益腎通癃湯對(duì)前列腺癌裸鼠模型Nrf－2、SOD1的影響

林夢(mèng)姣，劉德果，趙姣，蘇藝峰，向時(shí)竹，陳其華

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是威脅男性身心健康的惡性腫瘤，隨著生活方式的轉(zhuǎn)變，我國(guó)PCa 患者發(fā)病率正逐步提高，并呈現(xiàn)老年多于青中年、城市多于農(nóng)村的發(fā)病特點(diǎn)［1］。PCa 出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)多數(shù)已達(dá)到晚期，預(yù)后較差。雄激素剝奪治療是目前公認(rèn)的晚期PCa 治法，但因其有效期短、副作用多、易耐藥性等不足，臨床難以取得較好的療效［2?3］。

益腎通癃湯是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院陳其華教授經(jīng)驗(yàn)方，近20 年的臨床應(yīng)用表明其能有效緩解PCa 患者臨床癥狀，團(tuán)隊(duì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明其能降低炎性指標(biāo)水平，減輕化療藥物毒副作用［4］，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步證實(shí)。

現(xiàn)代研究表明，氧化應(yīng)激與PCa 的發(fā)生和發(fā)展息息相關(guān)，參與PCa進(jìn)程［5］?；赑Ca細(xì)胞大量增殖及侵襲的特點(diǎn)，其生命活動(dòng)需要一定量的活性氧（ROS）維持，當(dāng)大量的ROS 蓄積在胞漿中，誘導(dǎo)產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)［6］，便可通過(guò)細(xì)胞凋亡［7?8］、上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化［9］、雄激素受體信號(hào)再激活等途徑造成癌細(xì)胞凋亡［10?11］。而核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2（Nrf－2）和超氧化物歧化酶1（SOD1）作為兩種主要的保護(hù)因子參與其中。PCa 細(xì)胞可通過(guò)兩種因子的釋放降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減少凋亡的發(fā)生。

本研究旨在探討益腎通癃湯產(chǎn)生臨床療效的機(jī)制，觀察其是否與通過(guò)下調(diào)Nrf－2、SOD1 的表達(dá)以誘導(dǎo)PCa細(xì)胞產(chǎn)生高度氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株

PC－3 細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，在湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期凍存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性BALB/c 裸鼠40 只，體質(zhì)量20～22 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019－0004，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（湘）2019－0009。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)中心SPF 動(dòng)物房，飼以SPF 級(jí)顆粒飼料并自由飲水，動(dòng)物房自然采光，相對(duì)濕度為50%～75%，溫度為22～24 ℃。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)倫理審查，倫理批號(hào)：

LBH－20201011000。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)藥物

益腎通癃湯組方：補(bǔ)骨脂15 g，熟地黃15 g，黃芪30 g，三棱10 g 和莪術(shù)10 g；均購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，加適量蒸餾水兩次煎煮共50 min，將藥液濃縮至每1 mL 藥液含生藥量1.44 g。其中益腎通癃湯中劑量組為益腎通癃湯原方劑量折算后劑量（相當(dāng)于成人等效劑量，即每1 mL 藥液含生藥量1.44 g），益腎通癃湯高劑量組相當(dāng)于成人等效劑量的2 倍，益腎通癃湯低劑量組相當(dāng)于成人等效劑量0.5倍。

1.1.4 主要試劑與設(shè)備

F12/DMEM 1∶1 培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS（Hyclone 公司）；胰蛋白酶（南京吉諾環(huán)境科技有限公司）；ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；Trizol（美國(guó)Thermo）；mRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；EDTA（中國(guó)大連美倫生物技術(shù)有限公司）；Nrf－2、SOD1 抗體及相應(yīng)二抗（美國(guó)proteintech）；DYY－6C 恒溫箱（北京六一生物科技有限公司）；BA210T顯微鏡（Motic）；PIKOREAL96熒光定量RCP儀（美國(guó)Thermo）；DYY－2C電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及PCa裸鼠模型建立

