鐵死亡在口腔癌治療中的研究進展

田繡云， 張配， 黃慶洋， 周美云， 羅彬， 陳鑫如， 徐錦程

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科，安徽 蚌埠（233000）

Dixon 在2012 年首次提出了鐵死亡（ferroptosis）的概念，是細(xì)胞發(fā)生鐵依賴的脂質(zhì)過氧化（lipid peroxidation，LPO），是一種程序性死亡。鐵死亡不具有典型的細(xì)胞壞死或凋亡的形態(tài)，表現(xiàn)為線粒體嵴的減少或消失、線粒體膜濃縮、密度增高，細(xì)胞膜和細(xì)胞核大小基本正常［1］?？谇话┦且环N極為常見的惡性腫瘤，具有高復(fù)發(fā)率、高耐藥性等特點，誘導(dǎo)其發(fā)生鐵死亡是一種潛在的新治療策略。本文系統(tǒng)介紹了鐵死亡發(fā)生發(fā)展的機制以及鐵死亡在口腔癌治療方面的最新進展和研究前景，旨為口腔癌的治療提供新的思路和方法。

1 鐵死亡發(fā)生的機制

鐵死亡發(fā)生機制包括谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）失活、鐵離子含量增多、含磷脂的多不飽和脂肪（polyunsaturated fatty acid，PUFA）發(fā)生過氧化等（圖1）。細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如活性氧（reactive oxygen species，ROS）積累、4-羥基壬烯醛及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量顯著增加［2］。脂質(zhì)過氧化的毒性產(chǎn)物及ROS 的含量過高會造成DNA 和RNA 的變性降解、脂質(zhì)的損傷及蛋白質(zhì)活性下調(diào)。當(dāng)下已研制出的鐵死亡誘導(dǎo)劑包括柳氮磺胺吡啶、Erastin、Ras 選擇性致死小分子3（Ras-selective le-thal small molecule 3，RSL3）等，鐵死亡抑制劑如鐵抑素-1、Liproxstatin-1 和維生素E 等物質(zhì)是通過抑制脂質(zhì)ROS、MDA等過氧化物的產(chǎn)生從而抑制鐵死亡。

1.1 谷胱甘肽及氨基酸代謝異常

糖、脂肪和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)不能直接擴散進入到細(xì)胞內(nèi)，它們必須通過特定轉(zhuǎn)運體才能穿過細(xì)胞膜。細(xì)胞膜上存在氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，如胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（system Xc-）由溶質(zhì)載體家族SLC7A11 和SLC3A2 構(gòu)成，可排出或攝取谷氨酸（glutamate）和胱氨酸（cystine）并維持兩者動態(tài)平衡的系統(tǒng)，胱氨酸在細(xì)胞內(nèi)被還原成半胱氨酸（cysteine，Cys），參與谷胱甘肽（glutathione，GSH）的合成［3］。GPX4 將GSH 轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG），過氧鍵轉(zhuǎn)化為羥基，毒性產(chǎn)物L(fēng)-OOH 還原為相應(yīng)L-OH。

Figure 1 Mechanisms associated with ferroptosis圖1 鐵死亡相關(guān)機制

鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin 主要抑制system Xc-中的SLC7A11 的功能；鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3 直接或者間接抑制GPX4 的活性，脂質(zhì)ROS 積累，最終細(xì)胞發(fā)生鐵死亡［4］。Dixon 等［5］研究表明Necrostatin-1 等壞死抑制劑和氯喹或3-甲基腺嘌呤等自噬抑制劑都不能抑制Erastin 和RSL3 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。Sun等［6］表示Fin56 是目前最新的鐵死亡誘導(dǎo)劑，與激活細(xì)胞發(fā)生自噬聯(lián)合應(yīng)用可發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，主要促進GPX4 的降解，然而這種降解的機制目前還不完全清楚。

