腦梗死模型大鼠血清中GAP-43、TNF-α和血管形成素-1表達(dá)水平

方建偉 李愛(ài)芹

(承德市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 承德 067000)

近年來(lái)腦梗死發(fā)病率和致殘率持續(xù)升高，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，給患者家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)，也給社會(huì)帶來(lái)很大壓力〔1,2〕。腦梗死不僅會(huì)使大腦細(xì)胞死亡，更會(huì)破壞血腦屏障，使其失去阻擋多種物質(zhì)進(jìn)入腦部組織的作用，使腦脊液的物質(zhì)成分和比例失衡，引起其他疾病〔3,4〕。生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(GAP)-43與神經(jīng)細(xì)胞再生和突觸發(fā)育關(guān)系密切。腫瘤壞死因子(TNF)-α是一種對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯毒副作用，卻可以殺死非正常細(xì)胞的因子，還可促進(jìn)細(xì)胞增殖分化，增強(qiáng)有絲分裂原或外來(lái)抗原刺激B細(xì)胞的增殖和Ig分泌〔5〕。血管形成素(Ang)-1是神經(jīng)細(xì)胞損傷后間質(zhì)血管新生的蛋白質(zhì)，可促進(jìn)間質(zhì)的肉芽組織的形成，還可改善局部血液循環(huán)，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的正常功能〔6〕。本文探討腦梗死大鼠血清中GAP-43、TNF-α和Ang-1的表達(dá)水平的變化及其神經(jīng)功能的變化。

1 材料與方法

1.1材料 研究動(dòng)物：選擇SD健康雄性大鼠40只，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。其年齡10～11周齡，平均(10.3±0.5)周齡，體重220～250 g,平均(236.6±12.4)g，飼養(yǎng)溫度為22～25℃，室內(nèi)濕度35%～40%，飼養(yǎng)室定時(shí)予紫外線消毒。并飼喂統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由活動(dòng)。選取15只作為對(duì)照組，不做任何處理。剩下的20只做成腦梗死模型，為腦梗死模型組。另外養(yǎng)5只大鼠備用，避免實(shí)驗(yàn)動(dòng)物因?qū)嶒?yàn)過(guò)程中出現(xiàn)死亡及其他因素導(dǎo)致的動(dòng)物死亡，進(jìn)而保證數(shù)據(jù)的完整性。本研究所做實(shí)驗(yàn)均獲得醫(yī)院倫理會(huì)批準(zhǔn)。

1.2模型制備 將除去對(duì)照組的15只大鼠禁食不禁水飼養(yǎng)12 h，然后給予10%的水合氯醛麻醉，用線栓法將麻醉的大鼠制作大鼠腦梗死動(dòng)物模型。把大鼠仰臥固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，充分暴露其頸部皮膚，用75%的酒精消毒后，打開大鼠頸部皮膚，利用分離針?lè)蛛x出頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，在遠(yuǎn)心端結(jié)扎頸外動(dòng)脈，然后在頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端和頸總動(dòng)脈近心端，用動(dòng)脈夾阻斷循環(huán)血流。將頸外動(dòng)脈在結(jié)扎處剪斷，從剪斷處插入栓線，直至頸內(nèi)動(dòng)脈處，然后打開頸內(nèi)動(dòng)脈夾，繼續(xù)推進(jìn)栓線，直到遇到阻力，當(dāng)阻斷大腦中動(dòng)脈血流后，繼續(xù)將栓線深插入18～20 mm，最后固定栓線并縫合皮膚。2 h后再次用10%的水合氯醛麻醉大鼠，把栓線拔出來(lái)，縫合傷口，75%酒精消毒。模型制備完成后，給予大鼠抗感染護(hù)理，讓其自由攝食和飲水。大鼠蘇醒后，左側(cè)表現(xiàn)為Horner征，提尾時(shí)右側(cè)前肢內(nèi)收屈曲,右前爪不能伸展或存在右側(cè)轉(zhuǎn)圈障礙，則建模成功。手術(shù)過(guò)程中，死亡2只，感染1只，另外還有1只建模失敗，其神經(jīng)病理癥狀不明顯，予以剔除。備用大鼠補(bǔ)上，以保證數(shù)據(jù)的完整性。

