蓖麻毒蛋白的研究進(jìn)展※

●任文靜 尹明達(dá) 霍玉淼 袁樸芳 王 艷 李瑞英 崔 凱 黃鳳蘭，4※※

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)與食品學(xué)院 內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.內(nèi)蒙古赤峰市敖漢旗林業(yè)和草原局 內(nèi)蒙古 赤峰 024300；3.赤峰市森林草原保護(hù)發(fā)展中心 內(nèi)蒙古 赤峰 024000；4.蓖麻育種國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心/內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心/蓖麻產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新內(nèi)蒙古自治區(qū)工程研究中心 內(nèi)蒙古 通遼 028000）

蓖麻（Ricinus communisL.），屬于大戟科蓖麻屬植物[1]。蓖麻耐干旱、耐鹽堿、耐弱酸。蓖麻種子含油量在50%左右，榨出的油黏度高，高溫不易變質(zhì)、低溫不易凝固，具有其他油脂無(wú)法比擬的特性。蓖麻油為重要工業(yè)用油，主要深加工產(chǎn)品有1，2-羥基硬脂酸、癸二酸，蓖麻油脂肪酸及精煉蓖麻油、氫化蓖麻油等，是航天、航空和一切精密儀器、增塑劑、高級(jí)潤(rùn)滑油的基礎(chǔ)原料。蓖麻的根、莖、葉、籽均可入藥，而且具有很高的藥用價(jià)值。蓖麻植株內(nèi)的四種毒性物質(zhì)分別為蓖麻毒蛋白、蓖麻堿、血球凝集素以及變應(yīng)原，其中蓖麻毒蛋白的毒性最大，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用研究最為深入[2]。

1 蓖麻毒蛋白的分子結(jié)構(gòu)

蓖麻毒蛋白（Ricin）是一種植物糖蛋白，純品是白色粉末狀或結(jié)晶狀的固體，無(wú)味[3]，在蓖麻種子中含量約為1%～5%。蓖麻毒蛋白是由A、B兩條鏈構(gòu)成的異二聚體，相對(duì)分子量約66.0 kDa；其毒性鏈即活性鏈為A鏈（RTA）分子量為32.0 kDa，是由7條α螺旋鏈高度螺旋化構(gòu)成的。有研究表明，A鏈主要以包涵體形式表達(dá)[4]。A鏈的第10個(gè)殘基Asn已糖基化，接有（Glc Nac） 2 （Man） 4寡糖鏈，A鏈中只含有兩個(gè)LY殘基，而其中一個(gè)LY殘基位于N端第四位C端附近，這對(duì)A鏈發(fā)揮毒性作用至關(guān)重要[5]。A鏈依照其空間結(jié)構(gòu)被分為3個(gè)結(jié)構(gòu)域，即結(jié)構(gòu)域Ⅰ（殘基1～117），結(jié)構(gòu)域Ⅱ（殘基118～210）和結(jié)構(gòu)域Ⅲ（殘基211～267），它們共同組成了A鏈的N-糖苷酶活性口袋[6]。B鏈分子量為34.0 kDa，包含高達(dá)25%的螺旋區(qū)[7]；B鏈?zhǔn)沁\(yùn)載體，含有兩個(gè)寡糖鏈（GIc Nac）2（Man）8和（Glc Nac）2（Man）7，分別與位于93和133的兩個(gè)Asn殘基相連。B鏈根據(jù)其空間結(jié)構(gòu)分為2個(gè)結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域具有高度同源性，從氨基酸組成來(lái)看，結(jié)構(gòu)域Ⅰ是由1～135位氨基酸組成；而結(jié)構(gòu)域Ⅱ是由136～262位氨基酸組成。結(jié)構(gòu)域Ⅰ和結(jié)構(gòu)域Ⅱ，這兩部分的氨基酸序列有32%相同，并且每個(gè)結(jié)構(gòu)域又可分為α、β、γ亞結(jié)構(gòu)域和λ連接肽，這些亞結(jié)構(gòu)為了穩(wěn)定B鏈的二維構(gòu)象，會(huì)通過(guò)相互作用形成疏水核，以結(jié)構(gòu)域Ⅰ的α亞結(jié)構(gòu)域和結(jié)構(gòu)域Ⅱ的γ亞結(jié)構(gòu)域具有碳水化合物結(jié)合活性[8]。

