浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其與網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚病害的關(guān)系

陳 鶴，李筱鑫，崔 婧，蒙愛云，駱大鵬，劉慶明，邱名毅，涂志剛

（1.海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院，?？?571126;2.新南威爾士大學(xué)，新南威爾士州 悉尼 4385）

后水灣網(wǎng)箱魚類養(yǎng)殖區(qū)位于海南島西北部，儋州市和臨高縣境內(nèi)，以深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖為主，主要養(yǎng)殖品種為卵形鯧鲹，年養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到5×104t，為我國最大的深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖基地[1]。然而，由于長期開展網(wǎng)箱養(yǎng)殖以及養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖區(qū)的環(huán)境污染問題越來越突出。浮游細(xì)菌作為水體中各種有機(jī)物質(zhì)的分解者和轉(zhuǎn)化者，又是物質(zhì)和能量的貯存者，在水體物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中具有重要的作用[2-4]。同時(shí)，有些細(xì)菌，如弧菌、鏈球菌還是近海養(yǎng)殖的條件致病菌[1]。每當(dāng)臺(tái)風(fēng)過后，養(yǎng)殖環(huán)境條件惡化時(shí)，這些有害細(xì)菌大量增殖，導(dǎo)致海水養(yǎng)殖魚類發(fā)病[5]。已有研究結(jié)果[6]表明，養(yǎng)殖區(qū)微生物分布與魚類疾病發(fā)生緊密相關(guān)。浙江舟山網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)網(wǎng)箱內(nèi)細(xì)菌數(shù)量高于網(wǎng)箱外細(xì)菌數(shù)量，且細(xì)菌豐度的高峰期也是魚類發(fā)病最嚴(yán)重的時(shí)期[7]。大亞灣網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體中網(wǎng)箱內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量高于網(wǎng)箱外和對(duì)照區(qū)，且弧菌出現(xiàn)的高峰期與弧菌病害的流行期一致[8]。象山港網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)浮游細(xì)菌數(shù)量和弧菌數(shù)量均高于對(duì)照區(qū)，而多樣性均低于對(duì)照區(qū)，且某些特定細(xì)菌富集較為嚴(yán)重[9-10]。因此，監(jiān)測網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)域微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的動(dòng)態(tài)變化，探究浮游細(xì)菌群落，特別是潛在病原菌的分布規(guī)律，有助于在養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中及早采取措施預(yù)防網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類病害的爆發(fā)，推動(dòng)深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。本研究利用高通量測序技術(shù)分析臨高后水灣深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化，并探討浮游細(xì)菌群落變化與魚類細(xì)菌性病害的關(guān)系，研究結(jié)果將有助于揭示深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)不同養(yǎng)殖期浮游菌群變化規(guī)律，了解潛在病原菌對(duì)網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類的危害，為深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的健康發(fā)展及養(yǎng)殖魚類疾病的有效防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理樣品均采自海南臨高后水灣深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖基地。采樣時(shí)間分別為2016-03-15、2016-05-16、2016-07-18、2016-09-16、2016-11-14的漲潮期。根據(jù)養(yǎng)殖過程，將其分為4個(gè)階段，其中3月份為休養(yǎng)期，5月份為養(yǎng)殖初期，7月份和9月份為養(yǎng)殖中期，11月份為養(yǎng)殖后期。取樣點(diǎn)共設(shè)置3個(gè)站位，分別為22號(hào)網(wǎng)箱內(nèi)、網(wǎng)箱外以及對(duì)照區(qū)（離網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)1 km向海一側(cè)的非養(yǎng)殖區(qū)），編號(hào)分別為03in，03out，05in，05out，05con，07in，07out，07con，09in，09out，09con，11in，11out，11con，每個(gè)站位3個(gè)重復(fù)。將采集到的水樣低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，充分搖勻后，重復(fù)組水樣等量混合，先用3μm無菌濾膜預(yù)過濾，再用0.22μm無菌濾膜過濾1L等量混合后的水樣，將過濾后的濾膜4℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)，統(tǒng)計(jì)監(jiān)測月份該網(wǎng)箱每天病死魚數(shù)量。

1.2 基因組DNA提取利用OMEGA試劑盒（E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit）提取宏基因組DNA。采用NanoDrop微量分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和完整性，用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒檢測DNA濃度。將符合實(shí)驗(yàn)要求的DNA置于-20℃保存，備用。

