下調(diào)miR-146a對(duì)牙髓炎模型大鼠的干預(yù)效果及作用機(jī)制

劉琳 張敏 息雪娜

(1哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院(衡水市人民醫(yī)院)口腔科，河北 衡水 053000；2張家口學(xué)院)

牙髓炎的原因有很多，包括細(xì)菌感染、物理化學(xué)刺激和免疫反應(yīng)，其中細(xì)菌感染是導(dǎo)致牙髓疾病的主要因素〔1〕。由于口腔不是無(wú)菌環(huán)境，所以當(dāng)齲齒或外傷等疾病導(dǎo)致牙齒缺損沒(méi)有及時(shí)治療時(shí)，以細(xì)菌為基礎(chǔ)的致病因素會(huì)通過(guò)牙齒缺損感染牙髓，從而導(dǎo)致牙髓炎〔2〕。牙髓炎的主要表現(xiàn)為牙痛，根據(jù)根管學(xué)的臨床表現(xiàn)和治療預(yù)后，可分為可逆性牙髓炎和不可還原性牙髓炎〔3〕。去除刺激因素并給予一定的治療后，牙髓可以恢復(fù)到原來(lái)的狀態(tài)，如果外界刺激持續(xù)，牙髓炎癥將繼續(xù)發(fā)展，最終發(fā)展為以自發(fā)性疼痛為標(biāo)志癥狀的不可逆牙髓炎〔4〕。根據(jù)病程和疾病特點(diǎn)，不可復(fù)性牙髓炎又可分為急性牙髓炎、慢性牙髓炎、牙髓炎和逆行性牙髓炎〔5〕。本文皆在探討下調(diào)miR-146a對(duì)牙髓炎模型大鼠的干預(yù)效果及作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 研究動(dòng)物：采購(gòu)于河南中醫(yī)藥大學(xué)(SYXK(豫)2020-0003)的SPF級(jí)SD大鼠共40只，6～9月齡，平均(7.50±1.20)月齡，體重250～315 g，平均(282.5±26)g，保持光照12 h/d，相對(duì)濕度24%～36%、溫度(27.50±4.25)℃的環(huán)境內(nèi)喂養(yǎng)大鼠1 w，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。主要試劑：miR-146a(上?？泼羯锟萍加邢薰?；白細(xì)胞介素(IL)-8酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司，貨號(hào)：YS04529B)；腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司，貨號(hào)：SBJ-R0040)；IL-6 ELISA試劑盒(廈門侖昌碩生物科技有限公司，貨號(hào)：LCS31109)；IL-1β ELISA試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司，貨號(hào)：SBJ-R0548)；Toll樣受體(TLR)4一抗(上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司，貨號(hào)：MAB6248)；核因子(NF)-κB一抗(北京百奧萊博科技有限公司，貨號(hào)：YT828-TUV)。

1.2慢病毒載體構(gòu)建 miR-146a表達(dá)下調(diào)的慢病毒載體構(gòu)建、大鼠miR-146a序列查找及設(shè)計(jì)由上海GeneChem公司完成，重組miR-146a上調(diào)病毒載體、miR-146a下調(diào)載體由上海GeneChem公司合成，并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，病毒滴度為108 TU/ml，制備完成將重組慢病毒載體在-80℃保存。

1.3分組及建模 將40只SPF級(jí)SD大鼠平均分為4組，每組10只，選擇3組大鼠建立牙髓炎模型，參考韓耀倫等〔6〕研究實(shí)驗(yàn)進(jìn)行構(gòu)建：首先將3組大鼠進(jìn)行麻醉，并采取仰臥位將其固定，用鑷子使大鼠上頜張開(kāi)，暴露其上頜磨牙，進(jìn)行消毒后，將大鼠左側(cè)上頜第一磨牙、第二磨牙用高速渦輪機(jī)005號(hào)球鉆頜面開(kāi)髓，髓孔大約1 mm，當(dāng)觀察到牙本質(zhì)呈現(xiàn)紅色后，使用金屬探針加壓形成穿髓孔開(kāi)放髓腔，使髓腔充分暴露。觀察牙髓血管擴(kuò)張并伴隨著充血現(xiàn)象，冠髓部白細(xì)胞大量浸潤(rùn)，表示建模成功。

1.4慢病毒轉(zhuǎn)染 選取10只建模成功大鼠設(shè)為上調(diào)組，對(duì)其牙髓部注射含10 μl重組miR-146a上調(diào)病毒載體的慢病毒懸液；另選取10只建模成功大鼠設(shè)為下調(diào)組，對(duì)其牙髓部注射含10 μl miR-146a下調(diào)載體的慢病毒懸液；剩余建模成功的10只大鼠設(shè)為模型組，為進(jìn)行建模處理的大鼠設(shè)為空白組，并對(duì)兩組分別注射與上述兩組等量的生理鹽水。于2 w后觀察各組大鼠的變化情況。