2 蓖麻蛋白的作用機(jī)理

蓖麻毒蛋白的毒性極強(qiáng)，是眼鏡蛇毒性的2～3倍[9]。據(jù)研究可知，蓖麻種子中粗蛋白的平均含量約為10 mg，而單粒蓖麻種子中毒蛋白含量約為4 mg[10]。蓖麻毒素中毒是一種致命且罕見(jiàn)的疾病。誤食蓖麻種子可引起急性胃腸炎，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致體液和電解質(zhì)失衡，中毒后10～72 h時(shí)會(huì)出現(xiàn)血管崩潰和多器官功能衰竭[11]，甚至死亡。蓖麻毒蛋白的作用機(jī)理是：蓖麻毒蛋白A鏈的結(jié)構(gòu)域Ⅲ通過(guò)二硫鍵與B鏈相連[12]。A鏈?zhǔn)且环NN-糖苷酶，可使60S核糖體失活，限制延伸因子的結(jié)合從而破壞蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致真核細(xì)胞死亡；B鏈?zhǔn)且环N半乳糖結(jié)合型蛋白[6，13]，可與細(xì)胞表面的糖蛋白或糖脂結(jié)合[14]，并協(xié)助蓖麻毒蛋白通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞[15]，接著一定數(shù)量的蓖麻毒蛋白到達(dá)高爾基體，然后被運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，A鏈和B鏈之間的二硫鍵被切斷，A鏈和B鏈分離[16]。A鏈和B鏈分離后會(huì)產(chǎn)生活性。A鏈和脂膜的相互作用引起了A鏈結(jié)構(gòu)的伸展，然后伸展的A鏈作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解途徑（如ERAD的途徑）的備選者，易位到細(xì)胞質(zhì)，并和核糖體結(jié)合[17]。接著A鏈將28S的rRNA上的A4324脫嘌呤化，使得延伸因子的結(jié)合受到抑制，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成也受到抑制[6]，最終會(huì)使人和動(dòng)物產(chǎn)生中毒癥狀。

3 蓖麻毒蛋白的應(yīng)用

3.1 鼠藥

近些年來(lái)，內(nèi)蒙古自治區(qū)的一些草原地區(qū)出現(xiàn)鼠疫，不僅影響了草原的生態(tài)平衡，更是危及人類健康安全，因此，防治鼠害成了一項(xiàng)重大的任務(wù)，而目前我國(guó)防治鼠害的主要方法是化學(xué)藥品，雖然得到了一定的改善，但這種方法對(duì)環(huán)境污染較大。為了提倡和踐行環(huán)境零污染的理念，開(kāi)發(fā)研制效率高、污染小的鼠藥成了草原鼠疫防治的新任務(wù)。有研究表明，以生理鹽水為溶劑離心去脂提取的蓖麻粗蛋白（含毒蛋白）制成的鼠藥適口性較好，原因是生理鹽水為動(dòng)物血液和淋巴液的等滲溶液，無(wú)毒且相容性好[18]。通過(guò)對(duì)雌雄小鼠飼喂含蓖麻毒蛋白的混合餌料發(fā)現(xiàn)，這種餌料可以縮小雄性小鼠的精小管管徑，生殖上皮厚度變薄從而導(dǎo)致生育能力下降，甚至影響雌性小鼠的生殖能力。這種餌料可以改變其子宮肌肉層的排列，降低子宮基質(zhì)層的厚度，使黏膜上皮厚度增大，還可以通過(guò)增強(qiáng)小白鼠子宮內(nèi)收縮來(lái)降低著床概率，使小白鼠子宮內(nèi)沒(méi)有著床位點(diǎn)而達(dá)到抗生育的目的[19]。

3.2 殺蟲(chóng)劑

在低碳環(huán)保、綠色健康的大環(huán)境下，蓖麻毒蛋白作為無(wú)污染的環(huán)保農(nóng)藥，引起了人們的重視。蓖麻毒蛋白作為一種核糖體失活蛋白，對(duì)幾乎所有的真核細(xì)胞都具有很強(qiáng)的毒害作用，被認(rèn)為是一種潛力巨大的新型生物農(nóng)藥[20-21]。有研究者使用甲醇、乙酸乙酯和石油醚3種不同溶劑提取物分別處理蓖麻籽（提取蓖麻毒蛋白），所得提取物對(duì)煙草害蟲(chóng)均具有觸殺活性，其中，以乙酸乙酯為溶劑的提取物對(duì)朱砂葉螨、桃蚜、棉蚜、煙青蟲(chóng)和棉鈴蟲(chóng)觸殺活性校正死亡率分別為80.88%，97.41%，96.44%，52.41%，62.51%[22]。還有研究者采用小葉碟添加法測(cè)定殺滅南方根結(jié)線蟲(chóng)的效果，共設(shè)置99個(gè)表面皿，每個(gè)表面皿中放入10只南方根結(jié)線蟲(chóng)，根據(jù)不同倍數(shù)稀釋液進(jìn)行分組，每個(gè)表面皿中噴灑5 mL供試液體，觀察12 h、1 d、2 d的殺滅率，得出10倍稀釋液在1 d后殺滅率接近100%，其他組滅蟲(chóng)效果不顯著[23]。