1.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)大鼠血清中GAP-43的水平 抽取各組大鼠清晨空腹靜脈血3 ml，使用離心機(jī)離心處理10 min，轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，分離出血清和紅細(xì)胞；加入乙二胺四乙酸(EDTA)和肝素，3 000 r/min離心10 min,取上清液；再3 000 r/min離心10 min，取組織勻漿，加入生理鹽水中，搗碎，3 000 r/min離心10 min,取上清液。于-20℃冰箱中保存,待檢。運(yùn)用酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清GAP-43的水平。在測(cè)定時(shí)，嚴(yán)格按照GAP-43試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，把待測(cè)樣本加入GAP-43試劑盒中，血清中受檢測(cè)物質(zhì)與固相載體上的酶量充分結(jié)合，并成一定的比例，用洗滌的方法除去雜質(zhì)，加入微孔板酶標(biāo)儀中，其形成的復(fù)合物中加入酶反應(yīng)的底物，最后形成有色產(chǎn)物，通過(guò)比色檢測(cè)血清中GAP-43的量，進(jìn)行接下來(lái)的指標(biāo)水平比較。

1.4電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)血清TNF-α、Ang-1的水平 嚴(yán)格按照化學(xué)發(fā)光免疫分析儀操作步驟進(jìn)行操作。采用i2000全自動(dòng)微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及其配套試劑進(jìn)行檢測(cè)。將魯米諾發(fā)光底液加入待測(cè)樣本中，與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)反應(yīng)后，形成中間體，處于激發(fā)狀態(tài)的中間體穩(wěn)定后，會(huì)發(fā)射光子。然后使用發(fā)光信號(hào)測(cè)量?jī)x測(cè)量光子數(shù)值，檢測(cè)TNF-α、Ang-1的水平。

1.5RT-PCR技術(shù)檢測(cè)GAP-43、TNF-α、Ang-1 mRNA表達(dá)水平 操作過(guò)程嚴(yán)格按照定量PCR儀的操作說(shuō)明書進(jìn)行。首先加入稀釋10倍的PCR緩沖液2.5 μl，然后加入MgCl2溶液1.5 μl，之后加入上游引物和下游引物各0.5 μl，混勻后加入水至25 μl。分別放在94℃、55℃和72℃的環(huán)境中各反應(yīng)1 min，此循環(huán)連續(xù)進(jìn)行35次，最后在72℃環(huán)境中反應(yīng)延長(zhǎng)5 min，重復(fù)3次以上。采用2-△△Ct方法計(jì)算出需要檢測(cè)GAP-43、TNF-α、Ang-1 mRNA的表達(dá)水平。

