基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接探討透膿散以IL－6為核心的免疫炎癥調(diào)控干預(yù)肉芽腫性乳腺炎的機(jī)制及驗(yàn)證研究

劉春妘，劉曉菲，，3?，孫穎，陳翰翰，張麗美

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014；3.山東省中醫(yī)經(jīng)典名方協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 濟(jì)南 250014；4.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014）

肉芽腫性乳腺炎（granulomatous mastitis，GLM）是特發(fā)性乳腺肉芽腫性炎癥的統(tǒng)稱，是一種罕見的不明原因?qū)е碌姆歉衫倚匀庋磕[和小膿腫局部化到乳腺小葉的疾病［1］。本病病因尚不明確，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)本病的發(fā)病與炎癥反應(yīng)、泌乳素增高及自身免疫等原因相關(guān)［2－4］。

近代醫(yī)家認(rèn)為本病的治療全程貫穿消、托、補(bǔ)三法，尤以托法為樞機(jī)，在急性期“清托”使癰瘍內(nèi)消，遷延期可結(jié)合“補(bǔ)托”對(duì)伴發(fā)的痰、濁、瘀、毒起到消散作用，以加減透膿散配合其他藥物治療，臨床收效良好［5－6］。西醫(yī)關(guān)于GLM 的治療尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，一般采用觀察、類固醇、手術(shù)干預(yù)或免疫抑制劑療法（例如甲氨蝶呤），手術(shù)切除不僅影響乳房外觀且復(fù)發(fā)概率高，患者大多難以接受［7］。因此保守治療顯得尤為重要，透膿散加減治療GLM 臨床療效較好，臨床治愈率較高。

因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，研究透膿散治療GLM 的潛在作用機(jī)制，并利用臨床試驗(yàn)驗(yàn)證透膿散干預(yù)的以IL－6 為核心的免疫炎癥調(diào)控機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與儀器

1.1 主要儀器及試劑

RM2235 切片機(jī)（德國(guó)LEICA 公司）；捷達(dá)光學(xué)顯微鏡550D（沈陽(yáng)優(yōu)軟科技發(fā)展有限公司）；EG1150H型生物組織包埋機(jī)（德國(guó)LEICA公司）。

兔抗人IL－6 多克隆抗體（WL02841）、生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG（WLA037）、SP 免疫組化試劑盒（WLA044）、DAB 顯色試劑盒（WLA022）、PBS 緩沖液（WLA102）、檸檬酸鈉抗原修復(fù)液（WLA061）均為沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 透膿散制備

組方：黃芪30 g，當(dāng)歸15 g，皂角刺9 g，川芎12 g和醋穿山甲3 g。全部中藥由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供并進(jìn)行統(tǒng)一煎制，每劑煎煮至400 mL，早晚兩次分服。

2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

2.1 方法

2.1.1 篩選透膿散的活性化合物

采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medi－cine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），分別檢索“黃芪”“川芎”“當(dāng)歸”“皂角刺”，因穿山甲為國(guó)家保護(hù)動(dòng)物，且2020 版《中華人民共和國(guó)藥典》已將穿山甲移除，本著對(duì)稀有動(dòng)物保護(hù)的原則，本研究未對(duì)穿山甲進(jìn)行檢索及分析。根據(jù)口服利用度（OB）≥ 30%、藥類性（DL）≥ 0.18 的ADME 屬性值對(duì)中藥有效成分進(jìn)行初篩，獲得其活性化合物［8］。

2.1.2 “藥物－化合物－靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

查找活性化合物成分的靶點(diǎn)蛋白，黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及黃芪多糖應(yīng)用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)查找其靶點(diǎn)信息，運(yùn)用Cytoscape 分析并構(gòu)建“藥物－化合物－靶點(diǎn)”圖。

2.1.3 疾病靶點(diǎn)篩選及藥物疾病相互作用分析

在GeneCards、OMIM、TTD 疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)［9］以“granulomatous lobular mastitis”為關(guān)鍵詞檢索疾病基因，藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)相互映射。將上述得到的潛在靶點(diǎn)從STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)［10］界定“Homo Sapiens”得到蛋白相互作用關(guān)系，保存TSV 文件導(dǎo)入Cytoscape 運(yùn)用BisoGenet插件進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

2.1.4 繪制作用機(jī)制圖并分析其作用機(jī)制

將上述篩選得到的靶點(diǎn)信息導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)［11］，界定P＜ 0.05，進(jìn)行GO 及KEGG 富集分析，將富集分析結(jié)果進(jìn)行整合分析，選取富集排名前20 名的條目，通過(guò)OmicShare 云平臺(tái)繪制GO－BP、KEGG 氣泡圖，并應(yīng)用Cytoscape繪制通路靶點(diǎn)圖。

