基于TLR4/TAK1/NF-κB途徑探討MCAO大鼠缺血局部腦皮質(zhì)微血管新生的內(nèi)在機(jī)制

張春玲 梁超 王寶愛 徐玉婷

(?？谑兄嗅t(yī)醫(yī)院，海南 ?？?570216)

腦血管疾病在中老年人中較常見，且因其高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率，給人類的健康帶來(lái)了嚴(yán)重的威脅〔1〕。局灶性腦缺血發(fā)生后，其損害程度取決于血管細(xì)胞、神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞之間活躍而復(fù)雜的相互作用〔2〕。腦缺血引起的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMECs)損傷是導(dǎo)致血腦屏障破壞的主要原因〔3〕。Toll樣受體(TLRs)廣泛表達(dá)于天然免疫細(xì)胞，在早期天然免疫中起著重要作用，其中TLR4被激活后可活化核因子(NF)-κB，進(jìn)而誘導(dǎo)和調(diào)控炎癥反應(yīng)〔4〕。在大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)小鼠模型中TLR4表達(dá)水平升高，此外，缺乏TLR4的小鼠神經(jīng)功能缺陷明顯減少〔5〕。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β激活激酶(TAK)1是一種MAP3激酶，位于與腦缺血損傷有關(guān)的幾種途徑的上游〔6〕。TAK1可被TGF-β、白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α等缺血性損傷后分泌的細(xì)胞因子激活，而 TAK1的激活反過來(lái)又會(huì)誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，并激活已知在腦缺血病理中起有害作用的免疫細(xì)胞，從而參與腦缺血的發(fā)病進(jìn)程〔7〕。也有研究表明，TLR4與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF)6結(jié)合并促進(jìn)其活化，活化的TRAF6可與TAK1及其TGF-β活化激酶結(jié)合蛋白(TAB)1相互作用促使TAK1活化，TAK1被激活后可解除NF-κB的抑制，而NF-κB被活化后可導(dǎo)致炎癥因子的廣泛表達(dá)，從而減輕或加重炎癥反應(yīng)造成的腦缺血損傷〔8，9〕。但TLR4/TAK1/NF-κB途徑是否與MCAO大鼠缺血局部腦皮質(zhì)微血管新生相關(guān)尚不清楚。本研究旨在基于TLR4/TAK1/NF-κB途徑探討MCAO大鼠缺血局部腦皮質(zhì)微血管新生的內(nèi)在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只成年SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體重(230±10)g，由珠海百試通生物科技有限公司提供，在溫度20～25℃，濕度40%～60%的條件下分籠飼養(yǎng)。

1.2試劑 siRNA-TLR4 純化腺病毒和陰性對(duì)照病毒均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因生物技術(shù)有限公司；Ki67、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、促血管生成素(Ang)-1、Ang-2抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；TLR4、TGF、TAK1、NF-κB p65和β-actin鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。

1.3儀器 熒光顯微鏡(日本NIKON公司，型號(hào) Eclipse 80i)；病理切片機(jī)(美國(guó)賽默飛公司，型號(hào)Thermo HM)；包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司，型號(hào)JB-P5)；PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)CFX96 Touch)。

1.4動(dòng)物分組及造模 40只雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，其中10只為假手術(shù)(Sham)組，另30只采用線栓法建立MCAO大鼠模型，并將其分為模型(Model)組、陰性病毒(NC)組和siRNA-TLR4轉(zhuǎn)染(siRNA-TLR4)組，具體造模方法如下：所有大鼠于術(shù)前禁食12 h，仰臥位固定，采用3.5%異氟烷進(jìn)行麻醉，分離并暴露一側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，并夾閉右側(cè)頸總動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)端處剪3 mm小口，將0.28 mm的尼龍線從小口處穿入至大腦中動(dòng)脈，固定線栓，結(jié)扎并剪去線栓尾端，縫合切口并消毒。Sham組僅分離血管不插入線栓進(jìn)行造模。

1.5給藥劑量 造模后1 h，Sham組與Model組均給予尾靜脈注射等量生理鹽水，NC組給予尾靜脈注射陰性對(duì)照病毒5×109PFU，siRNA-TLR4組給予尾靜脈注射siRNA-TLR4腺病毒5×109PFU，所有大鼠術(shù)后正常喂養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察缺血局部腦皮質(zhì)病理變化 各組大鼠于術(shù)后48 h，麻醉斷頭處死后，迅速取出腦組織，用冷生理鹽水清洗腦組織并除去腦組織表面殘余的水分，取部分腦組織用4%多聚甲醛溶液固定24 h，脫水并用石蠟包埋，按照步驟處理切片，用HE染色法觀察大鼠缺血局部腦皮質(zhì)病理變化。

