百脈根不定根發(fā)育相關基因LcC2DP1的克隆與功能初步分析

馬思宇，肖芳斌，羅雪，韋飄，宋莉

貴州大學生命科學學院/農業(yè)生物工程研究院/山地植物資源保護與種質創(chuàng)新教育部重點實驗室/貴州省農業(yè)生物工程重點實驗室，貴陽550025

植物根系具有固持地上組織和吸收水分、養(yǎng)分的雙重功能［1］，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用［2］。根系的生長狀態(tài)和分化速度直接影響牧草的長勢和產量［3-4］。牧草根系的發(fā)育受多種內外環(huán)境因子的影響，由蛋白激酶（protein kinases， PK）介導的激素信號途徑是其中的主要調控途徑［5-6］。蛋白激酶是催化蛋白質磷酸化反應的酶，廣泛參與細胞信號感知［7］、傳導［8］、基因表達［9］、生長發(fā)育調控［10］等過程。根據(jù)催化域氨基酸序列的不同，蛋白激酶分為AGC、CaMK、CMGC、PTK和其他共5個類型［11］。CaMK中的C2鈣依賴蛋白激酶（C2 calciumdependent protein kinase， C2CDPK）是一類含有C2結構域的蛋白。鈣依賴蛋白激酶（CDPK）依賴于Ca2+催化磷酸化反應［12］，參與細胞信號轉導過程［13］。研究表明，CDPK參與植物根系的生長發(fā)育調控，定位于細胞膜的擬南芥CDPK編碼基因CPK29參與側根形成調控［9］，苜蓿MtCDPK1表達促進根毛的正常生長［14］，水稻OsCDPK5在淹水條件下能保證根系通氣組織的正常形成［15］。C2結構域蛋白主要定位于人類和動物的細胞膜系統(tǒng)，具有參與磷脂第二信號產生、GTP酶激活和控制蛋白質磷酸化等重要功能［16-17］。近年來，植物C2CDPK的研究已逐漸受到關注［18-19］。研究發(fā)現(xiàn)小麥的C2CDPK基因TaC2DP1在干旱、低溫和熱脅迫中發(fā)揮重要作用［20］，旋蒴苣苔的BhC2DP1基因參與脫落酸（ab?scisic acid， ABA）信號途徑調控根的生長［21］。盡管如此，人們對植物C2CDPK的了解仍極為有限。

百脈根（Lotus corniculatusL.）是一種優(yōu)質的多年生豆科牧草，也是一種良好的蜜源和護坡固土植物，其由匍匐莖發(fā)生的不定根所構成的根系系統(tǒng)十分發(fā)達。本研究通過RACE擴增法克隆Leo百脈根C2CDPK編碼基因LcC2DP1，利用qRT-PCR技術檢測該基因的組織表達特異性，通過農桿菌介導的瞬時表達系統(tǒng)對其不定根分化調控功能進行初步分析，以期為揭示百脈根根系發(fā)育調控機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用植物材料為百脈根（Lotus corniculatus‘Leo’），種植于貴州大學貴州省農業(yè)生物工程重點實驗室試驗田。農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101和pSH737植物表達載體均保存于筆者所在實驗室。

1.2 LcC2DP1基因克隆

筆者所在課題組前期分析百脈根不定根發(fā)育轉錄組數(shù)據(jù)［22］中發(fā)現(xiàn)，12個C2結構域激酶基因家族成員在不定根發(fā)育過程中持續(xù)上調表達，其中的LcC2DP1（Lc1g3v0026680）表達最為顯著，本研究對該基因進行進一步研究，克隆引物（表1）采用Prim?er Premier 5.0軟件設計，提取百脈根莖、葉、根的總RNA混合反轉錄成cDNA后作為模板，按照5′RACE和3′RACE試劑盒（TaKaRa， 大連）提供的操作方法進行兩輪巢式PCR擴增，首輪PCR產物稀釋50倍后取1 μL作為第二輪PCR的模板。50 μL反應體系為：cDNA模板1 μL、引物各2 μL、Taq酶0.5 μL、Buffer 5 μL、2H2O補足體系；PCR反應程序為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35次循環(huán)后再72 ℃ 延伸10 min，之后對PCR產物進行凝膠分離和回收測序。根據(jù)已知序列和5′ RACE、3′ RACE測序結果，拼接目的基因全長序列，分析起始和終止密碼子位置。根據(jù)RACE擴增序列設計2條全長擴增特異性引物（表1），以百脈根cDNA為模板擴增LcC2DP1基因，擴增條件為：94 ℃ 預變性2 min；94 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火30 s，68 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；68 ℃ 延伸10 min。PCR擴增片段與pMD18T載體連接，熱激法轉化大腸桿菌DH5α后送生工生物一程（上海）公司測序。

