶的致病突變，并移植沒有這種致病突變的胚胎，有效降低后代出現(xiàn)相關(guān)遺傳疾病的發(fā)生率；PGT-A可以檢測胚胎植入前染色體非整倍體，可以篩選出胚胎中染色體正常的胚胎，移植至母體可以有效降低流產(chǎn)、異常妊娠和植入失敗的風(fēng)險；PGT-SR檢測胚胎植入前染色體結(jié)構(gòu)異常，主要應(yīng)用于染色體疾病的檢測，包括染色體整倍體或非整倍體的數(shù)目異常，如克氏綜合征（47，XXY）、21-三體綜合征（47，XN，+21）等，以及缺失、重復(fù)、易位、倒位的染色體結(jié)構(gòu)異常。PGT技術(shù)具有極高的準確性和穩(wěn)定性［4］。本研究分析了PGT患者的一般情況促排卵及體外胚胎發(fā)育情況后發(fā)現(xiàn)，低Gn用量是PGT患者種植失敗的保護性因素，既往流產(chǎn)次數(shù)≥2次、HDL-C低是PGT患者種植失敗的危險因素。低FINS是PGT患者流產(chǎn)的保護性因素，既往流產(chǎn)次數(shù)≥2次、低活檢正常率是PGT患者流產(chǎn)的危險因素。

有不良妊娠史的患者應(yīng)用PGT技術(shù)的治療效果尚未形成統(tǒng)一定論。有研究表明，應(yīng)用PGT技術(shù)可以改善既往流產(chǎn)次數(shù)≥2次患者的妊娠結(jié)局，降低流產(chǎn)率及出生缺陷的風(fēng)險［5］。而最新的一項臨床隨機對照試驗表明，PGT并不能提高由于胚胎異常及反復(fù)植入失敗導(dǎo)致的反復(fù)妊娠丟失（既往流產(chǎn)次數(shù)≥2次）患者的胚胎活產(chǎn)率［6］。本研究結(jié)果顯示，臨床妊娠組與種植失敗組以及活產(chǎn)組與流產(chǎn)組在既往流產(chǎn)次數(shù)≥2次的占比中存在差異，既往流產(chǎn)次數(shù)≥2次是PGT患者發(fā)生種植失敗及流產(chǎn)的危險因素，既往流產(chǎn)次數(shù)≥2次預(yù)測PGT患者發(fā)生種植失敗及流產(chǎn)的AUC分別為0.650、0.648，靈敏度分別為70.3%、66.2%，特異度分別為59.6%、63.4%，約登指數(shù)為0.299、0.296。PGT可以篩選優(yōu)質(zhì)胚胎移植入子宮，但不良妊娠史導(dǎo)致子宮內(nèi)膜基底層損傷、蛻膜發(fā)育不良、胚胎著床異常、胎盤灌注不足等，最終依然可能導(dǎo)致再次妊娠失敗或流產(chǎn)［7-8］。

本研究結(jié)果顯示，種植失敗組Gn用量高于臨床妊娠組，低Gn用量是PGT患者發(fā)生種植失敗的保護性因素，Gn用量預(yù)測PGT患者發(fā)生種植失敗的AUC為0.561，靈敏度為60.4%，特異度為56.9%，約登指數(shù)為0.173。有研究表明，應(yīng)用大劑量Gn會對卵泡顆粒細胞、卵母細胞造成損害，導(dǎo)致流產(chǎn)率升高，臨床妊娠率和活產(chǎn)率下降［9］；但也有研究標明，高齡患者對Gn的敏感性有所下降，獲得卵子更加困難，需要相應(yīng)的增加促排卵期Gn用量［10］，同時增加Gn用量可以獲得更高比例形態(tài)、質(zhì)量較好的胚胎［11］。本研究結(jié)果顯示種植失敗組年齡高于臨床妊娠組，且種植失敗組Gn用量高于臨床妊娠組，高齡患者應(yīng)用Gn劑量高、流產(chǎn)率高，可能是患者年齡較高所致，并不能說明患者應(yīng)用高劑量Gn是導(dǎo)致種植失敗的原因。雖然基礎(chǔ)研究證實，高劑量Gn會損傷卵母細胞［9］，但臨床上為獲得數(shù)量更多的卵子而采取應(yīng)用高劑量Gn，適當應(yīng)用高劑量Gn對于患者“利大于弊”。因此，應(yīng)用高劑量外源性Gn對于輔助生殖結(jié)局的影響目前仍有討論空間，需要更多的臨床資料及基礎(chǔ)研究進一步探索。