1.3 樣品浮游細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增 DNA樣品委托上海生工生物工程有限公司測序，采用16S rDNA V3-V4通用融合引物341F(5′-CCCTA CACGACGCTCTTCCGATCTG(barcode)CCTACG GGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTGGAGTT CCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGG GTATCTAATCC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測，采用生工瓊脂回收試劑盒（Cat:SK8131）純化回收；利用Illumina Miseq測序平臺(tái)進(jìn)行高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析所獲得的序列分別利用Qiime（version1.7.0）和Mothur軟件（version 1.31.2）進(jìn)行過濾和去除嵌合體序列[11]，得到高質(zhì)量的基因序列[12]。再運(yùn)用Mothur軟件對(duì)序列進(jìn)行OTU（Operational Taxonomic Units）聚類。相似度在97%以上的OTU代表序列采用RDP classifier貝葉斯算法[13]進(jìn)行分類學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成?；贠TU聚類分析結(jié)果，對(duì)OTU進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)等分析、群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析以及unifrac等分析[14-15]，最后進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育等的統(tǒng)計(jì)學(xué)和可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Illumina序列多樣性根據(jù)16S rRNA基因高通量測定結(jié)果，在采集的14份水樣中共得到758641條原始序列，處理后得到686191條高質(zhì)量序列，每個(gè)樣品序列數(shù)目為28032～65019條不等，序列長度平均值為421 bp。稀釋曲線分析（圖1-A）顯示，隨著測序數(shù)量的增加，稀釋曲線逐漸趨于平緩，表明該測序量已經(jīng)基本能反映該實(shí)驗(yàn)中細(xì)菌群落多樣性。浮游細(xì)菌香農(nóng)-威納指數(shù)如圖1-B所示，平均值變化范圍為2.47～4.5，不同養(yǎng)殖期差異較大，總體上表現(xiàn)為養(yǎng)殖后期>休養(yǎng)期>養(yǎng)殖初期和養(yǎng)殖中期。

圖1 各樣品的浮游細(xì)菌16S rRNA基因的α多樣性分析

2.2 主成分分析和聚類分析主成分分析（PCA）結(jié)果顯示（圖2-A），浮游細(xì)菌菌群可分為4組，分別為休養(yǎng)期、養(yǎng)殖初期、養(yǎng)殖中期、養(yǎng)殖后期。這表明養(yǎng)殖區(qū)水體中菌落組成與不同養(yǎng)殖期關(guān)系較大?；赨nifrac的聚類分析，可以分為3組，休養(yǎng)期、養(yǎng)殖后期、養(yǎng)殖初期和中期（圖2-B）?？扑降募?xì)菌群落Heatmap分析結(jié)果基本一致，相同養(yǎng)殖期能較好地聚在一起（圖2-C）。

圖2 不同月份網(wǎng)箱內(nèi)外及對(duì)照區(qū)樣品浮游細(xì)菌群落相似性分析

2.3 浮游細(xì)菌多樣性

2.3.1 浮游細(xì)菌群落組成在采集到的14份樣品中，共檢測到36個(gè)門、56個(gè)綱、98個(gè)目、235個(gè)科、807個(gè)屬的浮游細(xì)菌。未能鑒定的序列總數(shù)為41404，占總序列數(shù)的6.21%，表明樣本中還有大量未知的類群。浮游細(xì)菌群落分布結(jié)構(gòu)（圖3）相對(duì)較為穩(wěn)定，以變形菌門（Proteobacteria）γ-變形菌綱為主要的優(yōu)勢類群；次優(yōu)勢類群為擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria），以上5類菌門相對(duì)比例之和變化范圍為97.14%～99.63%，其他類菌門所占比例之和不足3%。

圖3 門水平浮游細(xì)菌群落組成

在科的水平上（圖4），養(yǎng)殖區(qū)以鹽單胞菌科（Halomonadaceae）、紅桿菌科（Rhodobacteraceae）、弧菌科（Vibrionaceae）、交替單胞菌科（Alteromonadaceae）等為主要的優(yōu)勢類群，其中鹽單胞菌科為養(yǎng)殖初期和養(yǎng)殖中期主要優(yōu)勢類群，其相對(duì)豐度最高可達(dá)61.16%；紅桿菌科為休養(yǎng)期的主要優(yōu)勢類群；弧菌科細(xì)菌在各監(jiān)測站位均有發(fā)現(xiàn)，以5月份和9月份網(wǎng)箱內(nèi)豐度最高，相對(duì)豐度分別為9.91%和15.85%；藍(lán)細(xì)菌門的Family II科為養(yǎng)殖后期的優(yōu)勢類群。