表1 RACE和全長基因克隆擴增引物序列Table 1 RACE and full length gene cloning amplification primer sequence

1.3 LcC2DP1基因結構分析

使用相關的生物信息分析在線工具進行LcC2DP1基因的分子特征分析，其中，理化性質（蛋白質分子質量、等電點、分子式）采用ExPASy Prot?Param tool（https：//web.expasy.org/protparam/）、編碼蛋白的親疏水性采用Protscale（https：∥web．ex?pasy．org/protscale/）、蛋白結構分析采用SOPMA（https：∥npsa-prabi．ibcp．fr/cgi-bin/）和SWISSMODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）進行。利用Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bio?inf/plant-multi/）對LcC2DP1基因進行亞細胞定位預測。利用BEDTools［23］獲得LcC2DP1基因上游2 000 bp序列（Lotus corniculatusgenome assembly build 3.0）［24］，利用在線網站PlantCARE對獲得的序列和順式作用元件進行分析。使用NCBI的BLAST工具篩選出LcC2DP1同源序列后用MEGA X中鄰位相連法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.4 LcC2DP1基因表達分析

為探究LcC2DP1在百脈根不同組織和不同時期中的表達情況，分別收集Leo百脈根的根、莖、葉以及不定根形成過程中0、3、6、9、12 d根部組織為樣本。以百脈根UBI（DQ249171.1）作為內參基因，通過IDT（https：//sg.idtdna.com/site/home/home/ses?siontimeout）在線軟件設計LcC2DP1和UBI的擴增引物（表2）。使用實時熒光定量PCR儀（CFX96）檢測LcC2DP1基因的時空表達特性，反應體系和反應程序根據(jù)TIANGEN miRcutemiRNA試劑盒的說明進行。采用2-△△Ct方法［25］分析基因相對表達量。

表2 qRT-PCR檢測引物序列Table 2 Primer sequence used in qRT-PCR detection

1.5 植物表達載體構建及遺傳轉化

利用限制性內切酶EcoRⅠ和XbaⅠ（TaKaRa， 大連）分別酶切pSH737和pMD18T- LcC2DP1質粒，酶切片段回收后用T4DNA連接酶（TaKaRa，大連）4 ℃連接過夜，構建LcC2DP1基因的植物表達載體，該基因由35S啟動子驅動表達，以GUS：：NPTII作為報告基因和篩選基因。采用YEP液體培養(yǎng)基培別采用GUS組織化學染色和RT-PCR進行轉化鑒定。采用視顯微鏡（OOX-86）進行拍照，利用根系掃描儀（Epson）和根系分析軟件（Win Rhizo）對總根長、根尖數(shù)、根系總表面積、根體積和根平均直徑等根系指標進行觀察及統(tǒng)計分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計和顯著性分析分別采用Excel 2016軟件和DPS 7.05軟件，并采用GraphPad Prism 8.2軟件進行作圖。

2 結果與分析

養(yǎng)所獲得的陽性工程菌至對數(shù)生長期。參照楊少彤等［26］的方法，通過真空滲透法進行百脈根枝條瞬時轉化。轉化條件為在12 kPa處理10 min，快速釋放壓力，再次重復處理1次。每組15株樣品，重復3次。以攜帶GV3101-pSH737質粒轉化植株作為對照，分

2.1 LcC2DP1基因克隆

基于百脈根不定根分化轉錄組篩選的Lc1g3v00 26680序列，對LcC2DP1基因進行RACE擴增，獲得的LcC2DP1全長為705 bp，編碼235個氨基酸，該序列上游有起始密碼子ATG，下游有終止密碼子TGA。為了驗證拼接序列的正確性，設計引物對LcC2DP1編碼區(qū)進行擴增，得到1條約700 bp的特異性條帶，序列測定結果表明LcC2DP1編碼區(qū)與拼接結果序列完全一致（圖1）。