1.7氯化三苯基四氮唑染色(TTC)檢測(cè)大鼠腦梗死面積 各組大鼠處死后取腦組織，并制作冠狀腦片，嚴(yán)格按照TTC試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行染色，分析并計(jì)算各組大鼠腦梗死面積。

1.8TUNEL染色檢測(cè)大鼠缺血局部腦皮質(zhì)細(xì)胞凋亡情況 對(duì)各組大鼠的石蠟切片進(jìn)行脫蠟和水化，用0.01 mol/L檸檬酸緩沖液(pH6.0)處理切片，參照TUNEL試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察并計(jì)算腦皮質(zhì)細(xì)胞凋亡率。

1.9免疫熒光染色檢測(cè)微血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目 石蠟切片脫蠟脫水，用蒸餾水浸泡2 min，微波爐內(nèi)對(duì)抗原進(jìn)行熱修復(fù)。10%正常山羊血清封閉，室溫孵育30 min，以減少非特異性染色。滴加1∶200濃度的Ki67一抗4℃過夜，滴加異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記山羊抗兔IgG熒光抗體37℃染色30 min。4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI)復(fù)染細(xì)胞核，緩沖甘油封固后鏡檢。其中每一步均需PBS漂洗，5 min/次，共3次。

1.10免疫組化法檢測(cè)VEGF、Ang-1和Ang-2表達(dá)水平 石蠟切片脫蠟后，置于3% H2O2中室溫孵育10 min，微波爐內(nèi)對(duì)抗原進(jìn)行熱修復(fù)。切片冷卻至室溫后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min×3次。10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min，滴加1∶100濃度的VEGF、Ang-1和Ang-2一抗4℃過夜，PBS沖洗5 min×3次。滴加適量生物素標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h，PBS沖洗5 min×3次。滴加適量辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10 min，PBS沖洗5 min×3次。滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑顯色15 min，自來(lái)水充分沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片，熒光顯微鏡下觀察并記錄。

1.11反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)TLR4、TAK1、NF-κB p65 mRNA表達(dá) 取部分腦組織放入去酶EP管中，用超純 RNA 提取試劑盒按產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，提取組織樣本中總 RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃，45 s，95℃，15 s，60℃，60 s，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。每組進(jìn)行3次獨(dú)立測(cè)定，采用 2-ΔΔCt法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。RT-PCR引物序列：β-actin正向：5′-CTTGTGCAGTGCCAGCC-3′，反向：5′-GCCCAATACGGC CAAATCC-3′；TLR4正向：5′-AATCTGGTGGCTGTGGAGAC-3′，反向：5′-GCTTGGGCTTGAATGGAGT-3′；TAK1正向：5′-CAAAGCTAAGTGGAGAGCAAAAGA-3′，反向：5′-GATAACTGCCGAAGCTCTACAATAA-3′；NF-κB p65正向：5′-TGTGATGAAAGACGGCAC-AC-3′，反向：5′-CTTCTTCTTTCGGGTATTGTTTGG-3′。

1.12Western印跡檢測(cè)TLR4、TAK1和NF-κB p65蛋白表達(dá) 取部分腦組織在研缽中充分研磨，加入裂解液置冰上充分裂解，4℃下離心30 min，吸取上清；采用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測(cè)量蛋白質(zhì)含量，確定每孔上樣蛋白量相等。取少量蛋白質(zhì)配制成上樣緩沖液，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗TLR4、TAK1、NF-κB p65和β-actin，4℃過夜；TBST洗滌，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫輕搖1 h，TBST充分洗滌，用 ECL 化學(xué)發(fā)光試劑顯色后，化學(xué)發(fā)光儀成像。

1.13統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組缺血局部腦皮質(zhì)病理變化 Sham組細(xì)胞質(zhì)分布均勻，核膜完整，核仁清晰，神經(jīng)元排列整齊，且形態(tài)完整；Model組和NC毒組可觀察到大量不規(guī)則的細(xì)胞和空泡，細(xì)胞核固縮和遷移，胞質(zhì)和細(xì)胞核模糊不清；siRNA-TLR4組缺血半影區(qū)細(xì)胞形態(tài)比模型組和陰性病毒組規(guī)則，且腦組織損傷程度降低。見圖1。

圖1 各組缺血局部腦皮質(zhì)病理變化(HE染色，×400)

2.2各組腦梗死面積比較 與Sham組相比，Model組、NC組和siRNA-TLR4組腦梗死面積明顯增大(P<0.01)；與Model組相比，siRNA-TLR4組腦梗死面積明顯減小(P<0.01)。見表1。

2.3各組腦皮質(zhì)細(xì)胞凋亡情況 與Sham組相比，Model組、NC組和siRNA-TLR4組腦皮質(zhì)細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與Model組相比，siRNA-TLR4組腦皮質(zhì)細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 各組腦皮質(zhì)細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色，×400)

