甘草酸對癲癇老年大鼠神經(jīng)元的保護作用及對HMGB-1表達的影響

黃毅文 王圓圓 劉曉玢 歐陽櫻君

(廣州市第一人民醫(yī)院 華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院 1急診科，廣東 廣州 510000；2神經(jīng)內(nèi)科)

癲癇是常見的一類神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是由于腦神經(jīng)元異常和過度超同步化放電造成的大腦功能暫時性障礙，可造成大腦缺氧，長期反復(fù)癲癇發(fā)作給患者感覺、認知動能和記憶功能造成嚴重影響，這在老年癲癇患者中尤為明顯〔1〕。我國是癲癇發(fā)生率較高的國家之一，據(jù)統(tǒng)計我國現(xiàn)有癲癇患者約900萬，人群總發(fā)病率高達7‰〔2〕。目前的研究結(jié)果均支持癲癇持續(xù)發(fā)作與神經(jīng)元異常放電、血腦屏障破壞、炎癥反應(yīng)等因素造成神經(jīng)元損傷和凋亡有關(guān)〔3,4〕。甘草酸是從甘草中提取的一種三萜皂苷類物質(zhì)，研究表明甘草酸具有良好的抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)元保護作用〔5,6〕。本研究探討了甘草酸對癲癇老年大鼠神經(jīng)元的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級健康SD大鼠36只，24月齡，均為雄性，體重335～387 g，平均(365.36±10.28)g，大鼠均自由飲食、飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度21～25℃，晝夜各12 h。大鼠均從上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司購買〔SCXK(滬)2012-0002〕。

1.2儀器、試劑 甘草酸、苯甲基磺酰氟、BCA法蛋白定量試劑盒、5×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液、細胞裂解液、細胞膜電位檢測試劑盒、原位末端轉(zhuǎn)移酶標記法(TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3和caspase-9活性檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所。大鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體、抗大鼠高遷移率族蛋白(HMGB)-1單克隆抗體均購自美國CST公司。BX53型熒光顯微鏡購自美國Olympus公司，電泳儀、蛋白雜交儀和凝膠成像系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司。

1.3研究方法

1.3.1模型建立 在大鼠清醒狀態(tài)下給予腹腔注射127 mg/kg氯化鋰溶液，18～22 h后給予腹腔注射10 mg/kg溴化甲基阿托品，30 min后給予腹腔注射30 mg/kg匹羅卡品。觀察大鼠行為表現(xiàn)并進行Racine分級，反復(fù)Racine分級評價為Ⅳ級以上視為癲癇持續(xù)發(fā)作。若持續(xù)1 h以上則視為造模成功。若大鼠在注射匹羅卡品后30 min未出現(xiàn)癲癇發(fā)作，則每間隔10 min追加腹腔注射10 mg/kg匹羅卡品直至造模成功。一旦成功造模，立即腹腔注射10 mg/kg地西泮終止癲癇發(fā)作，若注射后15 min仍未能終止則追加腹腔注射10 mg/kg地西泮。

1.3.2分組給藥 36只大鼠采用隨機數(shù)字表法分為正常對照組、模型組和甘草酸組，各12只。模型組和甘草酸組大鼠采用氯化鋰-匹羅卡品腹腔注射制作大鼠癲癇模型〔7〕，正常對照組大鼠不進行處理。造模成功后給予甘草酸組大鼠30 mg/kg甘草酸灌胃，給予模型組和正常對照組大鼠等容量生理鹽水灌胃。3組大鼠均予連續(xù)灌藥7 d。大鼠經(jīng)麻醉后斷頭處死，立即取出腦組織，在4℃無菌環(huán)境下鈍性分離法術(shù)雙側(cè)海馬組織，保存于液氮中待測。

1.3.3細胞凋亡檢測 將海馬組織切片依次置入二甲苯，100%、95%、90%、80%、70%酒精中5 min，經(jīng)蛋白酶K消化處理60 min后采用pH7.0 磷酸鹽緩沖液漂洗3次，采用TUNEL法檢測神經(jīng)元細胞凋亡情況，經(jīng)TUNEL染色后棕黃色或棕褐色為凋亡細胞，于200倍下計數(shù)凋亡細胞數(shù)量，計算視野內(nèi)凋亡細胞所占比例。

1.3.4神經(jīng)元線粒體膜電位 采用JC-1熒光染色-流式細胞儀檢測線粒體跨膜電位(Δψm)，具體操作如下：取500 μl海馬單細胞懸液加入JC-1熒光染料并使其終濃度為0.5 μmol/L，4℃避光放置10 min后采用流式細胞儀檢測Δψm。記錄熒光讀數(shù)值，每個樣本計數(shù)104個細胞，采用CellQuest軟件處理。

1.3.5caspase-3和caspase-9活性檢測 取海馬組織勻漿處理后加入細胞裂解液2 h，4 500 r/min離心30 min后收集上清液，采用caspase-3和caspase-9活性比色法檢測試劑盒測定海馬組織中caspase-3和caspase-9活性。

1.3.6Western印跡檢測 采用Western印跡方法檢測海馬組織中HMGB-1表達情況。取1.3.5中的上清液測定總蛋白含量。將50 μg蛋白加入緩沖液并采用煮沸法變性。通過10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h后加入1∶500抗大鼠HMGB-1單克隆抗體于4℃條件下過夜，TBST洗膜30 min，1∶1 000二抗孵育2 h后采用免疫印跡法檢測，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。以GADPH作為參比計算相對光密度。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.13組海馬組織神經(jīng)元細胞凋亡比例比較 與正常對照組比較，甘草酸組和模型組海馬組織神經(jīng)元細胞凋亡比例明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，甘草酸組海馬組織神經(jīng)元細胞凋亡比例明顯降低(P<0.01)。見表1。