圖4 科水平浮游細(xì)菌群落組成

在屬水平上（圖5），浮游細(xì)菌群落主要優(yōu)勢類群包括Cobetia屬、弧菌屬（Vibrio）、假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）、鹽單胞菌屬（Halomonas）以及藍(lán)細(xì)菌門的GpIIa屬等。其中，休養(yǎng)期的優(yōu)勢類群為Cobetia屬、玫瑰變色菌屬（Roseovarius）和嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）；養(yǎng)殖初期以Cobetia屬、假交替單胞菌屬、Kushneria屬和弧菌屬為主，其中網(wǎng)箱內(nèi)外弧菌相對(duì)豐度分別為9.61%和1.06%；養(yǎng)殖中期以Cobetia屬、鹽單胞菌屬、交替單胞菌屬（Alteromonas）和弧菌屬為主，其中9月份網(wǎng)箱內(nèi)外弧菌屬相對(duì)豐度分別為14.52%和4.11%；養(yǎng)殖后期優(yōu)勢類群為GpIIa屬和Cobetia屬。

圖5 屬水平浮游細(xì)菌群落組成

2.3.2 網(wǎng)箱內(nèi)外浮游細(xì)菌群落豐度差異性分析根據(jù)監(jiān)測月份菌落豐度誤差線（圖6）可知，各養(yǎng)殖階段差異菌群不同，休養(yǎng)期網(wǎng)箱內(nèi)外主要差異菌群為Cobetia屬、嗜冷桿菌以及黃桿菌屬等（圖6-A）；養(yǎng)殖初期主要差異菌群為Cobetia屬、Kushneria屬、假交替單胞菌屬、弧菌等（圖6-B），其中網(wǎng)箱內(nèi)弧菌、發(fā)光桿菌和交替單胞菌相對(duì)豐度高于網(wǎng)箱外；養(yǎng)殖中期主要差異菌類群為Cobetia屬、芽孢桿菌屬、弧菌屬等（圖6-C、D）；養(yǎng)殖后期主要差異菌類群為GpIIa屬、Cobetia屬等(圖6-E)。

圖6 各監(jiān)測月份屬水平網(wǎng)箱內(nèi)外浮游細(xì)菌菌落豐度誤差線圖

2.4 深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)弧菌與網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類病害的關(guān)系監(jiān)測月份網(wǎng)箱內(nèi)弧菌相對(duì)豐度與網(wǎng)箱內(nèi)單日平均死魚數(shù)量關(guān)系（圖7）表明，在弧菌相對(duì)豐度含量較高的5、9月份，每天每口網(wǎng)箱的病死魚數(shù)量分別達(dá)到(484±241)尾和(278±110)尾；而弧菌相對(duì)豐度較低的7月份和11月份，每天每口網(wǎng)箱病死魚數(shù)量分別為(26±12)尾和(50±22)尾。

圖7 不同月份弧菌相對(duì)豐度與監(jiān)測區(qū)域每日每口網(wǎng)箱平均死魚數(shù)量的關(guān)系

由此可見，養(yǎng)殖初期和養(yǎng)殖中期9月份網(wǎng)箱內(nèi)弧菌含量最高，且均顯著高于網(wǎng)箱外弧菌相對(duì)豐度，而休養(yǎng)期、養(yǎng)殖中期7月份以及養(yǎng)殖后期網(wǎng)箱內(nèi)外弧菌屬相對(duì)豐度較低，表明調(diào)查區(qū)域水體中弧菌出現(xiàn)的高峰期在養(yǎng)殖初期和養(yǎng)殖中期9月份。根據(jù)監(jiān)測月份網(wǎng)箱內(nèi)單日平均死魚數(shù)量可知，細(xì)菌性疾病引發(fā)魚類死亡的高峰期也為每年5月份和9月份，表明弧菌引起的細(xì)菌病害為引起后水灣深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)域魚類死亡的主要病害類型。后水灣每年從3月底至4月初開始投放卵形鯧鲹魚苗進(jìn)行標(biāo)粗，至5月份魚苗規(guī)格可以達(dá)到每尾10～15 cm，周長80 m的網(wǎng)箱放養(yǎng)密度每口高達(dá)40萬～60萬尾。高密度養(yǎng)殖會(huì)引起網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)域殘餌及糞便增多，水體中營養(yǎng)鹽富集，適宜弧菌等異養(yǎng)菌的生長。因此，5月份是養(yǎng)殖卵形鯧

