重組酶聚合酶擴增技術在現(xiàn)場物證唾液鑒定中的應用

許 炎，曹 禹，郝思靜，黃江平，王旭芳，吳 丹

（1.上海市公安局物證鑒定中心 法醫(yī)物證學現(xiàn)場應用技術公安部重點實驗室，上海200083；2.上海公安學院，上海201210；3.浙江中和司法鑒定中心，浙江 寧波 315300）

人類組織和體液的來源認定一直是法醫(yī)物證學研究的熱點。來自犯罪現(xiàn)場的體液斑痕類型和組織來源對于幫助現(xiàn)場重建，證明DNA證據(jù)與犯罪活動之間的聯(lián)系，指明偵查方向，完善司法鑒定證據(jù)鏈等均有著重要的意義。目前，絕大部分法醫(yī)物證實驗室仍在使用常規(guī)的化學顯色和酶聯(lián)免疫反應等傳統(tǒng)方法來進行體液識別。這類檢驗均屬于蛋白質(zhì)水平上的檢測，如免疫金標試劑條法檢測人前列腺特異抗原（prostate specific antigen，PSA）和人血紅蛋白，其檢測靈敏度較低[1]，且通常需要耗費一定的檢材，不適用微量物證檢驗。對于唾液等其他體液，目前尚未見類似試劑條法。

重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification,RPA）是2006年由英國TwistDx生物技術公司開發(fā)的一種體外核酸等溫擴增新技術[2]。該技術解決了需要利用準確控溫的熱循環(huán)儀器來進行PCR擴增的限制，操作簡單，反應速度快，無需特殊設備，更適合快速檢驗，已在疾病診斷、農(nóng)業(yè)、食品、生物安全等領域得到廣泛應用和發(fā)展。

目前，國內(nèi)尚未見利用RPA技術進行法醫(yī)物證體液斑痕屬性鑒定的報道。本研究在前期篩選出多種體液特異性信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）分子標識[1]的基礎上，利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）和RPA技術，通過DNA-RNA共提取，同時完成唾液的生物屬性鑒定和短串聯(lián)重復序列（short tandem repeats，STR）分型檢驗，為法醫(yī)物證體液屬性鑒定提供一種新的鑒定策略和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

5名健康男性志愿者提供唾液樣本5份，作為陽性對照。其他唾液樣本20份均來自日常檢案：被害人口腔拭子8份，現(xiàn)場提取飲料瓶瓶口涂取物5份，嚼過的口香糖涂取物5份，現(xiàn)場果核涂取物2份。

1.2 方法

1.2.1 DNA-RNA共提取

按照AllPrepR○DNA/RNA Micro試劑盒（德國Qiagen公司）說明書操作對樣本進行核酸提取?？俁NA用于反轉(zhuǎn)錄和RPA檢測，基因組DNA用于STR分型。

1.2.2 RNA反轉(zhuǎn)錄

樣本RNA使用TaqMan Gold RT-PCR試劑盒（美國AB公司）進行反轉(zhuǎn)錄，具體操作參見試劑盒說明書。反應體系均為10 μL，包括：10×TaqMan RT緩 沖 液1 μL、25 mmol/L MgCl22.2 μL、10 mmol/L dNTPs Mix 2 μL、50 μmol/L Oligo d（T）16 0.5 μL、20 U/μL RNase抑 制 劑0.2 μL、50 U/μL MultiScribe反轉(zhuǎn)錄酶0.25 μL、RNA模板3.85 μL。反應條件為：25℃10 min，48℃30 min，95℃5 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA于-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設計

參考RPA引物設計要求，根據(jù)唾液特異性分子標識HTN3基因保守序列設計并篩選RPA引物，進行特異性確認后，在上游引物5’端添加FAM熒光標記，由上海生工生物工程有限公司合成。最終設計的RPA檢測引物如下，擴增產(chǎn)物為240 bp。

上 游 引 物HTN3RPA-F：CAT CAT TCA CAT CGA GGC TAT AGA TCA

下游引物HTN3RPA-R：AAA TGA TAA TTA GGA AGG GAA GTA TCC TGA AA

1.2.4 構(gòu)建RPA檢測方法

以1.2.2節(jié)制備的樣本cDNA為模板，采用上述設計的引物進行RPA擴增，同時設置超純水為陰性對照，測試在恒溫39℃條件下進行，反應時長為20 min。

參照RPA擴增試劑盒TwistAmp Basic kit（英國TwistDX公司）配制RPA擴增體系（50 μL）：將Rehydration Buffer 29.5 μL加入到含有凍干粉酶的0.2 mL Twist Amp反應管中，再依次加入上、下游引物各2 μL（最終濃度為0.4 μmol/L），去離子水12 μL，模板cDNA 2μL，最后加入乙酸鎂溶液2.5μL（280 mmol/L）。

待反應結(jié)束后，將50 μL苯酚/三氯甲烷溶液加入到RPA擴增產(chǎn)物中，充分混勻，在12 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心2 min，取1 μL上清液在3500遺傳分析儀（美國AB公司）上進行電泳，利用GeneMapper v3.2進行DNA片段分析。