圖1 LcC2DP1基因克隆及拼接翻譯Fig.1 LcC2DP1 gene amplification and mosaic translation

2.2 LcC2DP1的理化性質

對LcC2DP1基因結構進行分析，結果顯示，其編碼蛋白含235個氨基酸，相對分子質量為25 952.03，理論等電點為7.17，分子式為C1185H1737N305O344S6，脂肪指數(shù)為53.91，不穩(wěn)定性指數(shù)為85.47，是一種不穩(wěn)定蛋白。對LcC2DP1蛋白質進一步分析，發(fā)現(xiàn)其親水性氨基酸較疏水性氨基酸多（圖2A），推測該蛋白屬于親水性蛋白。在LcC2DP1蛋白的二級結構中，α螺旋有19個氨基酸（占8.15%），無規(guī)卷曲有175個氨基酸（占75.11%），延伸鏈有39個氨基酸（占16.74%）（圖2B），可確定該蛋白二級結構主要以無規(guī)卷曲為主。利用Plant-mPLoc在線分析軟件，對LcC2DP1進行亞細胞定位預測，結果顯示，LcC2DP1定位在細胞核和細胞膜上（圖2C）。用Swiss model對LcC2DP1蛋白進行三級結構預測，結果顯示，LcC2DP1蛋白結構包含大量的無規(guī)卷曲（圖2D），這與預測的二級結構結果一致。對LcC2DP1的全長蛋白序列進行Blast比對并構建系統(tǒng)進化樹，結果顯示，LcC2DP1與蒺藜苜蓿蛋白同源性最高，為82%（圖2E），暗示C2結構域在豆科植物中進化較為保守。

圖2 LcC2DP1 基因分子特性Fig.2 Molecular characteristics of LcC2DP1 gene

2.3 順式作用元件類型

提取百脈根LcC2DP1基因上游2 000 bp序列進行順式作用元件分析，結果（表3）顯示，百脈根LcC2DP1基因除了含有啟動子和增強子區(qū)域最基本的CAAT-box元件以外，還含有光響應元件（Box-4、AT1-motif、GT1-motif）、轉錄起始核心啟動子元件（TATA-box）以及干旱誘導相關（MBS）的多種順式作用元件。

2.4 植物表達載體構建

擴增LcC2DP1基因片段，與pSH737植物表達載體連接，雙酶切鑒定結果顯示，重組質粒酶切后出現(xiàn)705 bp的目的基因條帶（圖3A）。GV3103農桿菌轉化菌株的PCR擴增檢測顯示，菌體中能擴增出705 bp的LcC2DP1基因條帶（圖3B），表明植物表達載體pSHLcC2DP1和攜帶LcC2CDP1基因的工程菌構建成功。

圖3 植物表達載體雙酶切及農桿菌PCR電泳檢測Fig.3 The electrophoretic detection on double enzyme digestion of plant expression vector and PCR of Agrobacterium tumefaciens liquid

表 3 LcC2DP1基因的主要順式調控元件Table 3 The main cis-regulatory elements of LcC2DP1 gene

2.5 LcC2DP1基因的表達特征

通過qRT-PCR分析LcC2DP1基因在百脈根不同組織及不定根分化期間的差異表達情況，發(fā)現(xiàn)相較于內參基因UBI，LcC2DP1基因在根、莖、葉中均有表達，但主要表達部位為根（1.00±0.00）和莖（7.57±0.36），在葉中表達量（0.15±0.03）最低（圖4A）。當瞬時轉化后，LcC2DP1基因在百脈根根（相對表達量為6.51±0.32）、莖（相對表達量為9.65±0.35）、葉（相對表達量為0.34±0.06）中表達量均增加，以根中表達變化量最為顯著（P<0.01）（圖4A）；不定根分化的0～9 d，野生型植株（WT）和轉LcC2DP1植株（TP）的LcC2DP1基因表達量均逐漸上升，但TP相較于WT變化顯著（P<0.05），其中3 d時為1.26±0.09，9 d時表達量最高（2.68±0.35），之后表達量下降，TP同期表達量均高于WT（圖4B）。

圖4 LcC2DP1 基因表達特異性Fig.4 LcC2DP1 gene expression specificity

2.6 LcC2DP1基因在不定根分化中的作用

采用農桿菌介導的真空滲透法將植物表達載體pSHLcC2DP1轉化到百脈根中。GUS組織化學染色顯示，外源基因轉化后3～15 d均可觀察到百脈根葉片顯示藍色，外源基因瞬時轉化百脈根后可在葉片和根部組織有效表達，隨著時間的延長藍色逐漸加深，到第9天時藍色最深（圖5A），之后藍色逐漸變淺，外源基因功能鑒定可在轉化后15 d內進行。形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)第6天時不定根形成，之后根系逐漸增多（圖5B），利用RT-PCR對轉化后9 dLcC2DP1基因轉錄情況進行檢測，發(fā)現(xiàn)外源基因有表達（圖5C）。

圖5 不定根分化9天時的轉基因植株觀察與鑒定Fig. 5 Observation and identification of transgenic plants after adventitious root differentiation for 9 days