鲹弧菌病害發(fā)生的第一個(gè)高峰期。7月份，經(jīng)過標(biāo)粗的卵形鯧鲹苗被分裝到其他網(wǎng)箱，網(wǎng)箱養(yǎng)殖密度隨之下降，養(yǎng)殖區(qū)水體環(huán)境得到有效改善，短期內(nèi)養(yǎng)殖魚類病害明顯減少。8月中下旬，隨著海水平均溫度下降到28～30 ℃，網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類開始感染刺激隱核蟲，隨后繼發(fā)性感染細(xì)菌，引起魚類出現(xiàn)爛身、爛尾等病害，嚴(yán)重時(shí)魚類會(huì)出現(xiàn)大量死亡。因此，9月份是后水灣網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類弧菌病害發(fā)生的第二個(gè)高峰期。每年3月份和11月份海水溫度較低，水體中以Cobetia和GpIIa屬等細(xì)菌為主，弧菌含量較低，網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類病害也較少。

3 討 論

3.1 深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)浮游細(xì)菌群落多樣性傳統(tǒng)的研究方法只能探測到環(huán)境中極少部分的微生物群落信息（0.01%～10.0%），難以客觀地揭示微生物類群及多樣性[16-17]。本研究利用16S rRNA基因高通量測序技術(shù)對(duì)深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，所獲得測序樣品文庫的覆蓋率均在99%以上，能夠較高程度地反映水體中浮游細(xì)菌群落的多樣性。調(diào)查區(qū)域浮游細(xì)菌Shannon-Wiener多樣性指數(shù)平均值為3.65，表明浮游細(xì)菌群落比較豐富，多樣性水平均較高。究其原因可能是調(diào)查期間海水平均溫度均高于27℃，總體上適宜細(xì)菌繁殖與生長；此外，由于監(jiān)測區(qū)域深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)位于離岸2 km，水深為15 m以上水域，水質(zhì)良好，水體懸浮物濃度為0.5～7 mg·L-1，透光性好，初級(jí)生產(chǎn)力強(qiáng)，能為浮游細(xì)菌生長提供源源不斷的營養(yǎng)物質(zhì)。不同養(yǎng)殖期差異較大，總體上表現(xiàn)為養(yǎng)殖后期>休養(yǎng)期>養(yǎng)殖初期和養(yǎng)殖中期，這可能是養(yǎng)殖初期和養(yǎng)殖中期，水體富含營養(yǎng)鹽，一些異氧菌，如鹽單胞菌屬、交替單胞菌屬、假交替單胞和弧菌屬等異氧菌含量較高，浮游細(xì)菌多樣性下降；而在休養(yǎng)期和養(yǎng)殖后期，營養(yǎng)鹽含量較低，不適宜異氧菌生長，其他菌屬，如玫瑰變色菌屬、嗜冷桿菌屬和GpIIa屬等成為優(yōu)勢菌屬，浮游細(xì)菌多樣性升高。

3.2 深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)浮游群落組成特征不同海域浮游細(xì)菌群落組成存在差異。洋山港水域細(xì)菌主要由變形菌、擬桿菌這兩大類組成，其中γ-變形菌為優(yōu)勢類群[18]；山東近海海水樣品中α-變形菌為優(yōu)勢類群[19]；北黃海近海海水樣品中γ-變形菌和黃桿菌為優(yōu)勢類群[20]；南海南部海域浮游細(xì)菌群落優(yōu)勢類群為變形菌門γ-變形菌綱和α-變形菌綱、藍(lán)藻門藍(lán)藻菌綱和擬桿菌門黃桿菌綱[6]。臨高后水灣深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)主要的優(yōu)勢類群為變形菌門的γ-變形菌。盡管如此，這些類群均為海水常見細(xì)菌類群，與國內(nèi)外海洋細(xì)菌組成的相關(guān)研究結(jié)果一致[21-23]。

