基于TGF-β/Smad信號通路研究NF-κB在電針抗慢性疲勞綜合征中的作用及機(jī)制

韓玲 顏志浪 胡美鳳

(1宜春學(xué)院，江西 宜春 336000；2江西中醫(yī)藥大學(xué)科技學(xué)院；3南昌市洪都中醫(yī)院)

慢性疲勞綜合征(CFS)是以極度疲勞為特征的一種證候群，持續(xù)或反復(fù)發(fā)作，且在運(yùn)動后加重，經(jīng)充分休息不能緩解，嚴(yán)重影響人們的學(xué)習(xí)、工作和生活?，F(xiàn)有研究顯示炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激可能與 CFS 的發(fā)病有關(guān)，而核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，有可能參與CFS的發(fā)病過程〔1,2〕。針刺作為傳統(tǒng)的特色醫(yī)療手法，臨床用于治療CFS已顯示出較好的療效，有研究顯示針刺治療CFS的機(jī)制可能是通過抑制腦組織炎性反應(yīng)〔3,4〕。本研究觀察電針干預(yù)對CFS大鼠的改善作用，并基于轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β/Smad信號通路探索其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗動物 36只SPF級健康雄性SD大鼠，體重200～220 g，購自北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK(京)2016-0011。

1.1.2實(shí)驗試劑 褪黑素ELISA試劑盒，美國ADL公司生產(chǎn)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗 TGF-β、Smad、NF-κB p65 抗體，武漢博士德生物科技有限公司生產(chǎn)；多辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G，北京中杉金橋生物科技有限公司生產(chǎn)；電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒，北京索萊寶生物科技有限公司。

1.1.3實(shí)驗儀器 華佗牌一次性針灸針，蘇州醫(yī)療用品有限公司生產(chǎn)，規(guī)格0.3 mm×25 mm；G6805-2電針治療儀，常州市武進(jìn)長城醫(yī)療器械有限公司；EPS300 型電泳儀，上海天能科技有限公司；MT-20水迷宮圖像跟蹤系統(tǒng)，成都泰能科技有限公司生產(chǎn)；TES-1350A 型噪音計，臺灣泰仕公司；PCR 反應(yīng)擴(kuò)增儀，美國 Bio-Rad 公司；Tanon-4200SF型數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。

1.2方法

1.2.1造模 36只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、電針組，模型組、電針組采用力竭游泳加慢性復(fù)合應(yīng)激刺激多重因素制備CFS模型。正式造模前，先將大鼠置于水溫(25±2)℃，深 35 cm 的水池中適應(yīng)性游泳 3 d，每次游泳 20 min，1次/d；適應(yīng)后大鼠尾部負(fù)重體重5%的鉛塊，在水池中游泳至力竭；大鼠負(fù)重游泳后，按照隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行兩種慢性刺激，包括：禁水12 h，禁食12 h，夾尾1 min，通宵照明和噪聲刺激(110 dB，1 h)。

1.2.2電針治療方法 于造模14 d后對大鼠進(jìn)行針刺治療，穴位：雙側(cè)感覺區(qū)、百會穴、寧神穴，用0.35 mm×25 mm毫針快速刺入皮下15 mm，連接電針儀并調(diào)節(jié)為連續(xù)波，每次30 min，1次/d，連續(xù)治療14 d。對照組不給予任何干預(yù)，模型組每天給予電針組相同時間的捆綁，不予治療。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1鼠尾懸掛實(shí)驗 大鼠呈倒掛狀，尾端1 cm處固定于一水平木板上，兩側(cè)用木板隔開動物視線。記錄大鼠在6 min內(nèi)的靜止時間(大鼠完全靜止不動狀態(tài)的總時間)及掙扎次數(shù)(大鼠向上翻轉(zhuǎn)的總次數(shù))。

1.3.2力竭游泳實(shí)驗 將大鼠置入游泳池，水溫(20±1)℃，記錄大鼠從入水至游泳力竭的時間(頭部沉入水中10 s未浮出水面)。

1.3.3水迷宮實(shí)驗 使用水迷宮跟蹤系統(tǒng)，記錄大鼠從入水到爬上平臺所需時間(超過120 s按120 s記錄)、有效區(qū)停留時間。

1.3.4采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血漿褪黑素含量 治療結(jié)束第2天進(jìn)行，腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，從0∶00起每4 h采樣1次(0∶00、4∶00、8∶00、12∶00、16∶00、20∶00)，取股動脈血樣，置于抗凝管中，靜置20 min，離心15 min(4℃，3 000 r/min)，取上清液，按試劑盒說明書采用ELISA進(jìn)行檢測。