1.6大鼠改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分(mNSS) 參照劉雙鳳等〔7〕對(duì)大鼠神經(jīng)功能mNSS的方法，檢測(cè)對(duì)照組大鼠、腦梗死大鼠造模后1 d、3 d、7 d的神經(jīng)功能，包括提尾試驗(yàn)3分，將老鼠放于地板行走試驗(yàn)3分，感覺(jué)試驗(yàn)2分、平衡木試驗(yàn)6分，反射活動(dòng)和異常運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)4分，5個(gè)方面的神經(jīng)功能mNSS，評(píng)分滿分為18分。得分越高其神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.7蘇木素-伊紅(HE)染色測(cè)定腦梗死體積 造模成功后對(duì)各組大鼠進(jìn)行10%水合氯醛腹腔麻醉，對(duì)大鼠右心室進(jìn)行快速灌注磷酸鹽緩沖液(PBS)，隨即斷頭取腦，在4%多聚甲醛中固定48 h之后放于模具之中，并沿冠狀進(jìn)行切片，向前囟方向切片2張，向小腦方向切片3張，切片保證每片厚約2 mm，并做石蠟包埋處理。對(duì)所取大鼠腦組織切片做HE染色，并使用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍攝，利用Image-PmPlus6.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)大鼠腦梗死體積比例進(jìn)行計(jì)算。大鼠腦梗死體積=(正常側(cè)大腦半球體積-梗死側(cè)非梗死區(qū)大腦半球的體積)/正常側(cè)大腦半球體積。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組GAP-43、TNF-α、Ang-1水平及mRNA表達(dá)比較 對(duì)照組GAP-43、TNF-α、Ang-1水平及mRNA水平在各時(shí)間段無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。大鼠造模后，其腦梗死1 d、7 d、14 d時(shí)GAP-43、TNF-α、Ang-1水平及mRNA表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；腦梗死7 d時(shí)大鼠GAP-43、TNF-α、Ang-1水平及mRNA表達(dá)水平明顯高于腦梗死1 d時(shí)，腦梗死1 d時(shí)GAP-43、TNF-α、Ang-1水平及mRNA表達(dá)水平明顯高于腦梗死14 d時(shí)(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組GAP-43、TNF-α、Ang-1水平及mRNA表達(dá)比較

2.2兩組mNSS及腦梗死體積比較 對(duì)照組mNSS及腦梗死體積在各時(shí)間段無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。腦梗死1、7、14 d的大鼠mNSS均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；且腦梗死1 d大鼠mNSS明顯高于腦梗死7 d大鼠，腦梗死7 d大鼠mNSS明顯高于腦梗死14 d大鼠(P<0.05)；腦梗死1、7 d的大鼠腦梗死體積均明顯高于腦梗死14 d大鼠(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組mNSS及腦梗死體積比較

3 討 論

腦梗死治療后高復(fù)發(fā)率、高死亡率及高致殘率，極大影響了患者的生活質(zhì)量〔8〕。有資料顯示，腦梗死的發(fā)病率有明顯上升并呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)。所以，加深對(duì)腦梗死的研究可以為腦梗死的臨床判斷和治療提供重要的參考價(jià)值，也可為疾病的治療提供新的思路和方法〔9～11〕。正常情況下，腦毛細(xì)血管與腦細(xì)胞之間存在血腦屏障，血腦屏障可以有效阻止有害物質(zhì)進(jìn)入腦組織，進(jìn)而避免腦組織損傷，或降低有害物質(zhì)的侵害。依靠這種方式，維持了腦組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，這對(duì)于生物的生存有著重要的意義〔12,13〕。然而，當(dāng)腦梗死后發(fā)生，血清中炎癥介質(zhì)明顯升高，氧自由基及蛋白水解酶等大量增加，會(huì)對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行破壞，進(jìn)而導(dǎo)致血腦屏障通透性增加，有害物質(zhì)會(huì)隨著血液循環(huán)進(jìn)入腦組織，這樣對(duì)腦組織造成嚴(yán)重?fù)p傷，尤其是在腦神經(jīng)元再生過(guò)程中，呈現(xiàn)出物質(zhì)表達(dá)水平及交換速度加快情況，腦組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)被破壞。