3.3 抗腫瘤

蓖麻毒蛋白具有巨大的潛力，其作為抗癌劑或在基于細(xì)胞的研究，甚至在腫瘤治療中的納米顆粒制劑方面都進(jìn)行了探索[18]。蓖麻毒蛋白作為一種具有強(qiáng)毒性的天然毒素蛋白，對(duì)所有哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞都具有毒性作用，且對(duì)某些惡性腫瘤細(xì)胞的毒性更強(qiáng)，因此成為醫(yī)學(xué)上用于殺傷腫瘤細(xì)胞的首選毒素之一[4]。利用蓖麻毒蛋白A鏈的高效生物毒性和CD71在肝癌細(xì)胞表面過(guò)量表達(dá)的特性，將抗CD71單克隆抗體與蓖麻毒蛋白A鏈偶聯(lián)。通過(guò)這種方式，可以將A鏈特異性地導(dǎo)向肝癌細(xì)胞，構(gòu)建新型免疫毒素，使其靶向攻擊肝癌細(xì)胞，降低對(duì)正常組織細(xì)胞的殺傷性[24]。此外，通過(guò)與單克隆抗體片段4D5scFv的融合制備重組免疫毒素RTA-4D5，能夠提高對(duì)目標(biāo)腫瘤的抑制作用，同時(shí)減小對(duì)正常細(xì)胞的傷害[25]。而B(niǎo)鏈處理巨噬細(xì)胞可顯著提高TLR4蛋白水平。有研究者已經(jīng)驗(yàn)證了RT和TLR4通過(guò)免疫沉淀相互作用[26]。通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬RT與TLR4的對(duì)接，將接觸殘基集中在B鏈上。TNF-α主要由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖，引起腫瘤消退的能力，結(jié)果表明重組B鏈可通過(guò)TLR4信號(hào)通路激活NF-κB，進(jìn)一步激活小鼠巨噬細(xì)胞分泌TNF-α，最終治療腫瘤[27]。前人將蓖麻種子核糖體失活蛋白加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的食管癌細(xì)胞中（24～36 h，細(xì)胞濃度106個(gè)/mL），檢測(cè)其抗癌活性，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比加入蓖麻種子核糖體失活蛋白的細(xì)胞密度低、生長(zhǎng)受抑制、細(xì)胞膜明顯破裂[28]。蓖麻毒素還能誘導(dǎo)原發(fā)性PAM收縮、凋亡、空泡化和多細(xì)胞器損傷[29]。

4 總結(jié)

雖然蓖麻毒蛋白是一種潛在的生物威脅劑[30]，但隨著對(duì)蓖麻毒蛋白的不斷深入研究，其在多個(gè)領(lǐng)域都發(fā)揮著極其重要的作用。在鼠藥研究方面，用蓖麻毒蛋白制備的鼠藥來(lái)源于自然，無(wú)不良?xì)馕叮晃廴经h(huán)境，且易于降解，食后的殘藥是優(yōu)質(zhì)的有機(jī)肥；但誤食這種鼠藥，同樣對(duì)人畜有毒，必須安全投放[6]，迄今為止蓖麻中毒沒(méi)有特效解毒劑。在殺蟲(chóng)劑方面，用蓖麻毒蛋白制得的殺蟲(chóng)劑可有效地殺滅一些蚜蟲(chóng)和南方根結(jié)線蟲(chóng)，且制備過(guò)程簡(jiǎn)單；在噴灑的過(guò)程中要嚴(yán)格把控間隔時(shí)間及藥的用量，否則會(huì)直接影響滅蟲(chóng)效果；對(duì)于蓖麻毒蛋白的殺蟲(chóng)機(jī)制和殺蟲(chóng)后蓖麻毒蛋白在蟲(chóng)體中的殘留與分解情況還需進(jìn)一步的研究。在治療腫瘤方面，蓖麻毒蛋白雖對(duì)肝癌細(xì)胞具有一定的抑制作用，但由于B鏈和細(xì)胞的結(jié)合是非特異性的，所以免疫毒素與細(xì)胞表面特異性結(jié)合較差，殺傷力也較弱。目前蓖麻毒蛋白在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用還存在很多問(wèn)題，但作為一種新的方法或途徑，蓖麻毒蛋白仍然在農(nóng)業(yè)、生物農(nóng)藥等方面有著巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>