1.2 鐵離子代謝異常

為了滿足新陳代謝需求和促進自身生長，腫瘤細(xì)胞對鐵的需求比正常的細(xì)胞更大，這使它們更容易受到鐵死亡的影響［7］。細(xì)胞中Fe2+是攜帶Fe3+的轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，TF）與細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor，TFR）相結(jié)合，經(jīng)6 次跨膜前列腺跨膜上皮抗原3（six-transmembrane epithelial antigen of the prostate 3，STEAP3）還 原 為Fe2+，再由二價金屬轉(zhuǎn)運蛋白-1（recombinant divalent metal transporter-1，DMT-1）運輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)內(nèi)；由鐵蛋白被核受體共激活因子4（nuclear receptor coactivator 4，NCOA4）經(jīng)自噬溶酶體降解后釋放出Fe2+。細(xì)胞內(nèi)的Fe2+部分存在于線粒體不穩(wěn)定鐵池中，部分儲存在鐵蛋白重鏈（ferritin heavy chain 1，F(xiàn)TH1）和鐵蛋白輕鏈組成的鐵儲蛋白復(fù)合物中。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生鐵超載時，過多的游離Fe2+與過氧化氫（H2O2）發(fā)生芬頓反應(yīng)產(chǎn)生大量毒性產(chǎn)物和ROS，促使細(xì)胞發(fā)生鐵死亡［8］。

Keap1 是一種底物銜接蛋白，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)主要和核因子紅細(xì)胞相關(guān)因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）相結(jié)合，正常情況下在細(xì)胞質(zhì)中通過泛素化與Nrf2 相結(jié)合。p62 在Nrf2 處相互競爭Keap1 上的結(jié)合位點，當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激時，P62 與Keap1結(jié)合，Nrf2 與Keap1 泛素化斷裂，Nrf2 則由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，從而使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Nrf2 降低［9］。Nrf2 的下游靶基因包括膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白（ferroportin，F(xiàn)PN）、FTH1、血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）和醌氧化還原酶1（NAD（P）H quinine oxidoreductase 1，NQO1）等的下調(diào)，會使細(xì)胞內(nèi)游離鐵離子增多，抗氧化應(yīng)激能力降低，ROS 增多［10-11］。ROS 的過量生產(chǎn)也會攻擊鐵蛋白和含鐵的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致不穩(wěn)定的鐵釋放。因此Nrf2 可作為抗氧化調(diào)節(jié)劑可用來阻止鐵死亡的發(fā)生。Li 等［12］的研究已表明上調(diào)Nrf2/HO-1 通路可減輕細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。

1.3 脂質(zhì)代謝異常

游離的PUFA 可被酰輔酶A 合成酶長鏈家族成員4（Acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）和溶血磷脂酰膽堿酰基轉(zhuǎn)移酶3（lysophosphatidylcholine acyltransferase 3，LPCAT3）激活并入磷脂膜中發(fā)生脂質(zhì)過氧化［13］。研究表明在PUFA 相關(guān)磷脂中含有花生四烯酸（arachidonic acid，AA）以及腎上腺素基團磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamines，PEs）的部分被證明是細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化的重要部分［14］。

1.4 其他影響鐵死亡的通路

鐵死亡抑制蛋白1（ferroptosis suppressor protein 1，F(xiàn)SP1）作為氧化還原酶經(jīng)豆蔻?；荒技劫|(zhì)膜（細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等）上，F(xiàn)SP1 還原輔酶Q10（coenzyme Q10，CoQ10）阻止脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的致死性積累。研究表明胱氨酸也可增加細(xì)胞內(nèi)CoQ10 的含量。FSP1/CoQ10/NAD（P）H 通路作為一個平行系統(tǒng)存在，即能夠獨立于GPX4 通路抑制鐵死亡，又可與GSH-GPX4 協(xié)同工作抑制磷脂過氧化和鐵死亡［15］。

2 鐵死亡與口腔癌的治療

口腔癌在全球每年新增約60 萬例，死亡率為40%～50%。人類乳頭瘤狀病毒（human papillomavirus，HPV）、咀嚼檳榔、吸煙等均為口腔癌發(fā)生的高危因素，常伴有嚴(yán)重疼痛、出血破潰、咬合關(guān)系錯亂、口腔異味明顯，晚期可出現(xiàn)面部畸形、組織壞死、頜骨骨折等癥狀，易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，局部復(fù)發(fā)率高，患者預(yù)后較差，生活質(zhì)量較低［16-17］。雖然使用了手術(shù)、藥物以及放化療等各種方法聯(lián)合治療口腔癌，但癌細(xì)胞仍易產(chǎn)生較高的放化療耐藥性，5 年生存率仍較低。

