植物源天然產(chǎn)物中綠原酸提取方法的研究進展

賈 娟，宋安琪，王婷婷，李艷秋

（1.河南工業(yè)大學 漯河工學院，河南 漯河 462002；2.漯河職業(yè)技術(shù)學院，河南 漯河 462002；3.河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001）

0 引言

天然產(chǎn)物是指從存在于自然界中的生物體內(nèi)經(jīng)分離、提取得到的有機化合物，包括植物、動物和微生物體內(nèi)的組成成分或其代謝產(chǎn)物，以及人和動物體內(nèi)許多內(nèi)源性的化學成分[1-2]。按照來源可分為3 類：植物源、動物源、微生物源，其中大部分來源于植物，藥用植物更是天然產(chǎn)物最重要的來源[3]。在種植方面，由于我國國土遼闊，經(jīng)緯度跨幅大，土地類型多樣，大部分處于溫帶和亞熱帶，氣候適宜，所以除生長條件特殊的植物外基本都可在國內(nèi)種植栽培。

來源于植物界天然產(chǎn)物中的有效成分主要有綠原酸、黃酮類、環(huán)烯醚萜類、木脂素類、生物堿類、皂苷類等。其中，綠原酸是由咖啡酸和奎尼酸合成具有不飽和雙鍵的脂類化合物[4]。目前，綠原酸的主要商業(yè)來源是植物類材料的提取物，如杜仲科植物，忍冬科植物及菊科植物，在杜仲葉、蒲公英、山銀花、金銀花、煙葉中含量較高[5]。綠原酸具有抗菌抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、降血糖血脂、抗紫外光與輻射等生理功能[6]，廣泛應(yīng)用于食品、藥品和保健品中。黃酮類化合物，又名生物類黃酮，是大量存在于自然界植物中的一類天然活性成分，屬多酚類化合物中的一個亞類[7]，具有抗氧化、保護心血管、增強免疫力、護肝保肝等藥理作用[8]。環(huán)烯醚萜類化合物為單萜化合物，廣泛存在于自然界中，具有抗氧化，抗癌，防衰老、保護心臟、降血糖等藥理作用[9]。木脂素類化合物是一種復雜的天然酚類聚合物，是自然界有機資源中除纖維素外含量最豐富的芳香族化合物，具有抗氧化、抗菌、降低血清膽固醇等藥理作用[10]。生物堿類化合物是一種主要存在于植物中的一類含氮化合物，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等生物活性[11]。皂苷是一種結(jié)構(gòu)較復雜由皂苷元與糖構(gòu)成的化合物，主要存在于陸地高等植物中，具有延緩衰老、抗腫瘤、改善記憶力與學習能力、增強免疫力等藥理作用[12]。

1 植物源天然產(chǎn)物中綠原酸的提取

綠原酸的提取方法較多，包括一些傳統(tǒng)方法和新興方法，如水提法、回流提取法、超聲提取法、微波輔助提取法、酶法、酶解-超聲組合法、超臨界萃取法等[13]。

1.1 水提法

水提法又稱煎煮法，是一種將樣品加水浸沒，加熱煮沸一定時間后，分離浸出液，多次循環(huán)加熱水煮樣品，最后合并浸出液的方法。這是一種非常傳統(tǒng)古老且延續(xù)至今的方法。使用該法進行提取，得出的浸出液成分復雜，比較黏稠，過濾困難，不利于精制。并且要求提取的目標物能溶于水，對溫度、濕度均穩(wěn)定適應(yīng)。雖然相較于后續(xù)接連出現(xiàn)的新提取方法，如微波輔助提取法、回流提取法、超聲提取法等，該法的提取率確實不高，但此法卻可以避免產(chǎn)生有機溶劑的污染，保護生態(tài)環(huán)境。李玉山等人[14]分別采用水提法和醇提法對杜仲葉中的綠原酸進行提取，2 種方法經(jīng)試驗優(yōu)化后確定最佳試驗條件，水提法最優(yōu)工藝為提取溫度60 ℃，料液比1∶10，提取時間1.5 h，提取次數(shù)2 次，提取率達4.22%；醇提法最優(yōu)工藝為料液比1∶15，乙醇體積分數(shù)30%。提取時間2 h，提取次數(shù)2 次，提取率達4.41%。結(jié)果顯示，雖然醇提法的提取率確實優(yōu)于水提法，但優(yōu)勢不大，且醇提法所費時間更長，用料更多。從李玉山等人的試驗數(shù)據(jù)來看，水提法更優(yōu)。劉欣等人[15]也分別采用了水提法和醇提法對山銀花中的綠原酸進行提取，經(jīng)優(yōu)化得出最佳工藝條件后，水提法的提取率可以達到4.51%高于醇提法的3.14%。