2.2 結(jié)果

2.2.1 透膿散活性化合物成分

通過(guò)TCMSP 分別檢索“黃芪”“川芎”“當(dāng)歸”“皂角刺”后得到活性化合物，雖然黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的OB、DL 值較低，黃芪多糖未收錄入TCMSP，但這些成分均已被證實(shí)是黃芪的主要活性成分，因此也一同納入。透膿散中化合物共得到969 個(gè)，主要包括異黃酮、黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、β－谷甾醇、槲皮素等。部分活性化合物見表1。

表1 透膿散部分活性化合物的基本信息

2.2.2 “藥物－化合物－靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

運(yùn)用Cytoscape 軟件構(gòu)建“藥物－活性化合物－靶點(diǎn)”圖，見圖1。該網(wǎng)絡(luò)共有261個(gè)相互作用靶點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)中綠色三角形代表透膿散中的藥物（CX 代表川芎，DG代表當(dāng)歸，ZJC 代表皂角刺，HQ 代表黃芪），淺藍(lán)色圓形代表活性化合物，橙色菱形代表靶點(diǎn)基因。一個(gè)化合物可與多個(gè)靶點(diǎn)相聯(lián)系，與中藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)契合，靶點(diǎn)也并非單獨(dú)發(fā)揮作用，而是相互聯(lián)系、相互協(xié)作的關(guān)系。

圖1 “藥物－化合物－靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.2.3 透膿散治療GLM的潛在作用靶點(diǎn)及拓?fù)浞治?/p>

通過(guò)GeneCards、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索到79個(gè)GLM 的潛在靶點(diǎn)，與藥物靶點(diǎn)進(jìn)行相互映射制作韋恩圖，共得到18個(gè)交集靶點(diǎn)，見圖2。將這18個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 運(yùn)用BisoGenet 插件進(jìn)行拓?fù)浞治觯玫絇PI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。根據(jù)Degree值篩選排名前10名的重要靶點(diǎn)，詳細(xì)信息見表2，靶點(diǎn)圖見圖4。

圖2 透膿散治療肉芽腫性乳腺炎潛在靶點(diǎn)韋恩圖

圖3 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

圖4 網(wǎng)絡(luò)排名前10的關(guān)鍵靶點(diǎn)

表2 透膿散治療肉芽腫性乳腺炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)信息

2.2.4 GO功能富集及KEGG信號(hào)通路富集分析

將潛在靶點(diǎn)提交至DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中，按照P＜ 0.05選取富集基因前20名進(jìn)行分析。GO生物過(guò)程137條，主要涉及炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、MAPK 級(jí)聯(lián)和細(xì)胞凋亡等，見圖5。KEGG 信號(hào)通路36 條，主要涉及NF－κB信號(hào)通路、Jak－STAT 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路和T細(xì)胞受體信號(hào)通路等，見圖6。

圖5 GO－BP氣泡圖

圖6 KEGG氣泡圖

2.2.5 繪制通路靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

根據(jù)蛋白與信號(hào)通路之間的關(guān)系，選取關(guān)鍵靶點(diǎn)，借助Cytoscape 軟件，繪制“靶點(diǎn)－通路”圖，見圖7。圖中可見靶點(diǎn)基因IL－6、TNF、NF－κB、Jak－STAT 信號(hào)通路與GLM 疾病相關(guān)性較高，且一個(gè)靶點(diǎn)與多條通路相互作用，體現(xiàn)了多靶點(diǎn)、多通路的共同作用機(jī)制。

圖7 “靶點(diǎn)－通路”圖

2.2.6 核心活性成分、靶點(diǎn)分子對(duì)接

利用Autoduck 軟件對(duì)核心活性成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，一般認(rèn)為結(jié)合能 ＜ ?4.25 kcal/mol則提示活性成分與靶蛋白有一定的結(jié)合活性，結(jié)合能 ＜ ?5.0 kcal/mol 則提示活性成分與靶蛋白結(jié)合活性良好，結(jié)合能 ＜ ?7.0 kcal/mol 則提示活性成分與靶蛋白具有較強(qiáng)的結(jié)合活性［12］。分子對(duì)接結(jié)果顯示，核心活性成分與靶蛋白的結(jié)合能均 ＜ ?5.0 kcal/mol，具有良好的結(jié)合活性，見表3。用Pymol軟件將分子對(duì)接進(jìn)行可視化處理，結(jié)果見圖8。