目前鐵死亡作為一種腫瘤抑制機制，被視為人類疾病的潛在治療方法。細(xì)胞抗氧化功能與癌癥進展相關(guān)，口腔癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡導(dǎo)致其抗氧化應(yīng)激能力降低，即細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生氧氣的氧化劑和抗氧化劑之間平衡失調(diào)，造成線粒體以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體等功能障礙，細(xì)胞內(nèi)相關(guān)的基因組不穩(wěn)定，GPX4、HO-1、Nrf2、SLC7A11 等抗氧化劑被抑制，產(chǎn)生大量毒性物質(zhì)和ROS，過量的ROS 使癌細(xì)胞持續(xù)處于氧化應(yīng)激的狀態(tài)，最終發(fā)生癌細(xì)胞死亡以及實體腫瘤逐漸消退。這種細(xì)胞死亡機制不需要caspase 激活，也不需要其他凋亡效應(yīng)因子（如Bax 或BAK）的參與。外源性添加多不飽和脂肪、葡萄糖或胰蛋白酶等可增加細(xì)胞對鐵死亡的敏感性。已有研究表明鐵死亡與諸多癌癥相關(guān)，如肺癌、膀胱癌、肝癌等［4,6,9］，激活癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡可有效抑制腫瘤增殖，增強放療、化療以及免疫治療的效果。

2.1 鐵死亡與耐藥性

化療藥物（如順鉑、卡鉑等）的高耐藥性是腫瘤復(fù)發(fā)和疾病特異性死亡的重要驅(qū)動因素。具有化療耐藥性的癌細(xì)胞獲得間充質(zhì)特征便允許發(fā)生侵襲和遷移，導(dǎo)致癌癥患者的臨床治療效果不佳。癌細(xì)胞暴露于化療藥物中，高濃度ROS 的產(chǎn)生抑制癌細(xì)胞的增殖，而癌細(xì)胞啟動某種機制抵抗ROS 的產(chǎn)生因此產(chǎn)生耐藥。研究表明順鉑耐藥性與癌細(xì)胞氧化應(yīng)激后的代謝恢復(fù)有關(guān)［18］，如糖代謝、脂肪酸代謝、氨基酸代謝。最近一些學(xué)者觀察到了順鉑可作為鐵死亡的誘導(dǎo)劑，與Erastin 聯(lián)合治療惡性腫瘤存在顯著的協(xié)同效應(yīng)，一些易轉(zhuǎn)移的間充質(zhì)癌對化療藥物有高度耐藥性，但對鐵死亡敏感性高［19］。Lee 等［20］表明谷氧還蛋白5（glutaredoxin 5，GLRX5）沉默后細(xì)胞內(nèi)游離鐵離子增加，ROS 積累，耐藥口腔癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。Roh等［21］表明青蒿琥酯可通過抑制Nrf2/ARE 通路，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)GSH 耗竭以及ROS 積累而發(fā)生鐵死亡，并逆轉(zhuǎn)耐藥癌細(xì)胞的鐵死亡抗性。部分siRNA 和shRNA 也通過抑制癌細(xì)胞中的system Xc-致GSH耗竭，從而導(dǎo)致順鉑耐藥癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。You等［19］表明抑制線粒體丙酮酸載體1（mitochondrial pyruvate carrier 1，MPC1）的缺失可下調(diào)GPX4 或抑制xCT 殺死耐藥性口腔癌細(xì)胞，同時破壞抗氧化系統(tǒng)，增加了線粒體ROS 的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化發(fā)生。Sato 等［22］表明非熱等離子體（non-thermal plasma，NTP）可特異性使口腔癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，在放射治療和化療完成之前應(yīng)用NTP 作為一種附加治療是可行的。Sun 等［23］表明癌細(xì)胞中YES 關(guān)聯(lián)蛋白（Yes-associated protein，YAP）/具有PDZ 結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄輔激活子（transcriptional coactivator with PDZ binding motif，TAZ）為鐵死亡相關(guān)通路之一，但其過度激活或功能突變會提高癌細(xì)胞對治療藥物產(chǎn)生耐藥性。

