重復(fù)異丙酚麻醉通過mTOR通路誘導(dǎo)大鼠海馬細(xì)胞凋亡及自噬

蘇曉英 周飛仁 都躍

(綿陽市第三人民醫(yī)院 四川省精神衛(wèi)生中心麻醉科，四川 綿陽 621000)

全身麻醉性藥物(如七氟烷、異氟烷、咪達(dá)唑侖等)使用較長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，會(huì)影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，使發(fā)育期大腦出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞變性，影響后期的學(xué)習(xí)記憶能力〔1,2〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，全身麻醉性藥物可破壞神經(jīng)元，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙〔3〕。異丙酚是臨床應(yīng)用廣泛的全身麻醉藥，近年來的研究表明，高濃度的異丙酚可破壞神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡〔4〕；而有的研究卻發(fā)現(xiàn)異丙酚可通過誘導(dǎo)自噬保護(hù)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡〔5,6〕。異丙酚如何破壞發(fā)育期大腦的神經(jīng)元，通過何種途徑誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡和自噬，目前尚無定論。本研究通過重復(fù)異丙酚麻醉新生大鼠，探究其對(duì)新生大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡和自噬的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康SD大鼠72只，體重8～15 g，由北京維通利華動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK(京)2016-0011，所有動(dòng)物均嚴(yán)格按照動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)則喂養(yǎng)，溫度為24℃，濕度為50%，自由飲水和攝食。

1.2主要試劑 腹腔注射異丙酚(意大利Astra Zeneca公司，P017269)；雷帕霉素(北京索萊寶公司，IR0010)；注射脂肪乳劑(力能，江蘇華瑞制藥有限公司，H20030609)；兔抗雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抗體(ab32028)、兔抗磷酸化(p)-mTOR抗體(ab137133)、兔抗B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2抗體(ab194583)、兔抗Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體(ab182734)、兔抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3抗體(ab13847)、兔抗Beclin-1抗體(ab210498)、兔抗微管相關(guān)蛋白輕鏈(LC)3B抗體(ab63817)、兔抗p62抗體(ab91526)、兔抗β-Actin抗體(ab8227)、山羊抗兔IgG辣根過氧化物酶(HRP，ab205718)均購(gòu)自英國(guó)abcam公司；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑、RIPA裂解液和BCA試劑盒(碧云天生物科技公司，批號(hào)分別為C0105、P0013B、P0012S)；丹麥雷度血?dú)夥治鰞x(ABL90 FLEX，丹麥Radiometer)、多功能酶標(biāo)儀(iMark680，美國(guó)Bio-Rad公司)、熒光顯微鏡(BX51，日本Olympus公司)。

1.3分組與處理 將72只大鼠隨機(jī)分為4組，每組18只。溶劑對(duì)照組(A組)：腹腔注射脂肪乳劑7.5 ml/kg，1次/d，連續(xù)7 d；單次注射異丙酚組(B組)：腹腔注射脂肪乳劑7.5 ml/kg，1次/d，連續(xù)6 d，第7天注射異丙酚75 mg/kg。重復(fù)注射異丙酚組〔7〕(C組)：腹腔注射異丙酚75 mg/kg，1次/d，連續(xù)7 d；異丙酚+雷帕霉素組〔8〕(D組)：腹腔注射雷帕霉素2.0 mg/kg和異丙酚75 mg/kg，1次/d，連續(xù)7 d。雷帕霉素注射液的配制：將雷帕霉素以20 mg/ml的濃度溶解在乙醇中，-20℃下保存?zhèn)溆?。在注射之前，將雷帕霉素乙醇溶液用含?%Tween-80的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋成2.0 mg/ml〔9〕。每次給藥后將大鼠放入保溫箱中，麻醉過程中觀察大鼠呼吸頻率和皮膚顏色變化。

1.4動(dòng)脈血?dú)夥治?第7天給藥結(jié)束后，每組隨機(jī)選取12只大鼠0.3%戊巴比妥鈉1 ml/100 g腹腔注射麻醉，開胸暴露心臟，取動(dòng)脈血1 ml，采用血?dú)夥治鰞x監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血pH值、血?dú)庋躏柡投认嚓P(guān)參數(shù)、乳酸、血糖水平。