圖8 分子對(duì)接結(jié)果圖

表3 核心活性成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合能

3 臨床驗(yàn)證試驗(yàn)

3.1 一般資料

依據(jù)治療組比對(duì)照組1∶1 比例優(yōu)效性檢驗(yàn)計(jì)算公式及文獻(xiàn)參考單純激素治療乳腺炎的有效率為60%。經(jīng)PASS26.0 運(yùn)算操作得出：實(shí)現(xiàn)80%的檢驗(yàn)效能需要樣本量總量72，即治療組、對(duì)照組樣本量分別為36。因考慮脫落及失訪因素，擴(kuò)大10%樣本量，最終確定總樣本量為80例患者。隨機(jī)選取80例2020年12月—2021 年12 月就診于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院乳甲外科，病理診斷明確為GLM 患者并收集患者臨床基本情況。

3.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

①臨床表現(xiàn)及彩超下均符合GLM 癥狀、經(jīng)病理診斷確診為GLM 患者；②自愿參加本試驗(yàn)，并簽署知情同意書，能配合完成調(diào)查研究者。

3.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

①合并其他免疫相關(guān)、心血管、內(nèi)分泌系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病者；②合并其他乳房疾病者；③已參加其他正在進(jìn)行臨床研究試驗(yàn)的患者。

3.4 剔除標(biāo)準(zhǔn)

①治療期間嚴(yán)重不良反應(yīng)或自動(dòng)退出者；②資料散失者、脫落病例。

3.5 方法

3.5.1 治療方法

治療組口服透膿散湯劑進(jìn)行治療；對(duì)照組采用甲強(qiáng)龍（40 mg+0.9%NS 100 mL）靜滴3 d 后，改為口服甲潑尼龍片，起始劑量20 mg/d，持續(xù)口服2 周后減為16 mg/d。兩組患者的療程均為20 d。于治療前后分別采用空心針穿刺取得原腫塊組織。入組患者均知情同意，本研究已取得山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，倫理批件號(hào)：（2020）倫審第（054）號(hào)－KY，臨床試驗(yàn)網(wǎng)注冊(cè)號(hào)：ChiCTR2100050368。

3.5.2 檢測(cè)方法

將提取的組織包埋成病理蠟塊后切片，厚度約4 μm，采用免疫組化法染色，中性樹膠封片后，置顯微鏡下觀察。

3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，等級(jí)資料的對(duì)比采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)），治療前后平均灰度值的對(duì)比采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜ 0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 臨床試驗(yàn)結(jié)果

4.1 兩組患者治療前后IL－6的表達(dá)情況

治療前，治療組IL－6 陽(yáng)性表達(dá)率為75.76%，治療后陽(yáng)性表達(dá)率降為54.55%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）。治療前，對(duì)照組IL－6 陽(yáng)性表達(dá)率為77.78%，治療后陽(yáng)性表達(dá)率降為74.08%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。治療后治療組IL－6 的陽(yáng)性表達(dá)率與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見表4和圖9。

圖9 治療組治療前后IL－6陽(yáng)性表達(dá)情況（免疫組化SP法，× 400）

表4 兩組患者治療前后IL－6陽(yáng)性率的表達(dá)情況比較

4.2 兩組患者治療前后TNF的表達(dá)情況

治療前，治療組TNF 陽(yáng)性表達(dá)率為82.47%，治療后陽(yáng)性表達(dá)率降為55.46%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）。治療前，對(duì)照組TNF陽(yáng)性表達(dá)率為81.76%，治療后陽(yáng)性表達(dá)率降為72.54%，治療前后差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。治療后治療組TNF 的陽(yáng)性表達(dá)率與對(duì)照組比較，P＜ 0.05。見表5和圖10。

表5 治療前后兩組患者TNF陽(yáng)性率的表達(dá)情況比較

圖10 治療組治療前后TNF陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化SP法，× 400）

4.3 兩組患者治療前后IL－1β的表達(dá)情況

治療前，治療組IL－1β 陽(yáng)性表達(dá)率為79.06%，治療后，陽(yáng)性表達(dá)率降為52.85%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）。治療前，對(duì)照組IL－1β 陽(yáng)性表達(dá)率為80.76%，治療后陽(yáng)性表達(dá)率降為73.08%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。治療后治療組IL－1β的陽(yáng)性表達(dá)率與對(duì)照組比較，P＜ 0.05。見表6和圖11。