2.2 鐵死亡與免疫功能

口腔癌也屬于免疫抑制性疾病，癌細(xì)胞通過免疫抑制細(xì)胞因子積聚、細(xì)胞活性和抗原呈遞功能受損、T 細(xì)胞耗竭等逃避免疫監(jiān)視和抗腫瘤免疫反應(yīng)。誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡可激活免疫細(xì)胞的能力，可作為增強免疫治療活性的策略。巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中的主要吞噬細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞，M1-M2 巨噬細(xì)胞極化系統(tǒng)中，M1 亞型在TME 中有高水平的腫瘤壞死因子、組織相容性復(fù)合體2（major histocompatibility complex2，MHC2）或誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的情況下被激活，M2 亞型在TME 中存在高水平的精氨酸酶1（arginase 1，ARG1）、IL-10 等的情況下被激活。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAM）為M2 型，將TAM 從M2 表型復(fù)極化為M1 表型可提高免疫治療的療效［24］。SOCS1 可下調(diào)p53 靶基因和SLC7A11 的表達誘導(dǎo)鐵死亡，在口腔癌中FTHI 的表達與M2 型巨噬細(xì)胞的浸潤呈現(xiàn)為正相關(guān)，增加SOCS1 的表達或降低FTH1 的表達可誘導(dǎo)口腔癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡；鐵死亡相關(guān)因子SOCS1 與M1 巨噬細(xì)胞存在某種關(guān)聯(lián)，但其具體的調(diào)控機制尚未明確，研究者推測其可能通過SOCS1和FTH1 保持動態(tài)平衡共同調(diào)控腫瘤的增殖［25］。癌細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子高遷移率族蛋白B1（highmobility group protein 1，HMGB1）可以促進巨噬細(xì)胞向M1 型極化，HMGB1 缺失可抑制鐵死亡的發(fā)生。部分免疫系統(tǒng)可能通過鐵死亡介導(dǎo)CD8+T 細(xì)胞分泌IFN-γ 抑制腫瘤活性，同時與免疫檢查點阻斷發(fā)揮協(xié)同作用，CD8+T 細(xì)胞可通過調(diào)控IFN-γ 的產(chǎn)生來抑制system Xc-中的SLC7A11 和SLC3A2 亞基誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。IFN-γ 在特定情況下可上調(diào)細(xì)胞程序性死亡配體1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）的表達幫助癌細(xì)胞進行免疫逃逸，用PD-L1 阻斷劑和GSH 缺失治療可激活T 細(xì)胞的抗腫瘤活性，并在體內(nèi)誘導(dǎo)癌細(xì)胞鐵死亡［26］。Li 等［27］表明口腔癌患者因免疫B 細(xì)胞抑制腫瘤生長以及樹突狀細(xì)胞數(shù)量顯著增高而激活的免疫反應(yīng)都與鐵死亡有關(guān)。

2.3 鐵死亡與治療藥物

姜黃素類似物、奎尼司坦、青蒿素衍生物等藥物可誘導(dǎo)口腔腫瘤發(fā)生鐵死亡。吉非替尼和二甲雙胍可能是治療復(fù)發(fā)或晚期口腔癌潛在新藥［28］。研究表明組蛋白去乙?；敢种苿┩ㄟ^抑制GPX4 相關(guān)通路而誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）中CAL-27、TCA-8113 細(xì)胞發(fā)生鐵死亡［29］。Cai 等［30］表明雷公藤甲素（triptolide，TPL）抑制線粒體己糖激酶Ⅱ（hexokinase-Ⅱ，HK-Ⅱ）和有氧糖酵解促進口腔癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，TPL 與Erastin 的聯(lián)合使用在體外和裸鼠模型中對抑制腫瘤存活方面發(fā)揮了強大的協(xié)同效應(yīng)。與傳統(tǒng)藥物相比，配制納米藥物載體可以克服化療藥物的溶解度問題和有限的膜通透性，并且具有較好的生物相容性。Qian 等［31］表明納米材料可以通過參與生化反應(yīng)和干擾代謝平衡來最大限度地促進活性氧的形成，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，另一方面，它們可特異性直接攻擊腫瘤組織，是目前在癌癥治療領(lǐng)域的研究熱點，但其臨床轉(zhuǎn)化方面仍不盡如人意。

