腫瘤抗原MAGEA4表達(dá)及其長(zhǎng)肽疫苗的免疫活性

賈明璐 王瑞 陳雪平 李玉偉 田會(huì)東 王轍遠(yuǎn)

(漯河市中心醫(yī)院，河南 漯河 462000)

惡性腫瘤是威脅人類健康的主要疾病，其發(fā)病率和死亡率近年來(lái)一直呈上升趨勢(shì)〔1,2〕，在腫瘤治療領(lǐng)域?qū)ふ野踩?、合理、有效的治療手段已成為迫切需要解決的問(wèn)題〔3〕。設(shè)計(jì)有效的腫瘤疫苗主要通過(guò)主動(dòng)免疫來(lái)擴(kuò)大腫瘤特異性T細(xì)胞反應(yīng)，長(zhǎng)期以來(lái)一直被視為腫瘤免疫治療的有效工具〔4〕。黑色素瘤相關(guān)抗原(MAGEA)4是睪癌(CT)抗原，它在多種不同的惡性腫瘤中表達(dá)，但僅在正常成人組織的睪丸生殖細(xì)胞中表達(dá)〔5〕。CT抗原具有高度的免疫原性。通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析我們發(fā)現(xiàn)高表達(dá)MAGEA4對(duì)乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)后較差，所以MAGEA4是一個(gè)潛在的理想抗原〔6,7〕。長(zhǎng)肽疫苗包含多個(gè)能被主要組織相容性復(fù)合體(MHC)-Ⅰ、Ⅱ分子提呈的表位天然肽段〔8〕。其優(yōu)點(diǎn)是長(zhǎng)肽能被專職抗原提呈細(xì)胞樹(shù)突細(xì)胞(DC)有效加工和提呈，能夠有效激起體內(nèi)的免疫反應(yīng)，所以合成的長(zhǎng)肽能夠成為很有潛力的多肽疫苗。本研究旨在設(shè)計(jì)針對(duì)腫瘤抗原MAGEA4的長(zhǎng)肽，體外驗(yàn)證長(zhǎng)肽的免疫原性。

1 材料和方法

1.1材料 人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW620，在實(shí)驗(yàn)室中使用37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)條件保存，常規(guī)培養(yǎng)于10%胎牛血清(FCS)的RPMI1640培養(yǎng)基。外周血單個(gè)核細(xì)胞由醫(yī)院血站健康供者血液分離所得。長(zhǎng)肽由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2方法

1.2.1利用數(shù)據(jù)庫(kù)查詢MAGEA4的表達(dá)情況 分析癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)數(shù)據(jù)，借助于數(shù)據(jù)庫(kù)腫瘤免疫評(píng)估資源(TIMER)〔9〕(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)分析MAGEA4在不同腫瘤患者中的表達(dá)情況及比較腫瘤患者與正常健康病人MAGEA4的表達(dá)差異，利用The Human Protein Atlas〔10〕(https://www.proteinatlas.org)數(shù)據(jù)庫(kù)分析MAGEA4在腫瘤組織中表達(dá)情況。利用The Kaplan Meier plotter(http://kmplot.com/analysis/)分析MAGEA4在不同腫瘤中對(duì)腫瘤患者預(yù)后的影響〔11〕。

1.2.2設(shè)計(jì)包含已知細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)表位的長(zhǎng)肽疫苗 利用免疫表位數(shù)據(jù)庫(kù)(IEDB)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.iedb.org/)〔12〕查詢已經(jīng)鑒定的MHC-Ⅰ類抗原表位，設(shè)計(jì)包含有效抗原表位的長(zhǎng)肽。MAGEA4的氨基酸序列參照 GenBank: NP_001011549.1 所提供的序列。根據(jù)篩選出的CTL表位設(shè)計(jì)MAGEA4抗原來(lái)源的長(zhǎng)肽，分別為: MAGEA4 P102-121、P156-177、P224-239、P280-294。