1.5miR-146a基因表達(dá)量 采集所有大鼠心臟血液，2 000 r/min 4℃離心10 min，收集血清。miRNA采用mirVana PARIS Kit試劑盒提取純化。在室溫下加入取出的500 μl血清樣品等體積變性液，混合均勻，加入同樣多的體積酸性酚氯仿，搖晃30～60 s；離心5 min 14 000 r/min在室溫下操作。把上清液放到另一個(gè)管中，加入1.25倍無(wú)水乙醇充分混勻，然后加入柱中，離心30 s 12 000 r/min，棄濾液；700 μl加入柱中，清洗1次，12 000 r/min離心30 s，棄濾液；把500 μl加入柱中，清洗2次，12 000 r/min離心1 min；95℃預(yù)熱洗脫液60 μl加入柱子中，離心1 min 12 000 r/min，收集miRNA。miR-146a上游引物序列：5′-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3′，下游：5′-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU-3′。U6上游引物序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAA-3′，下游：5′-CGAATTTGCGTGTCATCCTT-3′。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)提取DNA 0.5 ml血清加等量的裂解液于尖底離心管中，37℃孵育1 h，加入0.1 ml樣品稀釋液。PCR擴(kuò)增取上述0.02 ml DNA提取液加入分裝好的反應(yīng)液管中。

1.6病理組織學(xué)觀察 各組腹腔注射3.0% 80 mg/kg的戊巴比妥麻醉，迅速取分離牙髓組織，將提取的牙髓組織制作成標(biāo)本，用4%多聚甲醛固定，室溫下用15%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣、脫水后用石蠟進(jìn)行包埋，作3 μm的切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，使用光學(xué)顯微鏡觀察海馬神經(jīng)病理變化。

1.7IL-8、TNF-α、IL-6、IL-1β水平檢測(cè) 采集所有大鼠血樣本，靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，用移液槍吸取上清液，采用ELISA檢測(cè)，分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔，將樣品加入96孔酶標(biāo)板中，每孔50 μl，隨后將其樣品加于至酶標(biāo)板孔的底部位置，在進(jìn)行加入的過(guò)程中對(duì)于孔壁盡量不要去觸碰，加入之后進(jìn)行搖勻，待搖勻后使用封板膜將其進(jìn)行封板，置于37℃常溫中進(jìn)行孵育30 min。洗板3次，除去空白孔，其余的兩孔內(nèi)均分別加入50 μl的酶標(biāo)試劑，37℃溫育30 min。洗板3次，在3孔中按照先后順序先加入50 μl的顯色劑A，再加入50 μl的顯色劑B，在37℃常溫中進(jìn)行溫育30 min。每孔加入終止液50 μl，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。以空白孔凋零，450 nm波長(zhǎng)依順序測(cè)量各孔的吸光度，分析IL-8、TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

1.8TLR4、NF-κB蛋白 采用Western印跡檢測(cè)，取所有大鼠牙髓組織蛋白。對(duì)組織標(biāo)本以磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行沖洗后，行30 min裂解，3 000 r/min離心處理10 min，提取上清液，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量，在2×十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠緩沖液中加入50 μg蛋白，添加完成蛋白緩沖液后開(kāi)始進(jìn)行100℃加熱5 min。凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，取膜，4℃下固定、封閉處理1 h，將一抗使用0.05%～0.10% TBST給予稀釋，4℃孵育過(guò)夜保存，之后使用0.05%～0.10% TBST洗膜，3次，每次5 min，二抗被0.05%～0.10% TBST稀釋(1∶10 000)，搖動(dòng)孵育時(shí)間為1 h，TBST連續(xù)洗膜3次，處理5 min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，定量分析蛋白表達(dá)情況。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組miR-146a表達(dá)、IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α、TLR4/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)量比較 與空白組相比，模型組、上調(diào)組，下調(diào)組miR-146a基因表達(dá)量、IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α、TLR4/NF-κB信號(hào)通路蛋白顯著升高(P<0.01)；上調(diào)組miR-146a表達(dá)、IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α、TLR4/NF-κB信號(hào)通路蛋白顯著高于模型組(P<0.05)；下調(diào)組miR-146a表達(dá)、IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α、TLR4/NF-κB信號(hào)通路蛋白顯著低于模型組、上調(diào)組(均P<0.05)。見(jiàn)圖1、表1。

表1 各組miR-146a表達(dá)、IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α、TLR4/NF-κB信號(hào)蛋白表達(dá)比較