不同養(yǎng)殖期屬水平優(yōu)勢類群差異較大，可能與溫度和營養(yǎng)鹽變化有關(guān)。Cobetia屬因?yàn)榫哂休^強(qiáng)的適應(yīng)能力，對(duì)溫度、鹽度和溶解氧的適應(yīng)范圍廣[24]，成為各養(yǎng)殖期的主要優(yōu)勢類群?；【犬愷B(yǎng)菌的分布受溫度、總有機(jī)碳、總磷和活性磷酸鹽等環(huán)境因子驅(qū)動(dòng)[25]，在溫度以及總氮或者總磷含量較高的養(yǎng)殖初期和中期，弧菌等異養(yǎng)菌的相對(duì)豐度也較高。藍(lán)細(xì)菌豐度僅在養(yǎng)殖后期最高，可能的原因?yàn)轲B(yǎng)殖后期大量浮游植物繁殖，導(dǎo)致秋季營養(yǎng)鹽低于春季[26]，營養(yǎng)鹽降低不利于異氧菌生長，而藍(lán)細(xì)菌可以通過光合作用成為該時(shí)段的優(yōu)勢類群。嗜冷桿菌為一種革蘭氏陰性菌，目前已知的嗜冷桿菌種類主要來自南極冰層、永久凍土以及海洋等環(huán)境[27]，嗜冷桿菌的分布主要與溫度有關(guān)，溫度越低，嗜冷桿菌相對(duì)豐度越高，也與本次研究結(jié)果一致。

3.3 浮游細(xì)菌群落組成與魚類疾病的關(guān)系網(wǎng)箱養(yǎng)殖卵形鯧鲹受細(xì)菌性病害和寄生蟲病害危害較大，特別是由于刺激隱核蟲病害發(fā)生后繼發(fā)性細(xì)菌感染越來越嚴(yán)重。目前已報(bào)道的卵形鯧鲹細(xì)菌性病原菌包括哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、嗜麥芽假單胞菌（Pseudomonas maltophilia）、美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種（Photobacterium damselaesubsp.piscicida）、海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）和鰤魚諾卡氏菌（Nocardia seriolae）[5,28-31]，尤其以弧菌引起的病害最為嚴(yán)重，且哈維氏弧菌已經(jīng)成為影響海南海水養(yǎng)殖魚類弧菌病的主要病原菌[32]。

網(wǎng)箱養(yǎng)殖初期和中期由于養(yǎng)殖密度較大，網(wǎng)箱內(nèi)魚類殘餌及糞便增多，易引起水體中營養(yǎng)鹽富集，為弧菌快速繁殖提供了有利條件，從而引發(fā)網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類弧菌病害。湛江港網(wǎng)箱養(yǎng)殖海區(qū)弧菌豐度出現(xiàn)在營養(yǎng)鹽豐富、水溫較高、水體污染嚴(yán)重的夏、秋季，且優(yōu)勢弧菌種類以哈氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌為主[10]。基于16S rDNA宏基因組構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，后水灣監(jiān)測月份優(yōu)勢弧菌屬分別與哈維氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、塔氏弧菌、鰻弧菌、錫那羅州弧菌等致病性弧菌聚類，進(jìn)一步表明弧菌可能為引起后水灣深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)魚類發(fā)病的主要潛在病原菌。

4 結(jié) 論

后水灣深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)浮游細(xì)菌群落具有高度豐富的多樣性，變形菌門是養(yǎng)殖區(qū)主要優(yōu)勢門類，其次為擬桿菌門、放線菌門、厚壁菌門和藍(lán)細(xì)菌門；主要類群為Cobetia屬、弧菌屬（Vibrio）、假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）、鹽單胞菌屬（Halomonas）以及藍(lán)細(xì)菌門的GpIIa屬等，不同養(yǎng)殖期優(yōu)勢類群差異較大。網(wǎng)箱內(nèi)外主要差異類群為Cobetia屬、假交替單胞菌屬和弧菌屬等。潛在致病菌弧菌屬在養(yǎng)殖初期、中期含量較高，而在休養(yǎng)期和養(yǎng)殖后期含量較低，與網(wǎng)箱養(yǎng)殖卵形鯧鲹細(xì)菌性病害發(fā)病規(guī)律相吻合，表明弧菌病為該養(yǎng)殖區(qū)魚類的主要病害類型。