喹諾酮類抗菌藥對細(xì)菌性角膜炎模型大鼠的干預(yù)效果及作用機(jī)制

陳果 宋穎輝 王華

(湖南省人民醫(yī)院 1眼視光中心，湖南 長沙 410000;2肝膽外科臨床實驗室)

細(xì)菌性角膜炎主要臨床表現(xiàn)為眼部紅腫、疼痛，視力水平下降，眼瞼流淚、分泌物較多〔1，2〕。常見的誘發(fā)細(xì)菌性角膜炎的致病菌包括細(xì)球菌、假單胞菌、葡萄球菌等，細(xì)菌性角膜炎癥狀具有發(fā)病較急、病情進(jìn)展較快、嚴(yán)重程度較高的特點〔3，4〕。細(xì)菌性角膜炎得不到及時治療可能會發(fā)展為角膜組織穿孔，致使眼球組織萎縮〔5，6〕。近年來，伴隨社會經(jīng)濟(jì)的不斷進(jìn)步，人們生活水平及壓力不斷升高，導(dǎo)致細(xì)菌性角膜炎的發(fā)病率呈現(xiàn)不斷上升趨勢，但目前對其有效的治療方式還是以抗菌治療為主〔7，8〕，本文通過建立細(xì)菌性角膜炎大鼠模型，探討莫西沙星對其具體的干預(yù)效果。

1 材料與方法

1.1材料 選取30只SD健康雄性大鼠，由華蘭生物工程股份有限公司提供，8～10月齡，平均(9.0±0.9)月齡；體重225～238 g，平均(231.8±5.2)g。在相對濕度50%～55%、溫度(23.9±2.5)℃的環(huán)境中喂養(yǎng)1 w，光照12 h/d。

主要試劑：兔抗小鼠toll樣受體(TLR)4抗體(艾美捷科技有限公司)；大鼠核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB p65抗體(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；小鼠抗大鼠白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β抗體(北京匯智和源生物技術(shù)有限公司)；兔抗大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體(上海紐普生物科技有限公司)；小鼠抗兔過氧化氫酶(CAT)抗體(上海博湖生物科技有限公司)；小鼠抗大鼠丙二醛(MDA)抗體〔卡梅德生物科技(天津)有限公司〕；小鼠抗兔氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)抗體(上海瑞番生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1建模及分組 30只大鼠中挑選10只不進(jìn)行處理的大鼠作為正常組。其余20只建立細(xì)菌性角膜炎模型：選擇大鼠左眼作為實驗眼，建模前3 d使用氧氟沙星滴眼預(yù)防感染，3次/d。對大鼠進(jìn)行麻醉處理，使用環(huán)鉆于大鼠左眼角膜顳下方進(jìn)行鉆切，鉆切深度至角膜組織1/3厚度位置，于切痕位置向大鼠角膜淺基質(zhì)層內(nèi)注射100 μl金黃色葡萄球菌，待大鼠直徑2 mm層間水腫、混濁區(qū)域后使用氧氟沙星眼膏涂抹大鼠左眼。將20只細(xì)菌性角膜炎大鼠隨機(jī)分為模型組、藥物干預(yù)組各10只，藥物干預(yù)組大鼠眼結(jié)膜下注射0.05 ml莫西沙星注射液，正常組、模型組大鼠眼結(jié)膜下注射等量蒸餾水，3組大鼠均連續(xù)干預(yù)14 d，觀察效果。

1.2.2角膜潰瘍面積、浸潤深度、中央厚度檢測 使用眼表活體共焦顯微鏡觀察各組大鼠角膜潰瘍面積、角膜浸潤深度，使用超聲角膜厚度測厚儀檢測角膜中央厚度，并進(jìn)行組間比較。