1.2.5 RPA檢測方法特異性驗證

取純化的RPA擴增產(chǎn)物2 μL進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，使用1×TBE緩沖液在5V/cm條件下進行恒壓電泳40~60 min，回收目標條帶，測序驗證，評價建立的RPA檢測方法的特異性。

1.2.6 RPA檢測方法應用效果評價

對來自日常檢案的唾液樣本20份進行RT-RPA檢測，以結(jié)果的一致性評價方法應用效果。用Ver-FilerTMPlus PCR試劑盒（美國AB公司）進行PCR擴增，反應體系為25μL，取1μL擴增產(chǎn)物在3500遺傳分析儀（美國AB公司）上進行電泳。利用GeneMapper v3.2進行STR分析，觀察STR基因座的檢出數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 RPA檢測方法的建立

以陽性對照唾液樣本cDNA為模板，超純水為陰性對照，利用HTN3RPA-F和HTN3RPA-R引物，經(jīng)RPA擴增，在擴增時長為20 min時便可獲得較為理想的擴增結(jié)果（圖1），擴增產(chǎn)物為240 bp。擴增產(chǎn)物條帶與目的條帶大小一致，陰性對照未出現(xiàn)擴增條帶。

圖1 RPA技術判定唾液的特異標記基因HTN3

2.2 RPA檢測方法的特異性評價

實驗回收并純化擴增產(chǎn)物條帶，直接測序驗證，結(jié)果顯示擴增條帶與目的基因序列完全一致。

2.3 RPA檢測方法的應用效果

應用本研究建立的RPA檢測方法對來自日常檢案的20份唾液樣本進行HTN3 RPA檢測和常規(guī)STR分型，結(jié)果顯示：1份樣本未獲得STR分型，HTN3 RPA檢測陰性；1份樣本僅獲得15個基因座的STR分型，HTN3 RPA檢測陽性；其余樣本均獲得20個以上基因座的STR分型（VerFilerTMPlus PCR試劑盒共24個STR基因座），且HTN3 RPA檢測也均為陽性（圖2和表1）。結(jié)果表明，RPA檢驗方法與常規(guī)的STR鑒定可相互驗證，排除RPA檢驗的假陽性結(jié)果。

表1 RPA檢測方法在實際案件唾液類生物樣本中的應用評價表

圖2 RPA技術判定唾液的毛細管電泳圖譜（陽性結(jié)果）

3 討論

RPA技術以T4噬菌體核酸復制機制為原理[2]，在恒溫條件下，利用重組酶和單鏈結(jié)合蛋白協(xié)同實現(xiàn)引物與模板的特異性結(jié)合，定位后引發(fā)鏈交換反應并啟動DNA合成，完成模板上目標片段的指數(shù)級擴增。與PCR技術相比，本研究建立的RPA方法具有以下優(yōu)點：（1）設備簡單。一般RPA反應溫度在30℃～42℃之間，本實驗僅需要一臺恒溫水浴鍋在39℃條件下完成RPA檢測，極大減少了傳統(tǒng)PCR技術所需的設備成本和實驗環(huán)境要求。（2）快速檢測。本實驗結(jié)果顯示在39℃條件下擴增時長20 min時便可獲得較為理想的擴增結(jié)果，相比傳統(tǒng)PCR和實時熒光定量PCR[1]，該技術極大縮短了檢測時長，有利于快速檢測。（3）特異性強。RPA反應與傳統(tǒng)PCR均需要上、下游引物，且引物要求在30～35 bp之間，長于PCR引物，對靶序列的擴增更準確，特異性更強。HTN3和STATH是唾液鑒定常用的兩種標記物[3-4]。前期研究[5]中顯示，HTN3在唾液和口腔黏膜中有特異性高表達，而STATH則在鼻腔分泌物中顯示出更高表達水平。因此，本研究選擇了特異性更高的HTN3作為檢測標記物。（4）結(jié)果易于判定。由于擴增產(chǎn)物為長度明確的DNA片段，完全可以在現(xiàn)有的法醫(yī)物證DNA電泳分析技術平臺上進行操作，并同步完成物證的STR分型檢驗。

由于RPA通常在較低溫度（30℃～42℃）下進行，在目的基因含量低的情況下，容易出現(xiàn)由引物二聚體或非靶基因[2]形成的非特異性擴增產(chǎn)物，產(chǎn)生假陽性結(jié)果，干擾目的基因的檢測，這對引物設計提出了更高的要求。RPA引物應避免5’端過多的鳥嘌呤，在3’端設計一個GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)以避免引物自身配對形成二聚體。本實驗采用的是在設計的數(shù)對引物中篩選出的一對最佳引物，在對20份現(xiàn)場檢材的HTN3標記檢驗中經(jīng)測序驗證未發(fā)現(xiàn)有假陽性結(jié)果。RPA技術在司法鑒定領域未有相關報道和應用，本研究引入RPA技術應用于法醫(yī)物證的體液鑒定，可解決體液來源的實驗室快速判定。后續(xù)研究將進一步利用RPA技術的優(yōu)勢，結(jié)合人類多種體液特異性分子標識，嘗試建立一套特異性強、靈敏度高、重復性好、結(jié)果判定準確，可用于常規(guī)法醫(yī)物證實驗室的精準體液鑒定復合檢測體系。