綜合以上2 篇論文研究結(jié)論來看，在提取綠原酸上，水提法優(yōu)于醇提法，可能是因為綠原酸是一種水溶性較好的有機物，再者水提法幾乎不需要消耗藥品，簡單環(huán)保，所以在實驗室條件只能二選一時，推薦使用水提法。

1.2 回流提取法

回流提取法是指采用加熱回流裝置，用易揮發(fā)的有機溶劑（如乙醇）提取樣品成分，溶劑加熱餾出后經(jīng)冷凝管冷凝，又流回容器中浸提原料，如此往復，直至提取完全的方法。回流法屬于較傳統(tǒng)的提取方法。該方法的缺點是提取出來的綠原酸損失過大，質(zhì)量不純，而且耗費的時間長，不適用于提取受熱易分解的物質(zhì)，但操作簡單，提取效率高于冷浸法。楊小峰[16]采用回流法提取蘋果中的綠原酸，進行試驗優(yōu)化后，最終到的最優(yōu)工藝為提取時間112.2 min，料液比1∶11，乙醇體積分數(shù)67%，此條件下得到的綠原酸最大提取量，可達2.780 mg/g。楊憲文等人[17]采用回流法提取忍冬藤莖葉中的綠原酸，最優(yōu)工藝為回流溫度80 ℃，料液比1∶12，乙醇體積分數(shù)80%，提取率可達1.752%。李澤昱等人[18]采用水提法和回流提取法提取金銀花中的綠原酸，水提法提取綠原酸的得率達到2.6%，而回流法提取綠原酸的得率可達7.2%。

文獻中可看出在提取綠原酸時，回流法所用的時間和水提法差不多，溫度比水提法稍高，應(yīng)該是試驗方法本身差異導致的。單從提取率來說，回流法遠優(yōu)于水提法，如果不考慮溶劑消耗和提取質(zhì)量，回流法是較好的選擇。

1.3 超聲波提取法

超聲波提取法是利用超聲波的空化、機械和熱效應(yīng)破壞細胞結(jié)構(gòu)，使細胞內(nèi)物質(zhì)加速釋出和溶解，有效提高提取效率的方法。一般情況下，超聲波提取法比回流法提取的時間短，溶劑損失較少，提取效率較高。尹青等人[19]通過超聲波法提取蒲公英中綠原酸的試驗證實了超聲波提取法優(yōu)于乙醇回流法，前者所費時間更短，提取效率更高，對有效成分的破壞更低。并且經(jīng)過試驗優(yōu)化確定了最佳工藝為乙醇體積分數(shù)60%，料液比1∶14，pH 值為2，提取溫度50 ℃，提取時間50 min，提取率可達60%以上。吳紅艷等人[20]使用甲醇溶液作為綠原酸提取劑提取杜仲葉中的綠原酸，經(jīng)試驗后得出各因素對提取率的影響效應(yīng)為甲醇體積分數(shù)＞提取時間＞超聲波功率，在甲醇體積分數(shù)70%，提取時間75 min，提取溫度40 ℃，超聲功率270 W 的最優(yōu)提取條件下，綠原酸的提取率可達2.529%。采用超聲波法提取山楂葉中的酚類化合物，包括綠原酸、側(cè)柏苷、蘆丁、金絲桃苷等，經(jīng)過設(shè)計及優(yōu)化得出的收率，與傳統(tǒng)浸出法和熱回流提取法相比，超聲波法提取效率較高[21]。