1.5HE染色觀察海馬神經(jīng)細(xì)胞病理學(xué)變化 每組取12只大鼠取血完成后在冰上迅速剝離腦組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片。二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫苯1 min，蒸餾水沖洗，蘇木素染色5 min，蒸餾水沖洗，放入1%鹽酸酒精30 s，伊紅染色5 min，自來水流水洗3次，至無色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。光學(xué)顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元病理學(xué)變化。

1.6原位末端標(biāo)記技術(shù)(Tunel)法檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡 將1.5制備的腦組織石蠟切塊，冠狀切4 μm切片。細(xì)胞凋亡檢測(cè)按TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書操作，細(xì)胞核固縮、染色體凝集呈棕褐色者為凋亡細(xì)胞。在400倍光鏡下觀察海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、齒狀回(DG)的凋亡神經(jīng)細(xì)胞，每組隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)正常神經(jīng)細(xì)胞和凋亡神經(jīng)細(xì)胞，取平均值，計(jì)算細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/(凋亡細(xì)胞數(shù)+正常細(xì)胞數(shù))×100%。

1.7Western印跡法檢測(cè)海馬組織mTOR、p-mTOR、自噬和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 每組剩余6只大鼠，斷頭取腦，分離海馬組織。按照試劑盒說明書的操作提取海馬組織中的總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗(mTOR、p-mTOR、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62，按1∶1 000的比例稀釋；β-actin按1∶2 000的比例稀釋)，4℃下孵育過夜，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，以β-actin為內(nèi)參，通過與內(nèi)參的灰度比，得出目的條帶的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1異丙酚對(duì)動(dòng)脈血pH、血氧飽和度、血糖水平的影響 所有大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中無死亡，各組動(dòng)脈血pH值、氧分壓(PO2)、二氧化碳分壓(PCO2)、乳酸、血糖水平均在正常范圍內(nèi)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組血?dú)夥治鼋Y(jié)果比較

2.2異丙酚對(duì)海馬神經(jīng)元病理損傷的影響 A組、B組海馬組織形態(tài)及結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列規(guī)整，著色均勻，胞核及核仁大小正常，未出現(xiàn)明顯的病理損傷；與A組、B組相比，C組可見海馬各區(qū)神經(jīng)元腫脹呈空泡樣，胞質(zhì)胞核著色不均勻，細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，形態(tài)改變；與C組相比，D組細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，神經(jīng)元細(xì)胞核著色較均勻。見圖1。

圖1 異丙酚對(duì)各組海馬神經(jīng)元病理損傷的影響(HE染色，×100，方框內(nèi)×400)

2.3異丙酚對(duì)海馬神經(jīng)元凋亡的影響 A組有少量的神經(jīng)凋亡細(xì)胞，與A組相比，B組海馬各區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況無顯著性差異(P>0.05)，C組、D組海馬各區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯升高(P<0.05)；與C組相比，D組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯降低(P<0.05)。見圖2、表2。

表2 異丙酚對(duì)海馬神經(jīng)元凋亡的影響個(gè)/HP，n=12)

圖2 異丙酚對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響(Tunel染色)

2.4異丙酚對(duì)海馬神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 A組和B組海馬組織Bcl-2/Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與A組、B組相比，C組海馬組織Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)顯著降低，Caspase-3表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與C組相比，D組海馬組織Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)明顯升高，Caspase-3表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 各組海馬組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

2.5異丙酚對(duì)海馬組織mTOR、p-mTOR和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 A組和B組海馬組織p-mTOR/mTOR、Caspase-3、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與A組、B組相比，C組海馬組織p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)顯著升高，自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)顯著降低，p62表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與C組相比，D組大鼠海馬組織p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)顯著降低、自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3-II/LC3-Ⅰ表達(dá)顯著升高、p62表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見表3、圖4。

表3 異丙酚對(duì)海馬組織mTOR和凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖4 各組海馬組織mTOR、p-mTOR和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

異丙酚是臨床常用的全身麻醉藥，現(xiàn)已有多項(xiàng)研究表明異丙酚可對(duì)腦組織細(xì)胞自噬和凋亡產(chǎn)生影響〔10～13〕；對(duì)處于發(fā)育期動(dòng)物的大腦具有遠(yuǎn)期毒性，可導(dǎo)致動(dòng)物成年后的學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知能力下降，顯著誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡〔14〕。王玉潔等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)重復(fù)異丙酚麻醉可增加海馬內(nèi)細(xì)胞凋亡，降低新生大鼠的遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶能力；Li等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)異丙酚可通過誘導(dǎo)H9c2心臟細(xì)胞自噬來促進(jìn)細(xì)胞存活；而孫穎等〔16〕、Lu等〔17〕研究卻發(fā)現(xiàn)異丙酚能夠減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪損傷引起的過度自噬，從而減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪傷害。