GAP-43具有調(diào)解軸突延伸的作用，改變細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)其作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，可有效增強(qiáng)與G蛋白偶聯(lián)受體之間的關(guān)聯(lián)性〔14〕。正常情況下，GAP-43的表達(dá)水平很低，血清中的水平也很少，但是當(dāng)腦梗死發(fā)生時(shí)，腦組織損傷部位周圍神經(jīng)元的傳入側(cè)支發(fā)芽，反應(yīng)性軸突再生，形成負(fù)反饋機(jī)制，此時(shí)，GAP-43的表達(dá)水平升高，但也不會(huì)一直升高，會(huì)隨著修復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降。由于血腦屏障被破壞，血清中的GAP-43水平也會(huì)隨之發(fā)生不同的變化〔15,16〕。因此，檢測(cè)血清中GAP-43的水平可以作為研究神經(jīng)生長(zhǎng)發(fā)育和損傷修復(fù)等神經(jīng)可塑性的方法之一。本研究表明，大鼠腦梗死發(fā)生后，其血清中的GAP-43和TNF-α mRNA表達(dá)水平迅速升高，當(dāng)達(dá)到最大值后，又開始回落，大鼠的神經(jīng)功能也有所改善。這可能是由于大鼠腦組織受到損傷后，迅速表達(dá)出大量的GAP-43，隨著損傷修復(fù)速度的增加，GAP-43的表達(dá)持續(xù)增多，當(dāng)修復(fù)到一定程度時(shí)，損傷部位周圍神經(jīng)元的傳入側(cè)支和反應(yīng)性軸突增多，神經(jīng)末梢的表面積也隨之增加，隨著新突觸的形成，更多的樹突和軸突之間建立聯(lián)系，此時(shí)，損傷部位周圍神經(jīng)元的傳入側(cè)支發(fā)芽和反應(yīng)性軸突再生減少或者停止，GAP-43的表達(dá)水平也隨之下降。

TNF-α具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化等作用〔17〕。TNF-α通過(guò)刺激B細(xì)胞增殖，促進(jìn)Ig分泌，也可通過(guò)促進(jìn)與細(xì)胞增殖相關(guān)的一些原癌基因的表達(dá)，刺激細(xì)胞周期由G0期向G1期轉(zhuǎn)化〔18〕。本研究顯示，大鼠腦梗死發(fā)生后，其血清中TNF-α和TNF-α mRNA的表達(dá)迅速增多。這可能是由于大鼠腦部神經(jīng)元受到損傷后，失去其正常功能，為了維持腦組織的功能，需要周圍神經(jīng)細(xì)胞代償性再生，TNF-α和TNF-α mRNA大量表達(dá)，以促進(jìn)周圍神經(jīng)細(xì)胞從細(xì)胞周期的Go期向G1期轉(zhuǎn)變，促進(jìn)細(xì)胞的分裂增殖，以形成新的突觸。當(dāng)損傷修復(fù)到機(jī)體所能達(dá)到的最大程度時(shí)，就逐漸減慢或停止修復(fù)，TNF-α的表達(dá)也隨之回降。

ANG-1是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性受體酪氨酸激酶-2的配體，為血管生成的主要物質(zhì)之一，對(duì)維持新生血管的穩(wěn)定性具有重要作用，且可影響血管重構(gòu)和血管的成熟〔19〕?？梢?jiàn)，ANG-1在調(diào)節(jié)血管功能方面發(fā)揮著重要作用。本研究表明，大鼠腦梗死發(fā)生后，其血清中ANG-1和ANG-1 mRNA的表達(dá)迅速增多。這可能是由于大鼠腦梗死發(fā)生后，血腦屏障受到破壞，血清中各種因子的正常平衡打破，血管的完整性不能維持，血清中ANG-1和ANG-1 mRNA的表達(dá)增多，以發(fā)揮其重構(gòu)血管的作用，并維持修復(fù)后血管的完整性。當(dāng)血管修復(fù)到機(jī)體所能修復(fù)的最大程度時(shí)，血管的重構(gòu)減弱或停止，ANG-1的表達(dá)也降低。

綜上，檢測(cè)腦梗死大鼠血清中GAP-43、TNF-α和Ang-1的表達(dá)水平，可以更好地判斷模型大鼠的腦部神經(jīng)損傷的嚴(yán)重程度，為腦梗死的臨床判斷、以后的治療以及預(yù)后恢復(fù)情況提供重要的參考價(jià)值。