1.2.3分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs) 加肝素鈉至50 ml離心管，預(yù)防凝血。取外周血20 ml與生理鹽水1∶1混勻；加入室溫淋巴細(xì)胞分離液，離心2 000 r/min，30 min；吸取中間白膜層加入生理鹽水30 ml進(jìn)行清洗，離心后用10%胎牛血清IMDM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，即可獲得單核細(xì)胞。

1.2.4體外誘導(dǎo)肽特異性的CTLs 將分離出的PBMCs進(jìn)行重懸，于1×106個(gè)/ml培養(yǎng)于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h；輕輕洗脫尚未黏附的T細(xì)胞凍存于液氮中，加入IMDM培養(yǎng)基2 ml，并補(bǔ)加粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF，100 ng/ml)、白細(xì)胞介素(IL)-4(50 ng/ml)；每隔1天進(jìn)行半量換液，并補(bǔ)充GM-CSF(100 ng/ml)和IL-4(50 ng/ml)；第5天加入脂多糖(100 ng/ml)以誘導(dǎo)DC成熟。 48 h后收集成熟的DC細(xì)胞〔13〕。 加入長(zhǎng)肽 20 μg/ml，培養(yǎng)4 h；重懸后加入100 μg絲裂霉素C，添加20 μg/ml的長(zhǎng)肽，孵育24 h；用10% FCS重懸IMDM培養(yǎng)基并計(jì)數(shù)2×105個(gè)/ml；取前期復(fù)蘇凍存的T細(xì)胞和誘導(dǎo)成熟的DC細(xì)胞重懸并計(jì)數(shù)2×106個(gè)/ml，共孵育加入24孔板中；在第2天添加人IL-2(50 U/ml)，并且每3天換液并補(bǔ)充人 IL-2。 1 w后將細(xì)胞與負(fù)載肽的DC共孵育，進(jìn)行第2輪刺激。3輪刺激后3 d收集細(xì)胞，用于后續(xù)的活性實(shí)驗(yàn)〔14〕。

1.2.5檢測(cè)細(xì)胞因子的干擾素(IFN)-γ分泌水平 取出酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(ELISPOT)板條。最初，添加200 μl無(wú)血清IMDM培養(yǎng)基進(jìn)行封閉；將前期實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)的CTLs用作效應(yīng)細(xì)胞，并將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×106個(gè)/ml。攝取多肽的成熟DC作為刺激細(xì)胞，孵育18 h；每孔加入200 μl無(wú)菌的去離子水，4℃裂解細(xì)胞10 min；加入200 μl 1×洗滌緩沖液洗滌6次；加入100 μl生物素標(biāo)記的抗體，并在37℃下孵育1 h。 倒出孔中的液體，加入200 μl 1×洗滌緩沖液并洗滌。 孵育后，加入100 μl 3-氨基-9-乙-基咔唑(AEC)顯色溶液，在室溫下于25℃干燥30 min；使用圖像分析儀對(duì)96孔板中每孔的斑點(diǎn)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.6細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 離心收集靶細(xì)胞SW620(MAGEA4+，HLA-0201+)，將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至1×106個(gè)/ml。1 ml細(xì)胞懸浮液加入0.5 μl 5 mmol/L羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)作為致敏靶細(xì)胞。1 ml細(xì)胞懸液中加入0.5 μl 100 μmol/L CFSE作為對(duì)照靶細(xì)胞。將細(xì)胞用5% FCS-磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次，離心去除上清。將效應(yīng)細(xì)胞(前期誘導(dǎo)的CTLs)以5×106個(gè)/ml的濃度重懸，將不同效靶比的效應(yīng)細(xì)胞與致敏靶細(xì)胞混合，靶細(xì)胞數(shù)為2×104個(gè)，4 h后，用含有1% FCS 0.1%疊氮化鈉的PBS處理上述兩種細(xì)胞，使用含有4%多聚甲醛的PBS溶液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。殺傷率=(對(duì)照樣品中致敏靶細(xì)胞的數(shù)量-測(cè)試樣品中致敏靶細(xì)胞的數(shù)量)/對(duì)照樣品中致敏靶細(xì)胞的數(shù)量×100%。