制備前列腺癌PC－3 細(xì)胞懸液，使其密度為1 × 106/mL，BALB/c 裸鼠腹股溝消毒，并在消毒部位接種0.1 mL 上述細(xì)胞混合液，1 周后部分裸鼠可觸及粟粒樣大小的瘤體，接種2 周后，裸鼠皮下可見(jiàn)長(zhǎng)徑約3 mm 的瘤體，即為動(dòng)物腫瘤模型建立成功，40 只裸鼠均造模成功。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥

造模成功后，將40 只裸鼠隨機(jī)分成4 組，分別為模型組，益腎通癃湯低、中、高劑量組（以下簡(jiǎn)稱低、中、高劑量組），每組10 只。模型組灌胃生理鹽水［1 mL/（100 g·d）］，益腎通癃湯各劑量組分別灌胃0.72、1.44、2.88 g/mL生藥量的益腎通癃湯［1 mL/（100 g·d）］，給藥時(shí)間21 d。末次給藥后12 h，摘取眼球取血，脫頸處死裸鼠，完整剝離瘤體，稱取瘤重，并計(jì)算抑瘤率。

抑瘤率（%）=（1－實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/模型組平均瘤重）× 100%

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 HE染色觀察腫瘤組織病理改變

經(jīng)過(guò)烤片、切片脫蠟、蘇木素染1～5 min、伊紅染色1 s、脫水、樹(shù)膠封片等步驟得到成片，鏡下觀察并拍照。

1.3.2 ELISA檢測(cè)Nrf－2、SOD1含量

取4 組裸鼠血液離心制備血清，嚴(yán)格按ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)Nrf－2、SOD1含量。

1.3.3 Western blot法檢測(cè)Nrf－2、SOD1蛋白表達(dá)

提取組織蛋白，離心后取上清煮沸后速冷。經(jīng)過(guò)電泳、上樣、轉(zhuǎn)膜后添加Nrf－2、SOD1抗體，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育90 min顯影沖洗。將曝光后的底片掃描，并用Quantity one專業(yè)灰度分析軟件進(jìn)行分析。

1.3.4 RT－PCR檢測(cè)Nrf－2、SOD1 mRNA表達(dá)

各取4 組小鼠各25 mg 瘤體組織，使用Trizol 裂解樣品，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，采用SYBR 法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)觀察，引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用方差分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組裸鼠抑瘤率比較

結(jié)果顯示，各組抑瘤率具有顯著差異，且抑瘤率隨藥物濃度的上升而增高，呈劑量依賴性。見(jiàn)表2。

表2 各組抑瘤率比較

2.2 HE染色觀察瘤體病理改變

模型組中可見(jiàn)大量PCa 細(xì)胞核分裂象，而益腎通癃湯高劑量組中可見(jiàn)細(xì)胞核裂解，裂解程度高劑量組明顯大于低、中劑量組，但低、中劑量組較模型組細(xì)胞核裂解象未見(jiàn)明顯差異。見(jiàn)圖1。

圖1 各組瘤體組織病理變化（HE，× 100）

2.3 移植瘤中Nrf－2、SOD1含量比較

ELISA 結(jié)果顯示，與模型組比較，益腎通癃湯低、中、高劑量組可降低PCa裸鼠瘤體組織中Nrf－2、SOD1的含量（P＜ 0.01），并呈劑量依賴性，即藥物濃度越高，Nrf－2、SOD1含量越低。見(jiàn)表3。

表3 各組瘤體中Nrf－2、SOD1含量比較（±s）

表3 各組瘤體中Nrf－2、SOD1含量比較（±s）

注：與模型組比較，aP ＜ 0.01；與低劑量組比較，bP ＜ 0.01；與中劑量組比較，cP ＜ 0.01。

2.4 移植瘤中Nrf－2、SOD1蛋白表達(dá)

Western blot 結(jié)果顯示，與模型組比較，益腎通癃湯干預(yù)能降低移植瘤中Nrf－2、SOD1 蛋白的表達(dá)（P＜ 0.01），并隨著濃度升高，降低幅度增大，見(jiàn)表4和圖2。