嚙齒類動(dòng)物的大腦在出生后快速發(fā)育，在7 d左右達(dá)到高峰；海馬是大腦最容易受到傷害的區(qū)域，神經(jīng)損傷的主要原因之一就是海馬神經(jīng)元的凋亡〔18〕；因此，本研究選擇出生后7 d的大鼠海馬組織為主要研究對(duì)象。麻醉中發(fā)生的低氧血癥和酸中毒也是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的原因之一〔19〕，故本研究采用動(dòng)脈血?dú)夥治鰞x對(duì)麻醉中大鼠的pH值、血氧飽和度、血糖等指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，排除酸堿失衡和低氧血癥等內(nèi)環(huán)境紊亂對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。本研究結(jié)果表明，異丙酚麻醉后大鼠未出現(xiàn)低氧血癥、酸中毒等內(nèi)環(huán)境紊亂的現(xiàn)象，因此，異丙酚麻醉大鼠出現(xiàn)的一系列改變是麻醉藥對(duì)大腦的直接損害作用。本研究HE染色結(jié)果說明，異丙酚重復(fù)麻醉可誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷。采用Tunel檢查異丙酚對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異丙酚重復(fù)麻醉可誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡和自噬是程序性細(xì)胞死亡的兩種方式。Bcl-2、Bax是目前已知的細(xì)胞凋亡中最重要的兩個(gè)調(diào)控基因，Caspase-3是所有細(xì)胞凋亡途徑的最后效應(yīng)子，其激活是細(xì)胞凋亡的特征性標(biāo)志之一。自噬具有雙重功能，一方面它可降解異常蛋白質(zhì)，防止其在神經(jīng)元內(nèi)蓄積，拮抗細(xì)胞的凋亡效應(yīng)；另一方面自噬過度活躍會(huì)損傷細(xì)胞器，如造成線粒體功能障礙，參與神經(jīng)退行性疾病的致病過程〔20〕。Beclin-1是自噬開始所必需的蛋白，當(dāng)自噬受到抑制時(shí)Beclin-1表達(dá)降低，而p62表達(dá)則會(huì)升高〔21,22〕；同時(shí)LC3-Ⅰ與自噬體膜結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3-Ⅱ的過程受阻，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低〔23,24〕。mTOR是細(xì)胞生長(zhǎng)，自噬，翻譯和存活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，mTOR激活后，可通過調(diào)節(jié)不同的下游通路蛋白(如LC3-Ⅱ、p62、Beclin-1)調(diào)節(jié)細(xì)胞的自噬和凋亡。Chiara等〔25〕研究發(fā)現(xiàn)mTOR的過度活化會(huì)降低Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ比值，使自噬受損，自噬減少會(huì)抑制錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)的清除，形成神經(jīng)毒性聚集體，促進(jìn)神經(jīng)元死亡；而Abhishek等〔26〕研究表明在阿爾茨海默病(AD)大鼠模型中給予mTOR信號(hào)通路抑制劑(雷帕霉素)可降低p-mTOR、p62蛋白表達(dá)，升高Beclin-1、LC3-Ⅱ表達(dá)，誘導(dǎo)自噬激活，逆轉(zhuǎn)β淀粉樣蛋白1～42誘導(dǎo)的氧化還原穩(wěn)態(tài)受損，保護(hù)海馬神經(jīng)元，提高大鼠的認(rèn)知能力。本研究結(jié)果提示，異丙酚重復(fù)麻醉可誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡增強(qiáng)，海馬神經(jīng)元自噬受到抑制；而mTOR抑制劑組可見大鼠海馬組織自噬被激活，神經(jīng)細(xì)胞凋亡減少；重復(fù)異丙酚麻醉可能通過激活mTOR通路抑制新生大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，重復(fù)異丙酚麻醉可能通過激活mTOR通路抑制新生大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。但本研究尚存在一定不足，未研究其對(duì)學(xué)習(xí)記憶的長(zhǎng)遠(yuǎn)影響；關(guān)于重復(fù)異丙酚麻醉通過mTOR抑制自噬，誘導(dǎo)凋亡的mTOR上游的影響因素未進(jìn)行探討，今后會(huì)繼續(xù)進(jìn)行深入研究。