圖1 Western印跡檢測(cè)各組細(xì)胞TLR4/NF-κB信號(hào)通路蛋白

2.2病理學(xué)觀察 空白組牙髓組織無(wú)明顯變化。模型組穿髓點(diǎn)有壞死區(qū)出現(xiàn)，周圍環(huán)繞少量纖維組織，且有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，根髓血管擴(kuò)張、充血，出現(xiàn)大量紅細(xì)胞。上調(diào)組冠髓被大量炎癥細(xì)胞占據(jù)，大量成纖維細(xì)胞、牙本質(zhì)細(xì)胞液化、體積變形，根髓空泡出現(xiàn)變形且排列紊亂。下調(diào)組牙髓組織內(nèi)輕度炎癥反應(yīng)，在光鏡下可以觀察到穿髓點(diǎn)下方有少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，牙本質(zhì)細(xì)胞排列紊亂，根髓正常，血管內(nèi)有少量紅細(xì)胞。見(jiàn)圖2。

圖2 各組牙髓炎病理觀察(HE染色，×400)

3 討 論

牙髓炎是臨床常見(jiàn)病，疼痛是臨床主要癥狀，且導(dǎo)致該病的因素較多，嚴(yán)重影響患者的身心健康〔7,8〕。此外，牙髓炎還會(huì)影響牙齒的血液循環(huán)、營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，而嚴(yán)重的牙髓炎還會(huì)引起牙髓壞死、根尖周炎，是牙齒脫落的重要原因〔9〕。牙髓炎的發(fā)展過(guò)程中，輕度炎癥可引起牙髓組織自我再生、自我修復(fù)能力，重度炎癥則會(huì)導(dǎo)致牙髓壞死〔10〕。

miRNA通過(guò)和靶基因mRNA 3′非轉(zhuǎn)錄區(qū)互相配對(duì)，從而引起mRNA的降解抑制，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因的表達(dá)呈負(fù)調(diào)控。目前在人體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)530余種miRNAs，在疾病發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用。侯云華等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，慢性牙周炎(CP)患者在唾液中miR-146a表達(dá)水平的明顯升高，miR-146a表達(dá)水平的高低與疾病嚴(yán)重程度具有相關(guān)性。目前尚未有研究miR-146a在牙髓炎的機(jī)制作用，所以牙髓炎后miR-146a是否參與調(diào)控其炎癥反應(yīng)及其主要的靶基因都不明確〔12,13〕。本研究結(jié)果表明，miR-146a可能與牙髓炎癥反應(yīng)相關(guān)，且可能在牙髓炎恢復(fù)過(guò)程中對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控發(fā)揮重要的作用。

TNF-α對(duì)于機(jī)體內(nèi)部的腫瘤細(xì)胞有明顯殺傷力，但是對(duì)于正常細(xì)胞不具備殺傷作用，其廣泛存在于機(jī)體中，在機(jī)體炎癥反應(yīng)中較為活躍，可作為各種信號(hào)通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔14,15〕。IL-1β廣泛參與炎癥反應(yīng)中，研究證明在發(fā)生牙髓炎時(shí)IL-1β水平明顯升高，并且參與了牙髓炎的免疫反應(yīng)〔16〕。IL-6具有多生物學(xué)活性的特征。其在機(jī)體中的高表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞的分化和浸潤(rùn)，上調(diào)其他炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，加重炎癥損傷和神經(jīng)根超敏，最終導(dǎo)致疼痛、麻木等相關(guān)癥狀〔17,18〕。有研究表明，炎性因子能夠通過(guò)調(diào)控牙髓細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，參與牙髓炎的整個(gè)過(guò)程。有研究顯示，IL-8和IL-6水平明顯高于正常牙髓炎患者。IL-8 在炎癥前期發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，炎癥前期IL-8就會(huì)起到調(diào)節(jié)影響，炎癥受損位置IL-8了募集中性粒細(xì)胞對(duì)炎癥反應(yīng)起到介導(dǎo)作用，在促炎階段IL-8是第二大細(xì)胞因子〔19,20〕。本研究結(jié)果說(shuō)明，下調(diào)miR-146a可有效降低炎癥反應(yīng)，起到保護(hù)牙髓細(xì)胞的作用。TLR4/NF-κB信號(hào)在細(xì)胞的氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等生理病理過(guò)程中起到重要的作用〔21〕。NF-κB活化后不僅可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中的基因，還可以轉(zhuǎn)錄上調(diào)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。NF-κB可以激活各種外界刺激，包括血流切應(yīng)力。TLR4是哺乳動(dòng)物的Toll樣受體。有研究顯示，TLRs家族不僅在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，而且與各種炎癥性疾病密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)miR-146a對(duì)牙髓炎具有良好的抑制效果，其原因可能為miR-146a通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路的方式抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到對(duì)牙髓炎的抑制效果，更好的保護(hù)牙髓細(xì)胞不受侵害。

綜上，下調(diào)miR-146a基因可能經(jīng)作用于TLR4/NF-κB信號(hào)通路后，抑制炎癥反應(yīng)，miR-146a可以成為牙髓炎診斷和病情判斷的分子標(biāo)志物。