1.3.5免疫組化法(IHC)檢測NF-κB p65蛋白表達(dá) 大鼠麻醉，生理鹽水灌注后冰上迅速取出腦海馬組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，二甲苯和梯度乙醇脫蠟，檸檬酸鹽緩沖液修復(fù)，3%過氧化氫(H2O2)浸泡10 min，封閉，加入一抗，4℃孵育過夜，加入二抗，室溫孵育 30 min，加適量二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，蘇木素復(fù)染 1.5～2.0 min，乙醇梯度脫水，二甲苯浸泡，中性樹膠封片，光鏡下觀察結(jié)果，每組重復(fù)測量 3 次。

1.3.6熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)檢測TGF-β1、Smad mRNA表達(dá) 取大腦海馬組織，提取組織總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作。反應(yīng)條件：95℃，45 s，95℃ 15 s，60℃，40 s，進(jìn)行45個循環(huán)。引物序列：TGF-β1正向引物：5′-GGTCACCTGTCCCCTCTCCT-3′，反向：5′-CTGGAGTGTCCATGGGACAG-3′；Smad4正向引物：5′-CAACATCCACCAAGTAATCGC-3′，反向：5′-CTCTCAATAGCTTCTGTCCTG-3′；GAPDH正向引物：5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，反向：5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACCC-3′。每組進(jìn)行3次測定，取平均值，圖像分析儀掃描凝膠密度，采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析。

1.3.7Western印跡檢測TGF-β、Smad蛋白表達(dá) 取大腦海馬組織，加入放射免疫沉淀(RIPA)裂解液，在低溫環(huán)境下進(jìn)行研磨、充分裂解，離心15 min(4℃、12 000 r/min)，取上清液。用 BCA 法進(jìn)行蛋白定量，通過電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂、封閉、剪膜，加入一抗TGF-β、Smad、GAPDH，4℃ 孵育過夜，TBST洗滌，加入二抗，室溫孵育 2 h，TBST 洗滌，用ECL試劑顯色后，化學(xué)發(fā)光儀成像。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1電針對CFS大鼠鼠尾懸掛靜止時間及掙扎次數(shù)、力竭游泳時間影響 與對照組比較，模型組靜止時間明顯延長、掙扎次數(shù)明顯減少，力竭游泳時間明顯縮短(P<0.01)；與模型組比較，電針組靜止時間明顯縮短，掙扎次數(shù)明顯增多，力竭游泳時間明顯延長(P<0.01)。見表1。

表1 電針對CFS大鼠鼠尾懸掛靜止時間及掙扎次數(shù)、力竭游泳時間影響

2.2電針對CFS大鼠水迷宮用時及有效區(qū)停留時間影響 與對照組比較，模型組水迷宮用時明顯延長，有效區(qū)停留時間明顯縮短(P<0.01)；與模型組比較，電針組大鼠水迷宮用時明顯縮短，有效區(qū)停留時間明顯延長(P<0.01)。見表2。

表2 電針對CFS大鼠水迷宮用時及有效區(qū)停留時間影響

2.3電針對CFS大鼠褪黑素含量的影響 與對照組比較，模型組褪黑素含量變化趨勢明顯不同，其中4∶00 褪黑素含量明顯高于對照組，日間含量明顯低于對照組，晝夜波動程度明顯減弱；與模型組比較，電針組褪黑素含量晝夜波動程度增大，變化趨勢與空白組基本一致，下半夜含量降低，4∶00降低明顯，而白天褪黑素含量升高。見表3。

表3 不同時間電針對CFS大鼠褪黑素含量的影響

2.4電針對CFS大鼠海馬區(qū)可見NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，模型組海馬區(qū)NF-κB p65陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量明顯增加，顏色較深(P<0.01)；與模型組比較，電針組海馬區(qū) NF-κB p65陽性細(xì)胞表達(dá)明顯減少，顏色較淺(P<0.01)。見表4。

2.5電針對CFS大鼠海馬區(qū)TGF-β1、Smad4 mRNA及蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，模型組海馬區(qū)TGF-β1、Smad4 mRNA及蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)，與模型組比較，電針組海馬區(qū)TGF-β1、Smad4 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。見表4、圖1。