2.4各組BMECs增殖數(shù)目比較 與Sham組相比，Model組、NC組和siRNA-TLR4組BMECs明顯增加(P<0.05)；與Model組比較，siRNA-TLR4組BMECs明顯增加(P<0.05)。見表1、圖3。

表1 各組腦梗死面積和腦皮質(zhì)細(xì)胞凋亡情況、BMECs增殖和腦組織VEGF、Ang-1和Ang-2表達(dá)

圖3 各組腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖數(shù)目(免疫熒光染色，×200)

2.5各組腦組織VEGF、Ang-1和Ang-2表達(dá)比較 與Sham組相比，Model組、NC組和siRNA-TLR4組VEGF、Ang-1和Ang-2表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與Model組相比，siRNA-TLR4組VEGF、Ang-1和Ang-2表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.6各組腦組織TLR4、TAK1、NF-κB p65 mRNA表達(dá) 與Sham組相比，Model組、NC組和siRNA-TLR4組TLR4、TAK1、NF-κB p65 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與Model組相比，siRNA-TLR4組TLR4、TAK1、NF-κB p65 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見表2、圖4、表3。

表2 各組腦組織TLR4、TAK1、NF-κB p65 mRNA表達(dá)比較

圖4 各組腦組織TLR4、TAK1、NF-κB p65 蛋白表達(dá)

表3 各組腦組織TLR4、TAK1、NF-κB p65蛋白表達(dá)比較

3 討 論

腦缺血又稱為缺血性腦卒中，占腦卒中的80%以上，且腦缺血是全球死亡率和發(fā)病率的主要原因〔10〕。腦血管阻塞導(dǎo)致腦缺血、缺氧，并對(duì)大腦造成一系列的病理?yè)p害，且腦缺血生理過程通常被認(rèn)為是一個(gè)多環(huán)節(jié)、多通道的快速級(jí)聯(lián)反應(yīng)〔11〕。腦缺血可引起神經(jīng)細(xì)胞的水腫、變形、凋亡及壞死等，而該病理過程與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，腦組織炎癥因子的產(chǎn)生不僅可引起腦膠質(zhì)細(xì)胞的增生，也可參與缺血局部腦皮質(zhì)微血管新生，且缺血區(qū)微血管新生程度對(duì)腦缺血患者的神經(jīng)功能恢復(fù)具有重要作用〔12,13〕。血管新生是指血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生分裂、分化和增殖形成新的毛細(xì)血管網(wǎng)的過程〔14〕。據(jù)報(bào)道，微血管新生和腦缺血后再灌注血流可通過保護(hù)血腦屏障改善腦組織能量代謝障礙，促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)祖細(xì)胞的分化、增殖及神經(jīng)元再生，從而改善腦缺血患者神經(jīng)功能、認(rèn)知功能、語(yǔ)言功能及運(yùn)動(dòng)功能等〔15〕。

TLRs介導(dǎo)炎性腦缺血損傷，而TLR4是一種在神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)的膜蛋白受體，主要負(fù)責(zé)炎癥反應(yīng)〔16〕。多項(xiàng)研究表明，TLR4參與腦缺血損傷的病理過程〔17〕。本研究結(jié)果顯示，siRNA-TLR4轉(zhuǎn)染組缺血半影區(qū)細(xì)胞形態(tài)比模型組和陰性病毒組規(guī)則，且腦組織損傷程度降低。此外，沉默TLR4表達(dá)后，MCAO大鼠腦梗死面積及腦皮質(zhì)細(xì)胞凋亡率明顯降低。BMECs是腦組織微血管的組成單元，其損傷程度決定了缺血局部腦皮質(zhì)微血管新生的可能性〔18〕，本研究結(jié)果表明，沉默TLR4表達(dá)可促使微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。VEGF和Ang是血管新生的兩種相關(guān)因子，VEGF可通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，加速新生血管的形成〔19〕；Ang具有誘導(dǎo)血管生成的作用，其中Ang-1能促使血管成熟，Ang-2能促使血管出芽及生長(zhǎng)，VEGF、Ang-1和Ang-2三者相互協(xié)調(diào)共同促進(jìn)血管新生〔20〕。本研究結(jié)果表明沉默TLR4表達(dá)可通過上調(diào)VEGF、Ang-1和Ang-2水平促進(jìn)微血管新生。腦缺血后抑制TLR4表達(dá)，可進(jìn)一步抑制TAK1和NF-κB活化，從而抑制炎癥反應(yīng)對(duì)腦缺血后的繼發(fā)性損傷。

綜上，TLR4/TAK1/NF-κB途徑通過增加缺血局部腦皮質(zhì)新生血管形成，從而改善腦缺血對(duì)腦組織的損傷。