由圖6可見，TP植株在第6天時觀察到不定根開始分化，比野生型親本（WT）提前1～2 d形成根系。在第12～15天TP植株根系總根長、根尖數(shù)、根體積均顯著高于WT植株。12 d時TP植株根系總根 長為（4.28±0.22） cm，是WT的168%，15 d為（7.74±0.23） cm，是WT的155%（圖6A）；12 d時TP植株根體積為（0.016 7±0.001 2） cm3，是WT的249%，15 d時 為（0.040 3±0.003） cm3，是WT的161%（圖6B）；12 d時TP植株根尖數(shù)為（8.30±0.88） ，是WT的156%，15 d天時為（12.33±0.88），是WT的137%（圖6C）。同一時期的TP與WT的根系總表面積（圖6D）和根平均直徑（圖6E）差異不顯著。TP百脈根在總根長（P<0.01）、根體積（P<0.05）和根尖數(shù)（P<0.05）上表現(xiàn)出一定的根系發(fā)育優(yōu)勢，LcC2DP1基因的表達可能與百脈根的不定根發(fā)育有關。

圖6 百脈根不定根分化9～15 d期間的根系發(fā)育指標比較Fig.6 Comparison of root development indicators of the Lotus corniculatus during 9-15 days

3 討論

C2結構域蛋白作為與鈣離子結合的一類功能型蛋白，在調控植物生長發(fā)育、抗逆性以及信號轉導方面起著重要的作用。本研究從Leo百脈根中克隆了LcC2DP1基因，序列分析發(fā)現(xiàn)該基因具有典型的C2結構域，屬于C2域蛋白家族基因［22，27］。亞細胞定位預測結果顯示，LcC2DP1蛋白定位于細胞膜和細胞核中，符合大多數(shù)C2結構域蛋白的亞細胞定位情況［10］，這是由C2結構域蛋白的結構所決定的，當C2結構域蛋白的N端發(fā)生?；揎棔r，其棕櫚?；稽c可與細胞膜形成一種可逆的穩(wěn)定結合，而其豆蔻?；稽c則形成一種不可逆的松散結合［28］。

系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)LcC2DP1基因與狹葉羽扇豆、蒺藜苜蓿、刺毛黧豆等豆科植物具有較高的同源性，其中與蒺藜苜蓿的同源性最高為82%，說明LcC2DP1在豆科植物中具有較高的保守性。對該基因進行的組織特異性表達分析表明，LcC2DP1基因在百脈根牧草的根、莖和葉片組織中均有表達，但這種組織表達存在著明顯的差異，以根和莖組織中的表達量較高，而葉片中的表達量較低。馬佛明等［29］研究表明，巴西橡膠樹的C2結構域蛋白編碼基因HbC2在被檢植物組織中均有表達；但辣椒C2結構域蛋白編碼基因CaSRC2-1Kim卻具有顯著的組織特異性，僅在根組織中表達［30］?？梢钥闯?，C2結構域蛋白在植物生長發(fā)育中有著不同的表達模式，暗示C2結構域蛋白在植物生長發(fā)育過程中功能的多樣性，包括可能參與根系發(fā)育調控過程。

張?zhí)m軍等［21］研究發(fā)現(xiàn)，復蘇植物旋蒴苣苔的C2CDPK蛋白基因BhC2DP1參與激素途徑調控根系發(fā)育。本研究利用農桿菌介導的瞬時表達系統(tǒng)對LcC2DP1基因功能進行初步分析，結果顯示，轉LcC2DP1基因植株的不定根分化比野生型早1～2 d，且根系總根長（P<0.01）、根體積（P<0.05）、根尖數(shù)（P<0.05）均高于野生型，LcC2DP1基因表達使宿主植物產生一定的根系發(fā)育優(yōu)勢，這加深了人們對植物C2CDPK基因功能的認識。C2結構域蛋白可以通過生長素途徑調控根系發(fā)育［10，31］，本研究中的根系發(fā)育優(yōu)勢可能與激素途徑有關。光是植物生長發(fā)育的重要環(huán)境因素之一，光通過調節(jié)基因的表達和酶的活性等方式影響了植物的生長發(fā)育和根系分化過程［32］，LcC2DP1基因順式作用元件中含有光響應元件Box-4、AT1-motif和GT1-motif，該基因也有可能是通過響應或改變光的敏感性調控植株生長發(fā)育，進而影響根系分化。

本研究通過對LcC2DP1基因的克隆、生物信息學分析、組織特異性表達、瞬時表達分析，發(fā)現(xiàn)LcC2DP1基因屬于C2蛋白基因，可能參與百脈根不定根發(fā)育調控過程，在后續(xù)的研究中，將進一步驗證LcC2DP1是否具有鈣依賴蛋白激酶相應的生理功能，進行百脈根穩(wěn)定遺傳轉化和創(chuàng)制突變體植株，明確LcC2DP1基因在不定根發(fā)育過程中的生物學功能。