1.2.3標(biāo)本采集、蘇木素-伊紅(HE)染色 所有大鼠干預(yù)結(jié)束后，取各組大鼠尾部靜脈血2 ml,2 000 r/min離心處理15 min后分離上清液，在-80℃環(huán)境中保存待檢。對各組大鼠采用頸椎脫臼法處死后，取各組大鼠角膜組織，固定在4%甲醛中，完全浸泡，于24 h后行常規(guī)石蠟包埋及連續(xù)切片。首先將切片烤干后進(jìn)行脫蠟處理，之后順序置入不同濃度的酒精中各復(fù)水3 min。使用蘇木素染色15 min后清洗3次，使用鹽酸酒精分化處理30 s，充分清洗之后使用1%伊紅染色，使用酒精進(jìn)行脫水處理后進(jìn)行脫蠟處理，封片后使用顯微鏡進(jìn)行觀察，統(tǒng)計角膜炎癥細(xì)胞計數(shù)。

1.2.4角膜炎癥指數(shù)檢測 角膜炎癥指數(shù)評價項目包括病灶面積、病變深度兩項。病灶面積：1分：病灶面積在角膜組織占比<25%；2分：病灶面積在角膜組織占比≥25%且<50%；3分：病灶面積在角膜組織占比≥50%且<75%；4分：病灶面積在角膜組織占比≥75%。病變深度：1分：虹膜、瞳孔清晰，角膜混濁程度較輕；2分：角膜組織較為混濁，通過病灶能夠觀察到虹膜、瞳孔；3分：角膜組織不透明，混濁不均勻；4分：角膜組織混濁致密且均勻。

1.2.5Western印跡檢測TLR4、NF-κB p65相對表達(dá)量 提取50 μg蛋白，凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，取膜，4℃下固定、封閉處理1 h，將一抗使用0.05%～0.10% TBST給予稀釋(TLR4、NF-κB p65一抗為1∶1 000)，4℃孵育過夜保存，之后使用0.05%～0.10% TBST洗膜，3次，每次為5 min，二抗被0.05%～0.10% TBST稀釋(1∶10 000)，搖動孵育時間為1 h，TBST連續(xù)洗膜3次，處理5 min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，定量分析蛋白表達(dá)情況。

1.2.6酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測IL-6、IL-1β、TNF-α水平 將待測血清標(biāo)本置于室溫后，先將血清樣本放置于試管中，并采用稀釋液進(jìn)行稀釋。在反應(yīng)孔內(nèi)將稀釋好的55 μl標(biāo)準(zhǔn)品加入其中，于常溫中進(jìn)行100 min的孵育。使用洗滌液來進(jìn)行洗滌3次，隨后將50 μl的抗體工作液加入至其中，置于恒溫環(huán)境中進(jìn)行60 min的孵育。洗滌后加入120 μl的終止液，最終于450 nm波長出測定吸光度，繪制IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.2.7散射比濁法檢測CAT、MDA、OX-LDL水平 對提取的待測標(biāo)本在凝固的過程中發(fā)生變化的散射光確定檢測，在光探檢測器為90°直角的單色光源中向血清樣本加凝血激活劑，在樣品凝塊的過程中，散射光的強(qiáng)度會慢慢增加，當(dāng)血清樣本完全凝固后，光探測器會發(fā)生變化，會送到檢測器上處理并且描出凝固曲線后檢測CAT、MDA、OX-LDL水平變化。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行F值檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組角膜組織病理學(xué)觀察 如圖1所示，正常組角膜組織上皮細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，無炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象；模型組角膜組織上皮細(xì)胞排列較為雜亂，膠原纖維腫脹，炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象嚴(yán)重；藥物干預(yù)組角膜組織膠原纖維排列較為整齊，炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象明顯減輕。

圖1 各組角膜組織病理學(xué)觀察(HE染色，×200)

2.2各組角膜潰瘍面積、潰瘍浸潤深度、角膜中央厚度對比 如表1所示，與模型組比較，藥物干預(yù)組角膜潰瘍面積、潰瘍浸潤深度、角膜中央厚度降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組角膜潰瘍面積、潰瘍浸潤深度、角膜中央厚度、角膜炎癥指數(shù)、炎癥細(xì)胞密度及TLR4、NF-κB p65相對表達(dá)量對比