圖2 各組Western blot印跡結(jié)果

表4 各組瘤體中Nrf－2、SOD1蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 各組瘤體中Nrf－2、SOD1蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與模型組比較，aP ＜ 0.01；與低劑量組比較，bP ＜ 0.01；與中劑量組比較，cP ＜ 0.01。

2.5 移植瘤中Nrf－2、SOD1 mRNA的表達(dá)

RT－PCR 結(jié)果顯示，與模型組比較，益腎通癃湯低、中、高劑量組PCa 裸鼠瘤體組織中Nrf－2、SOD1 mRNA 表達(dá)顯著下調(diào)（P＜ 0.01），且藥物濃度越高，下調(diào)幅度越大。見(jiàn)表5。

表5 各組瘤體中Nrf－2、SOD1 mRNA的表達(dá)比較（±s）

表5 各組瘤體中Nrf－2、SOD1 mRNA的表達(dá)比較（±s）

注：與模型組比較，aP ＜ 0.01；與低劑量組比較，bP ＜ 0.01；與中劑量組比較，cP ＜ 0.05，dP ＜ 0.01。

3 討論

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，益腎通癃湯能夠有效抑制前列腺組織微血管生成及血清中雌/雄激素的比例失衡，調(diào)節(jié)COX－2及PGE－2表達(dá)，降低炎性反應(yīng)程度［12］，影響HIF－1α 的表達(dá)有效抑制新生血管形成［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，其能夠明顯抑制PCa瘤體的生長(zhǎng)，且抑瘤率隨藥物濃度的上升而增強(qiáng)；鏡下觀察HE染色顯示，益腎通癃湯干預(yù)能夠促進(jìn)PCa細(xì)胞核裂解，引起細(xì)胞凋亡。

在荷瘤狀態(tài)下，Nrf－2 作為腫瘤細(xì)胞的保護(hù)因子被釋放，通過(guò)Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Keap1）－核因子紅細(xì)胞2 相關(guān)因子2（Nrf－2）/抗氧化反應(yīng)元件（ARE）通路減輕氧化應(yīng)激對(duì)腫瘤細(xì)胞的有害反應(yīng)，并可對(duì)化療藥物起到增毒減效的效果［14］。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的氧自由基不能被腫瘤細(xì)胞清除，SOD1可將氧自由基歧化為H2O2，再進(jìn)一步被機(jī)體清除［15］，達(dá)到抗氧化的目的，延緩癌細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致疾病進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)中PCR、ELISA、Western blot 結(jié)果均顯示，益腎通癃湯干預(yù)可明顯下調(diào)Nrf－2 及SOD1 表達(dá)，說(shuō)明益腎通癃湯可能是通過(guò)抑制Nrf－2、SOD1 的表達(dá)，誘導(dǎo)癌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，減小腫瘤體積，從而達(dá)到對(duì)PCa的治療作用。

益腎通癃湯組方中補(bǔ)骨脂、熟地黃、黃芪、三棱和莪術(shù)，其單體藥物已被現(xiàn)代諸多研究證實(shí)有效成分具有抗腫瘤的活性［16?20］，且有效活性成分不止一種，但均以中藥單體為主進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。中藥配伍是中醫(yī)辨證論治的一大特色，通過(guò)配伍使藥物減毒增效是根本目的，在單體實(shí)驗(yàn)中有效的活性成分經(jīng)過(guò)配伍之后是否具有相同的抗癌活性甚至更高是現(xiàn)代中藥復(fù)方研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。本研究目前的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)僅能證實(shí)益腎通窿湯可通過(guò)下調(diào)Nrf－2、SOD1表達(dá)達(dá)到治療PCa的目的，但此中藥復(fù)方中主要抗癌活性成分、活性與劑量相關(guān)關(guān)系、五味中藥的配伍是否使抗癌效果最大化等問(wèn)題尚不明確，仍需要團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，為臨床指導(dǎo)用藥提供理論依據(jù)。

綜上所述，益腎通癃湯可有效治療PCa，其機(jī)制可能與下調(diào)Nrf－2、SOD1 的表達(dá)有關(guān)，但其有效成分需進(jìn)一步研究證實(shí)。