表4 電針對CFS大鼠蛋白及mRNA表達(dá)的影響

圖1 電針對CFS大鼠TGF-β1、Smad4 蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

頭針作為一種常見的針刺療法，可以調(diào)神益智、醒腦開竅、改善肢體功能，頭針結(jié)合電刺激可以加強(qiáng)刺作用，更有效的改善大腦功能〔5,6〕。鼠尾懸掛實(shí)驗掙扎次數(shù)可反映大鼠的體力狀況，靜止時間可反映大鼠的絕望情緒〔7〕，常用以評價動物的心理抑郁程度。力竭游泳實(shí)驗可以判斷大鼠的體力情況，用以評價動物體力及是否疲勞。水迷宮實(shí)驗是目前最常用于評價動物學(xué)習(xí)和記憶能力的方法。3個實(shí)驗結(jié)合可以全面評價大鼠的軀體和心理疲勞狀態(tài)。本研究說明大鼠出現(xiàn)心理、體力不同程度的疲勞；力竭游泳時間縮短，說明慢性疲勞大鼠出現(xiàn)了體力疲勞癥狀，水迷宮用時延長，有效區(qū)停留時間縮短，說明大鼠出現(xiàn)了學(xué)習(xí)、記憶能力的下降；3個實(shí)驗反映了大鼠體力、學(xué)習(xí)記憶力的下降和情緒反應(yīng)的改變，即“軀體疲勞”和“心理疲勞”狀態(tài)，經(jīng)過電針雙側(cè)感覺區(qū)、百會穴、寧神穴治療后，大鼠鼠尾懸掛實(shí)驗靜止時間縮短，掙扎次數(shù)增加，力竭游泳時間延長，水迷宮平臺潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增加，說明電針可顯著改善CFS大鼠的軀體疲勞和學(xué)習(xí)記憶能力。

褪黑素的晝夜分泌節(jié)律是維持人體睡眠-覺醒節(jié)律的生理基礎(chǔ)，可通過調(diào)節(jié)睡眠狀態(tài)改善認(rèn)知功能，維持正常的神經(jīng)心理狀態(tài)〔8,9〕。褪黑素晝夜分泌節(jié)律異常與CFS睡眠障礙、認(rèn)知功能下降、情緒障礙等臨床表現(xiàn)較為相似，所以臨床常用外源性的褪黑激素治療CFS〔10〕。本研究說明電針可以恢復(fù)CFS大鼠褪黑素的晝夜節(jié)律紊亂，改善大鼠的睡眠障礙。

NF-κB信號通路可在各階段介導(dǎo)炎性反應(yīng)，是機(jī)體炎性反應(yīng)的關(guān)鍵指標(biāo)〔11〕。NF-κB主要以 p50/p65 二聚體形式存在，其中NF-κB p65含轉(zhuǎn)錄活化區(qū)，參與基因轉(zhuǎn)錄的起始調(diào)節(jié)。當(dāng)機(jī)體受到刺激，NF-κB 便移位于細(xì)胞核，并促進(jìn)多種炎癥因子如TNF、IL-1β 及TGF-β1 的釋放〔12,13〕。本研究結(jié)果提示海馬區(qū)炎性改變可能與CFS的發(fā)病相關(guān)，電針治療可降低海馬區(qū)的NF-κB p65蛋白表達(dá)，說明電針治療可以抑制CFS大鼠海馬區(qū)的炎性反應(yīng)。TGF-β 對細(xì)胞具有雙向調(diào)節(jié)作用，同時參與體內(nèi)生理生化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)控，對神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的保護(hù)作用〔14,15〕。有研究表明，腦內(nèi) TGF-β 水平升高可產(chǎn)生疲勞感覺，在 CFS患者的腦脊液中發(fā)現(xiàn)TGF-β 水平的增加，所以推測CFS發(fā)病與TGF-β 水平升高相關(guān)。Smad是TGF-β超家族信號傳導(dǎo)成員，負(fù)責(zé)將TGF-β超家族信號從細(xì)胞內(nèi)傳遞到細(xì)胞核。有研究表明 CFS 海馬中 Smad4呈現(xiàn)高表達(dá)〔16〕，在 TGF-β 當(dāng)作配體的受體復(fù)合物激活下 Smads 進(jìn)入核內(nèi)，共同調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。本研究提示電針對 CFS 模型大鼠治療作用機(jī)制可能與 TGF-β/Smad 信號通路有關(guān)。