2.3各組角膜炎癥指數(shù)、炎癥細(xì)胞密度比較 如表1所示，與正常組比較，模型組、藥物干預(yù)組角膜炎癥指數(shù)、炎癥細(xì)胞密度顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，藥物干預(yù)組角膜炎癥指數(shù)、炎癥細(xì)胞密度降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4各組TLR4、NF-κB p65相對表達(dá)量對比 如表1、圖2所示，與正常組比較，模型組、藥物干預(yù)組TLR4、NF-κB p65相對表達(dá)量升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，藥物干預(yù)組TLR4、NF-κB p65表達(dá)降低，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

圖2 各組TLR4、NF-κB p65表達(dá)

2.5各組IL-6、IL-1β、TNF-α水平比較 如表2所示，與正常組比較，模型組、藥物干預(yù)組IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，藥物干預(yù)組IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組IL-6、IL-1β、TNF-α水平比較

2.6各組CAT、MDA、OX-LDL水平比較 如表3所示，與正常組比較，模型組、藥物干預(yù)組CAT水平降低，MDA、OX-LDL水平升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，藥物干預(yù)組CAT水平升高，MDA、OX-LDL水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組CAT、MDA、OX-LDL水平比較

3 討 論

隨著目前臨床糖皮質(zhì)激素、抗生素等藥物的濫用，克雷白桿菌、葡萄球菌、草綠色鏈球菌等細(xì)菌誘發(fā)的感染與日俱增，引起廣大專家學(xué)者的關(guān)注。近年來，我國細(xì)菌性角膜炎癥狀發(fā)病率一直居高不下，據(jù)不完全統(tǒng)計，我國每年新增細(xì)菌性角膜炎病例數(shù)高達(dá)數(shù)十萬〔9～11〕。臨床常用的治療細(xì)菌性角膜炎的手段為抗菌治療〔12〕。喹諾酮類抗菌藥是臨床常用的抗菌藥物，主要以細(xì)菌DNA為靶點，對革蘭陰性菌具有較強(qiáng)的殺滅作用，莫西沙星為第四代喹諾酮類抗菌藥，具有抗菌譜廣、抗菌能力強(qiáng)的特點〔13～15〕。

細(xì)菌性角膜炎作為一種眼部細(xì)菌感染性疾病，主要表現(xiàn)為角膜組織潰瘍性病變〔16〕。本研究結(jié)果說明，使用莫西沙星進(jìn)行干預(yù)，能夠促進(jìn)大鼠角膜組織潰瘍修復(fù)，改善細(xì)菌性角膜炎大鼠角膜組織厚度。細(xì)菌性角膜炎與角膜組織炎癥反應(yīng)密切相關(guān)〔17〕，本研究結(jié)果顯示，使用喹諾酮類抗菌藥莫西沙星對細(xì)菌性角膜炎大鼠進(jìn)行干預(yù)，大鼠角膜炎癥指數(shù)、炎癥細(xì)胞密度顯著降低，出現(xiàn)這一研究結(jié)果的原因可能是因為使用莫西沙星進(jìn)行干預(yù)調(diào)控炎癥通路。

TLR4/NF-κB信號通路參與機(jī)體炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等病理過程〔18,19〕。本研究結(jié)果說明，使用喹諾酮類抗菌藥莫西沙星進(jìn)行干預(yù)能夠調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路蛋白表達(dá)，減輕下游炎癥因子水平，減輕細(xì)菌性角膜炎大鼠角膜組織炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮干預(yù)效果。

有研究表明，角膜炎癥狀的發(fā)生發(fā)展伴隨著角膜組織氧化應(yīng)激損傷。減輕氧化應(yīng)激損傷是治療角膜炎癥狀嚴(yán)重程度的關(guān)鍵〔20，21〕。CAT、MDA、OX-LDL是臨床較為常用的評價機(jī)體抗氧化能力的指標(biāo)。本研究結(jié)果說明使用喹諾酮類抗菌藥莫西沙星能夠有效緩解氧化應(yīng)激損傷程度，干預(yù)效果較好。

綜上，使用喹諾酮類抗菌藥莫西沙星對細(xì)菌性角膜炎模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，能夠促進(jìn)大鼠角膜組織潰瘍修復(fù)，減輕大鼠角膜組織炎癥反應(yīng)，從而減輕細(xì)菌性角膜炎大鼠角膜組織氧化應(yīng)激損傷，其功能可能與調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路及下游炎癥因子水平有關(guān)。