2.23組海馬組織神經(jīng)元Δψm比較 與正常對照組比較，甘草酸組和模型組大鼠海馬組織神經(jīng)元Δψm明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，甘草酸組大鼠海馬組織神經(jīng)元Δψm明顯增加(P<0.01)。見表1。

2.33組海馬組織caspase-3和caspase-9活性比較 與正常對照組比較，甘草酸組和模型組大鼠海馬組織caspase-3和caspase-9活性明顯提高(P<0.01)；與模型組比較，甘草酸組大鼠海馬組織caspase-3和caspase-9活性明顯降低(P<0.01)。見表1。

2.43組海馬組織中HMGB-1表達情況 甘草酸組和模型組海馬組織HMGB-1表達水平明顯高于正常對照組(P<0.01)，甘草酸組海馬組織HMGB-1表達水平明顯低于模型組(P<0.01)。見表1、圖1。

表1 3組海馬組織神經(jīng)元細胞凋亡、神經(jīng)元Δψm、比較

圖1 3組海馬組織中HMGB-1表達Western印跡

3 討 論

我國每年新增癲癇發(fā)病為(22.39～22.8)/10萬，該病已經(jīng)成為僅次于腦血管疾病的第二大神經(jīng)系統(tǒng)疾病〔8〕。目前尚未完全清楚癲癇發(fā)病機制，但腦電圖檢查可見多數(shù)發(fā)作患者存在腦部神經(jīng)異常放電現(xiàn)象〔9〕。氯化鋰-匹羅卡品腹腔注射建立的癲癇動物模型與人癲癇表現(xiàn)、機制高度相似，均可見明顯的神經(jīng)元細胞損傷、凋亡及膠質(zhì)細胞激活和增生的病理改變，因此常被用于癲癇發(fā)病機制、藥物研發(fā)等研究。本研究即采用氯化鋰-匹羅卡品腹腔注射建立癲癇老年大鼠模型，經(jīng)反復(fù)Racine分級觀察確定建模成功。

本研究可見癲癇大鼠存在明顯的神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象，這也是造成癲癇患者神經(jīng)功能、認知功能等降低的直接原因。本研究結(jié)果提示，通過甘草酸治療能夠抑制神經(jīng)元凋亡。既往研究發(fā)現(xiàn)，癲癇能夠造成神經(jīng)元線粒體功能障礙，表現(xiàn)為Δφm降低、膜通透性增加，線粒體出現(xiàn)死亡而無法維持細胞正常的能量代謝，進而造成細胞凋亡〔10,11〕。本研究結(jié)果提示，甘草酸可能通過阻斷線粒體電位異常抑制神經(jīng)元凋亡。

研究證實，caspase在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，激活caspase能夠造成細胞質(zhì)、細胞核和細胞骨架中的蛋白質(zhì)及DNA降解，進而引起細胞凋亡，而有學(xué)者認為細胞凋亡實際上是caspase不可逆有限水解底物的級聯(lián)放大反應(yīng)過程，caspase-3和caspase-9是其中最受關(guān)注的2個蛋白〔12,13〕。其中，caspase-3是caspase級聯(lián)瀑布下游最為重要的1個凋亡蛋白酶，對不同因素啟動的凋亡程序中發(fā)揮樞紐作用，目前已知有3條細胞凋亡通路在caspase-3處交匯，通過激活下游第五引起肌動蛋白、角蛋白等降解，進而破壞細胞骨架，引起內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡。caspase-9則位于凋亡級聯(lián)放大反應(yīng)過程上游，是最重要的凋亡起始因子。盧峰等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)顳葉內(nèi)側(cè)癲癇患者海馬區(qū)CA1區(qū)caspase-3、caspase-9蛋白呈高表達，明顯高于正常人群，且與患者癲癇發(fā)作頻率呈正相關(guān)。本研究結(jié)果說明，甘草酸能夠降低caspase-3和caspase-9蛋白水平，進而發(fā)揮抑制神經(jīng)元細胞凋亡。

癲癇發(fā)作后人或動物血腦屏障完整性被破壞，激發(fā)出現(xiàn)腦水腫、膠質(zhì)細胞增生、神經(jīng)元凋亡等腦損傷事件，這又進一步造成癲癇病情加重〔15〕。炎性因子在癲癇發(fā)作及腦損傷中具有重要作用，且已經(jīng)在癲癇發(fā)作后血腦屏障破壞患者中檢測到白細胞介素(IL)-1b、干擾素(IFN)-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎性因子水平升高。Vezzani等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)腦部炎性因子能夠影響神經(jīng)元突觸信號，減少異質(zhì)性沖動傳輸，降低血腦屏障通透性，造成癲癇易感和發(fā)作。HMGB-1是一種促炎癥因子，通過抑制其活性能夠緩解因其釋放造成的級聯(lián)炎癥反應(yīng)，并減輕血腦屏障破壞程度和腦損傷程度，這在腦出血、腦外傷所致血腦屏障破壞和腦損傷中易被證實〔17,18〕。Kim等〔19〕研究結(jié)果表明，甘草酸能夠特異性選擇抑制HMGB-1，本研究結(jié)果也證實了甘草酸能夠抑制HMGB-1表達。

綜上，甘草酸可通過阻斷線粒體異常電位保護線粒體功能，降低caspase-3和caspase-9活性抑制凋亡級聯(lián)放大反應(yīng)，抑制HMGB-1蛋白表達減輕炎性反應(yīng)和改善血腦屏障來發(fā)揮保護癲癇老年大鼠海馬組織神經(jīng)元的作用。