2.4 鐵死亡與治療靶點

p53 已被證明是細(xì)胞生長、增殖和鐵死亡的中心調(diào)節(jié)因子，誘導(dǎo)受損細(xì)胞凋亡來保護細(xì)胞免受致癌轉(zhuǎn)化，p53 對凋亡的調(diào)控涉及細(xì)胞對線粒體呼吸作用和脂質(zhì)過氧化變化的反應(yīng)。Fukuda 等［32］表明當(dāng)p53 基因點突變功能喪失后，GPX4 會激活，鐵死亡被抑制，因此促進了口腔腫瘤的生長。GPX4作為哺乳動物中最重要的抗氧化和脂質(zhì)修復(fù)酶之一，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)SLC7A11 較低時，GPX4 因底物GSH合成不足而失活，細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化。腫瘤抑制因子p53 和BAP1 下調(diào)SLC7A11 基因以及MRP1在癌細(xì)胞中的高表達均可抑制GSH 的攝取從而促進癌細(xì)胞株發(fā)生鐵死亡［33］。SLC7A11 可作為一個治療口腔癌的潛在的靶向標(biāo)志物。Hémon 等［34］表明在HPV 陽性的口腔癌患者中，SLC7A11 低表達比SLC7A11 高表達對鐵死亡更敏感。卵巢腫瘤家族成員泛素醛結(jié)合1（ovarian tumor family member deubiquitinase，ubiquitin aldehyde binding 1，OTUB1）被確定為SLC7A11 穩(wěn)定因子，OTUB1 失活可使腫瘤細(xì)胞對鐵死亡敏感［33］，但在口腔癌治療中的應(yīng)用需進一步研究。環(huán)狀RNA（circular RNA，CircRNA）對OSCC 發(fā)生發(fā)展的調(diào)控作用，通過microRNA 調(diào)控內(nèi)源性RNA，或通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶9 相關(guān)mRNA 的穩(wěn)定性促進OSCC 的轉(zhuǎn)移［35-36］。CircRNA_100290 靶向miR-378a，通過葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1 和糖酵解調(diào)節(jié)OSCC 進展［37］。Yang 等［38］表明circFNDC3B調(diào)節(jié)miR-520d-5p靶向增加SLC7A11 以抑制OSCC 細(xì)胞鐵死亡，從而促進腫瘤增殖，SLC7A11與miR-520 家族其他成員是否具有相關(guān)性仍需要進一步研究，如miR-520c-5p、miR-520f-3p、miR-520a-5p 等。

Fox 等［39］表明Nrf2 激活促進休眠腫瘤細(xì)胞的復(fù)發(fā)，與不良預(yù)后相關(guān)。Hu 等［40］表明Nrf2 下游靶點FTH1 在口腔癌中的表達比正常組織中高，頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良與FTH1 的上調(diào)顯著相關(guān)。研究表明FTH1 作為口腔癌的獨立預(yù)后因素，與M1、M2 巨噬細(xì)胞浸潤相關(guān)［25］。FTH1 表達上調(diào)與大多數(shù)實體瘤中的巨噬細(xì)胞浸潤呈正相關(guān)［41］，其與預(yù)后的相關(guān)性及是否可作為口腔腫瘤治療的靶點仍需進一步研究。

本綜述系統(tǒng)介紹了鐵死亡的機制及其在口腔癌治療方面的應(yīng)用，希望有助于科研人員進行更深一層的研究，如研發(fā)新藥和新治療機制，最終為臨床治療口腔癌做出貢獻。

【Author contributions】 Tian XY collected the references and wrote the article. Zhang P, Huang QY, Zhou MY, Luo B, Chen XR revised the article. Xu JC guided the writing of the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.