1.2.7胞內(nèi)因子染色法檢測(cè)T細(xì)胞釋放IFN-γ水平 前期誘導(dǎo)的CTLs作為效應(yīng)細(xì)胞，誘導(dǎo)的成熟DC作為刺激細(xì)胞；加入阻斷劑BFA 5 μg/ml到離心管中，孵育4 h，充分混勻。將細(xì)胞重懸于含有1%FBS溶液的PBS中。 加入細(xì)胞表面抗體，并在避光條件下于4℃孵育30 min。 以1 500 r/min離心5 min。 向每個(gè)孔中添加200 μl破膜劑，并在4℃下孵育30 min。 收集上述處理過(guò)的細(xì)胞，加入抗IFN-γ抗體，并在4℃下避光保存30 min。使用PBS重懸后進(jìn)行流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)表位肽誘導(dǎo)的特異性T細(xì)胞亞群產(chǎn)生IFN-γ的比例。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism軟件繪圖，采用SPSS22.0標(biāo)準(zhǔn)版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1MAGEA4 在不同腫瘤之間的表達(dá) MAGEA4在很多惡性腫瘤中均有表達(dá)，尤其是頭頸鱗狀細(xì)胞癌、肺鱗癌和胃癌中的表達(dá)，并且癌與癌旁中表達(dá)是有差異存在的。見(jiàn)圖1。

圖1 MAGEA4在各種癌癥病人中的表達(dá)情況

2.2MAGEA4 在不同腫瘤組織中的表達(dá)情況 利用The Human Protein Atlas(https://www.proteinatlas.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證MAGEA4在腫瘤病理組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MAGEA4高表達(dá)于結(jié)直腸癌、肺癌、皮膚癌、宮頸癌、乳腺癌中。見(jiàn)圖2。

圖2 MAGEA4在不同腫瘤組織中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×50)

2.3ELISPOT結(jié)果顯示IFN-γ的分泌水平 與PBS組〔(8.78±1.88)個(gè)〕相比，P102-121組和P280-294組分泌IFN-γ的T細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)量較多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(112.66±3.51)個(gè)、(169.66±7.82)個(gè)，P<0.05〕。P156-177組、P224-239組分泌IFN-γ的T細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)量〔(37.00±14.36)個(gè)、(26.33±8.62)個(gè)〕與PBS組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 ELISPOT檢測(cè)長(zhǎng)肽在健康志愿者中誘導(dǎo)的CTLs中IFN-γ分泌(AEC顯色)

2.4MAGEA4在不同腫瘤中與預(yù)后的關(guān)系 利用 The Kaplan Meier plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)腫瘤組織樣本的MAGEA4進(jìn)行生存分析。結(jié)果表明，MAGEA4在乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌患者生存率的差異較為明顯，高表達(dá)的MAGEA4患者預(yù)后較差。足以說(shuō)明，MAGEA4是一個(gè)潛在的腫瘤靶點(diǎn)。見(jiàn)圖4。

圖4 MAGEA4基因表達(dá)高、低與腫瘤患者預(yù)后的關(guān)系

2.5胞內(nèi)因子染色法檢測(cè)長(zhǎng)肽體外免疫刺激后細(xì)胞因子的分泌 PBS組、P102-102組、P280-294組IFN-γ比例分別為(0.72±0.09)%、(2.79±0.19)%、(3.05±0.21)%。P102-121和P280-294長(zhǎng)肽疫苗能夠很好地誘導(dǎo)CTL分泌IFN-γ。見(jiàn)圖5。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)長(zhǎng)肽特異性CTLs分泌IFN-γ的能力

2.6細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果 P102-121和P280-294兩條候選肽誘導(dǎo)的CTLs在不同效靶比對(duì)靶細(xì)胞的殺傷情況見(jiàn)表1。結(jié)果顯示：P102-121、P280-294組誘導(dǎo)的CTLs在效靶比為12.5∶1、25∶1、50∶1時(shí)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率均顯著高于PBS組(P<0.05)，且以50∶1效靶比最高。