以上比較試驗用科學的數(shù)據(jù)證實了超聲波法與傳統(tǒng)方法不需要過高的提取溫度和過長的提取時間，就可以實現(xiàn)高的提取率和提取純度。

1.4 微波輔助提取法

微波輔助提取法是利用電磁波將成分與基體分離，且有效保持提取物的原本狀態(tài)的一種方法。此方法提取時間短操作簡單、快速有效。童玲等人[22]經(jīng)正交試驗得出乙醇體積分數(shù)60%，料液比1∶50，輻射時間2 min，微波壓力2 atm 為最優(yōu)微波提取條件，杜仲葉中的綠原酸提取率可達26.4%。黃榮等人[23]以聚二乙醇（PEG-200）為提取液，采用微波輔助法提取金銀花葉中的綠原酸，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化試驗得出最佳工藝條件為聚二乙醇體積分數(shù)40%，料液比1∶20，微波時間70 s，微波功率350 W，提取溫度82 ℃，提取時間24 min，提取率達5.87%。劉志平等人[24]同樣采用微波法提取金銀花中的綠原酸，提取液改成乙醇溶液，經(jīng)試驗優(yōu)化后得出最佳提取工藝為乙醇體積分數(shù)40%，料液比1∶15，提取2×60 s 次，提取率得7.065%。

從黃榮和劉志平的2 組試驗數(shù)據(jù)上來看，不考慮原料、儀器、試驗操作等因素，采用微波法提取金銀花中的綠原酸時，提取液應(yīng)選用乙醇溶液。與前3 種方法相比，微波提取不僅時間很短，而且提取效率高。

1.5 酶提取法

酶法是指利用生物催化劑酶對植物細胞壁的組成成分進行分解，以此提高有效成分提取率的一種方法。此法操作簡單、條件溫和、環(huán)保無害，然而需要注意在調(diào)節(jié)酸堿度時可能造成的某些酚類化合物被破壞。因為酶作用具有專一性，所以任小寧等人[25]在使用此法對杜仲葉中的綠原酸進行提取時，首先進行了酶選擇試驗，在半纖維素酶、纖維素酶、果膠酶3 種酶中以提取物得率為指標，選擇纖維素酶進行后續(xù)試驗。在最佳工藝條件為提取溫度40 ℃，提取pH 值4.5，提取時間90 min，加酶量0.4%時，綠原酸得率為52.24 mg/g。

相較其他方法而言，因為酶的作用條件溫和，所以提取溫度不高，并且需要根據(jù)提取物種類提前選取酶，提高綠原酸的純度。

1.6 酶解-超聲組合法

酶解-超聲組合法是一種較新的方法，主要是將兩者結(jié)合起來，優(yōu)勢互補，較單一方法而言提取效率更高，提取質(zhì)量更優(yōu)。采用基于聚乙二醇（PEG-200）的酶輔助超聲提?。‥AUE）方法，對金銀花葉中的綠原酸（CGA）進行提取并對提取工藝進行了優(yōu)化、驗證，且與其他常規(guī)提取工藝進行比較。在最佳提取工藝條件下，結(jié)果表明，聚乙二醇濃度為42%，萃取溫度為49 ℃，pH 值為4.2 時，試驗提取率為6.955%，與熱回流提取相比，基于PEG 的EAUE 對金銀花中CGA 的提取效率較高[26]。張凌裳等人[27]采用酶解-超聲組合法提取杜仲葉中的綠原酸，并在最優(yōu)條件下得出提取率為3.05%。

該方法與單純的使用酶解法的得率為2.89%[28]和單純使用超聲波法的得率為2.61%[29]相比，可以看出兩者結(jié)合之后綠原酸的提取率可以得到提升，分別是酶解法的106%，超聲波法的117%。數(shù)據(jù)可以解釋為什么酶法通常和其他方法聯(lián)用。

1.7 超臨界萃取法

超臨界萃取法通過調(diào)節(jié)萃取劑流體的溫度和壓力，把不同溶解度的樣品組分先后萃取出來以達到提取分離作用的一種方法。此法提取的綠原酸損失少、質(zhì)量優(yōu)，提取效率高，但因設(shè)備昂貴難以進行批量生產(chǎn)。有文獻采用改良后的超臨界CO2萃取金銀花花芽中的綠原酸，并用高效液相色譜法（HPLC）對綠原酸進行分析。采用響應(yīng)面法對工藝參數(shù)進行優(yōu)化，優(yōu)化后的提取條件為乙醇體積分數(shù)32%，萃取溫度74 ℃，壓力289 bar，得到的最大得率為5.51%[30]。Andrade K S 等人[31]在提取咖啡皮中的活性物質(zhì)綠原酸和咖啡因時，也采用了超臨界CO2萃取法，取得了不錯的效果，結(jié)果表明在選擇提取綠原酸的方法時，此法也應(yīng)納入考慮范圍。但是，此法目前尚停留在實驗室階段，若工業(yè)化大規(guī)模提取還應(yīng)選擇其他方法。