表6 兩組患者治療前后IL－1β陽(yáng)性率的表達(dá)情況比較

圖11 治療組治療前后IL－1β陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化SP法，× 400）

5 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，本病關(guān)鍵在于氣血失和、陰陽(yáng)失調(diào)，初期難以消散，中期散而不聚、難以透發(fā)，另有異物日久瘀積，煉液成痰，痰瘀互結(jié)形成腫塊，與西醫(yī)炎癥及自身免疫而致本病纏綿難愈的病因相契合。故本病治療應(yīng)益氣和營(yíng)、調(diào)和陰陽(yáng)、托毒外出。透膿散方中黃芪益氣托瘡排膿、和營(yíng)生血，當(dāng)歸、川芎養(yǎng)血和營(yíng)、調(diào)氣血之瘀滯，皂角刺、穿山甲活血消癰、軟堅(jiān)散結(jié)，全方益氣和營(yíng)、托里透膿，包含托、透治療思想，可使腫塊初期得以消散，中后期早日成膿，透膿外出，病灶由深變淺，趨于局限。

中藥復(fù)方具有成分多、通路多、靶點(diǎn)多的特點(diǎn)，其作用機(jī)制較難分析。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可系統(tǒng)分析疾病的發(fā)病機(jī)制，與中醫(yī)辨證論治、整體觀念的治療思路相契合［12］。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)平臺(tái)，將“藥物、疾病、靶點(diǎn)、通路”相結(jié)合，并加以臨床驗(yàn)證，為深入研究透膿散治療GLM的作用機(jī)制提供理論及臨床支持。

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析研究，構(gòu)建“藥物－化合物－靶點(diǎn)”圖，得到β－谷甾醇、槲皮素、山柰酚、谷甾醇、黃芪皂苷I、黃芪皂苷Ⅳ、黃芪多糖等關(guān)鍵活性化合物，且它們已被證實(shí)具有調(diào)節(jié)炎癥因子活性、抗氧化及參與機(jī)體自身免疫調(diào)節(jié)等作用［13－19］，提示透膿散中的活性化合物可能通過(guò)參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，促進(jìn)GLM病情痊愈或趨于好轉(zhuǎn)。

GO 功能富集分析表明，透膿散治療GLM 可能通過(guò)炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、MAPK 級(jí)聯(lián)等途徑。KEGG 信號(hào)通路富集分析表明，治療主要涉及NF－κB 信號(hào)通路、Jak－STAT 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路和T 細(xì)胞受體信號(hào)通路等，且信號(hào)通路間存在多重交互作用。NFκB 信號(hào)通路在免疫應(yīng)答炎癥信號(hào)通路中起重要作用，游離脂肪酸通過(guò)直接與TLR4 結(jié)合來(lái)激活髓樣分化因子88（MyD88）依賴性途徑，然后通過(guò)MyD88 和白介素1 受體相關(guān)激酶（IRAK）激活NF－κB，使p65 進(jìn)入細(xì)胞核并轉(zhuǎn)錄激活下游炎癥因子IL－6，觸發(fā)免疫炎癥反應(yīng)［20］。在GLM 發(fā)展階段，CD4+和CD8+細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，TNF－α 與CD4+細(xì)胞呈正相關(guān)，TNF－α 能誘導(dǎo)NFκB 信號(hào)通路的活化，活化調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子IL－6 的表達(dá)，增加炎癥細(xì)胞的活性及聚集性［21－22］。IFN－γ 和IL－6 通過(guò)Jak－STAT 途徑發(fā)出信號(hào)，以IFN－γ優(yōu)先激活STAT1和IL－6激活STAT3來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，IFN－γ 也可以與IL－1β 結(jié)合來(lái)驅(qū)動(dòng)IL－6 的產(chǎn)生，促進(jìn)機(jī)體免疫炎癥進(jìn)程［23－24］。

分子對(duì)接結(jié)果顯示，透膿散核心活性成分與IL－6、TNF、IL－1β、CCL2、INFG 和ICAM1 具有較好的結(jié)合能。臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，透膿散可降低GLM 炎性組織中IL－6、TNF 和IL－1β 的表達(dá)，調(diào)節(jié)局部免疫微環(huán)境。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果，本研究初步驗(yàn)證了透膿散治療GLM 可能通過(guò)調(diào)控NF－κB信號(hào)通路下游IL－6、TNF、IL－1β水平來(lái)調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)，然而透膿散治療肉芽腫性乳腺炎的作用機(jī)制仍需大量的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)闡明。