臨床工作中，通過檢測TC、TG、LDL-C、HDL-C的水平來反應(yīng)患者血脂代謝情況，以上任何一種指標出現(xiàn)異常均稱為血脂異常［12］。有研究指出，在細胞線粒體內(nèi)，脂質(zhì)水解產(chǎn)生ATP為卵母細胞和胚胎發(fā)育提供能量［13］。血脂異常會直接或者間接損害卵母細胞和胚胎，最終導(dǎo)致不良的妊娠結(jié)局［14］。本研究結(jié)果顯示，臨床妊娠組與種植失敗組的HDL-C存在明顯差異，低HDL-C水平是PGT患者發(fā)生種植失敗的危險因素。HDL-C預(yù)測PGT患者發(fā)生種植失敗的AUC為0.579，靈敏度為33.3%，特異度為80.3%，約登指數(shù)為0.136。相較于臨床妊娠組，種植失敗組患者的HDL-C更低。研究發(fā)現(xiàn)，卵泡液中HDL-C及其組成成分載脂蛋白A1對人類早期胚胎發(fā)育起保護作用［15］。HDL-C是復(fù)雜的多功能蛋白復(fù)合體，針對其研究多數(shù)在心血管方向，而HDL-C在生殖領(lǐng)域的研究相對匱乏。本研究為HDL-C在生殖領(lǐng)域的研究提供了參考依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，活產(chǎn)亞組與流產(chǎn)亞組的FINS水平存在統(tǒng)計學(xué)差異，低FINS水平是PGT患者發(fā)生流產(chǎn)的保護性因素，F(xiàn)INS預(yù)測PGT患者發(fā)生種植失敗的AUC為0.629，靈敏度為72.1%，特異度為52.6%，約登指數(shù)為0.247。相較于活產(chǎn)組，流產(chǎn)組FINS水平更高。研究表明，高胰島素血癥和胰島素抵抗的女性生育能力降低［16］。多項研究發(fā)現(xiàn)，高胰島素血癥患者的胚胎植入能力降低，胚胎植入后流產(chǎn)率高［17-19］，本文結(jié)果與之一致。在分子層面，胰島素水平較高，胚胎著床部位和子宮內(nèi)膜蛻膜標志物內(nèi)膜泌乳素和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2、子宮內(nèi)膜容受性、孕激素受體的數(shù)量明顯減少。胰島素水平升高損害了小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化，破壞了在子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中細胞增殖和凋亡之間的平衡［20］。因此，應(yīng)嚴密監(jiān)測PGD患者孕前FINS情況，必要時及時干預(yù)，以增加活產(chǎn)的成功率。

在IVF-ET過程中，胚胎染色體異常目前仍是導(dǎo)致胚胎質(zhì)量下降的關(guān)鍵因素，受精時，胚胎質(zhì)量降低可導(dǎo)致卵母細胞在減數(shù)分裂過程中發(fā)生錯誤，導(dǎo)致胚胎種植失敗、胚胎停滯發(fā)育最終導(dǎo)致流產(chǎn)［21］。本研究結(jié)果顯示，相較于活產(chǎn)亞組，流產(chǎn)亞組胚胎活檢正常率更低；胚胎活檢正常率是PGT患者發(fā)生流產(chǎn)的危險因素；胚胎活檢正常率預(yù)測PGT患者發(fā)生流產(chǎn)的AUC為0.641，靈敏度為65.1%，特異度為60.6%，約登指數(shù)為0.257。研究表明，女性高齡［22］以及雙方染色體異常［23］等多種因素會降低胚胎活檢正常率，但并未具體闡明胚胎活檢正常率對臨床評估妊娠結(jié)局的應(yīng)用價值。本研究納入了行PGT檢測的IVF-ET患者，分析發(fā)現(xiàn)胚胎活檢正常率與活產(chǎn)結(jié)局的相關(guān)性與預(yù)測活產(chǎn)結(jié)局的臨床價值，為臨床診治患者提供參考依據(jù)。

綜上所述，既往流產(chǎn)次數(shù)≥2次、HDL-C的水平、Gn用量是PGT患者種植失敗的影響因素且對PGT患者種植失敗的發(fā)生有一定的預(yù)測價值；既往流產(chǎn)次數(shù)≥2次、FINS的水平、胚胎活檢正常率是PGT患者流產(chǎn)的影響因素且對PGT患者流產(chǎn)的發(fā)生有一定預(yù)測價值。于種植胚胎前監(jiān)測上述指標，對PGT患者制定合理個性化的用藥方案，提高臨床妊娠率及活產(chǎn)率，有一定參考意義。本研究的樣本數(shù)據(jù)非多中心系統(tǒng)性調(diào)查，故存在病例選擇的偏倚及信息偏倚，本課題組正積極與全國各中心交流合作，后續(xù)將進一步擴大樣本并驗證本研究結(jié)果。

作者貢獻：王博雅負責(zé)文章的構(gòu)思、研究的設(shè)計、撰寫論文；王博雅、何英明、薛吟霜負責(zé)文獻、患者資料的收集、數(shù)據(jù)收集與整理；王博雅、何英明進行結(jié)果的分析與解釋；向卉芬對文章整體負責(zé)，負責(zé)論文的可行性分析、修訂、文章的審查及監(jiān)督。

本文無利益沖突。