以上是7 種比較常見的提取綠原酸的方法，這些方法各有利弊。在試驗之前，首先應(yīng)該考慮提取目的、提取場合、操作人員和操作條件。通過上文可以很清楚的得出以下結(jié)論，水提法和回流法作為最傳統(tǒng)提取方法，提取率和提取質(zhì)量低于其他方法；超聲波法和微波法與酶法結(jié)合之后，可以顯著提高提取率和提取物純度；超臨界萃取法沒有其他方法適用范圍廣，但如果實驗室有條件，在提取綠原酸時可優(yōu)先考慮此法。

2 綠原酸的測定方法

通常測定綠原酸的方法有紫外分光光度法和高效液相色譜法。兩種方法各有利弊，紫外分光光度法不夠準確但儀器便宜，操作簡單，所以使用廣泛，而高效液相色譜儀雖然結(jié)果準確但是價格昂貴。近年來，近紅外光譜法發(fā)展迅速，已然成為一種頗具前景的光譜分析方法。

3 綠原酸的應(yīng)用

綠原酸可通過清除自由基或減弱其活性，達到抗氧化的目的，因此可以作為一種酚類天然抗氧化劑添加于食品當中[32-34]。研究還發(fā)現(xiàn)，綠原酸對油炸后的草魚有護色作用，還可抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等多種腐敗菌的生長，如肉制品在保存時，可考慮選用綠原酸這一天然抗菌防腐劑[35-36]。

由于綠原酸具有的抗菌抗病毒功效，金羚感冒片中主要的活性成分就是綠原酸；目前疫情大流行期間，針對新冠病毒具有明顯治療效果的連花清瘟膠囊的主要有效成分之一也是綠原酸[37]。不少美容產(chǎn)品中添加了綠原酸，以幫助皮膚抵擋陽光和屏幕輻射，保持皮膚彈性，抵抗衰老。

4 展望

隨著各種流感、各種新型病毒、各種癌癥腫瘤越來越嚴重且頻繁地侵襲人類，人們對于身體健康狀況也越來越重視。植物源天然產(chǎn)物被給予了更多關(guān)注，吸引了國內(nèi)外眾多學者專家的目光，對天然產(chǎn)物中各種活性成分的研究也更加深入。基于綠原酸多種益于人體的活性作用，研究綠原酸的提取工藝富有極大的學術(shù)價值和現(xiàn)實意義。

天然產(chǎn)物中綠原酸的提取方法有很多，大部分在與酶法結(jié)合后，其提取率、提取純度都得到顯著提高，提取時間、提取成本大大降低。其中，酶法與超臨界萃取法相結(jié)合提取天然活性成分的報道較少，在綠原酸的提取中未見運用，但在花色苷的萃取中可見?；ㄉ諏儆邳S酮多酚類化合物，與綠原酸類性質(zhì)相近，因此可進一步推論，酶法-超臨界萃取法可應(yīng)用于綠原酸的提取，從而為植物源綠原酸的提取提供了一個新的理論依據(jù)。

綜上所述，綠原酸具有多種益于身體健康的活性作用，可促使專家學者不斷開創(chuàng)、完善綠原酸的提取工藝，使得綠原酸資源可以更多地被利用。然而，從現(xiàn)有的研究來看，雖然新興提取技術(shù)酶解-超聲組合法、超臨界萃取等的提取率確有提高，但總體來說，普遍面臨著提取效率、提取純度較低或提取成本較高的問題。鑒于天然綠原酸的同分異構(gòu)體較多，所以在提取時不能單純注重提取率，還需要考慮單體提取的純度問題。由于目前關(guān)于提取方法研究較少，因此在將來的發(fā)展中，可以針對性開發(fā)單體綠原酸的提取方法。