表1 長(zhǎng)肽誘導(dǎo)的CTLs不同效靶比對(duì)SW620的殺傷率

3 討 論

腫瘤免疫治療提供了免疫系統(tǒng)對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞的特異性和記憶性，不良反應(yīng)較小，治療效果持久。從骨髓移植治療血液性癌癥的成功開(kāi)始，各種腫瘤的單克隆抗體療法的發(fā)展，到針對(duì)免疫檢查點(diǎn)的抗體療法已經(jīng)成為較成功的癌癥治療方法〔15〕。隨著對(duì)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的深入了解及對(duì)免疫細(xì)胞的工程化技術(shù)改進(jìn)，越來(lái)越多的科學(xué)家去關(guān)注和開(kāi)放新的腫瘤疫苗。隨著這些技術(shù)的不斷改進(jìn)，免疫療法將在癌癥治療中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用〔16〕。

多肽疫苗治療的目的是刺激和激活肽特異性T細(xì)胞來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞。T細(xì)胞識(shí)別的腫瘤相關(guān)抗原的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了這一策略的實(shí)施〔17〕。多肽疫苗誘導(dǎo)部分癌癥患者產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但客觀的臨床應(yīng)答率仍然較低。為了提高多肽疫苗治療的效果：①需要在腫瘤細(xì)胞中特異表達(dá)而在正常細(xì)胞中不表達(dá)的腫瘤抗原；②在多肽疫苗治療的早期階段進(jìn)行治療；③應(yīng)調(diào)節(jié)記憶T干細(xì)胞以維持對(duì)多肽疫苗的長(zhǎng)期免疫應(yīng)答〔18〕。已經(jīng)有很多長(zhǎng)肽有較好的效果，黑色素瘤抗原(MELOE-1)的長(zhǎng)肽，包含了一個(gè)人類白細(xì)胞抗原(HLA)-A*0201 表位和多個(gè) HLA classⅡ T 細(xì)胞表位，是很好的黑色素瘤疫苗候選肽〔19〕。Michael Pfreundschuh在癌睪抗原 SSX2 中找到一個(gè)核心優(yōu)勢(shì)表位，既能誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞反應(yīng)和CD4+T細(xì)胞反應(yīng)，也能產(chǎn)生抗體〔20〕。乙型肝炎病毒(HBV)來(lái)源的長(zhǎng)肽能增強(qiáng)慢性乙型肝炎患者體內(nèi)CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。由此表明，長(zhǎng)肽疫苗有望成為腫瘤免疫治療的新策略〔13,21〕。

本研究設(shè)計(jì)了一種基于MAGEA4抗原的長(zhǎng)肽疫苗，該疫苗包含了已經(jīng)鑒定過(guò)的CD8+T細(xì)胞表位。本研究證明P102-121和P280-294有很好的分泌IFN-γ及殺傷靶細(xì)胞的能力。當(dāng)長(zhǎng)肽被樹(shù)突細(xì)胞加工時(shí)，其誘導(dǎo)T細(xì)胞分泌IFN-γ的能力增強(qiáng)。由于其長(zhǎng)度不能直接與抗原結(jié)合槽結(jié)合，因此必須被抗原呈遞細(xì)胞吞噬并加工。樹(shù)突細(xì)胞在抗原加工中更有效。長(zhǎng)肽疫苗具有多個(gè)表位，能誘導(dǎo)多克隆CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。此外，與短肽不同，長(zhǎng)肽疫苗可以包含多個(gè)HLA等位基因的表位。因此，長(zhǎng)肽疫苗適應(yīng)大多數(shù)人群。除CD8+表位外，長(zhǎng)肽疫苗還可以覆蓋多種HLA等位基因的CD4+表位。同時(shí)誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞，有助于產(chǎn)生持久的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)可能有利于放大現(xiàn)有的記憶T細(xì)胞反應(yīng)，這將使免疫反應(yīng)更快，并勝過(guò)幼稚T細(xì)胞的反應(yīng)。在未來(lái)的研究中，可以考慮長(zhǎng)肽和佐劑聯(lián)合使用，以增強(qiáng)長(zhǎng)肽觸發(fā)的免疫反應(yīng)。在腫瘤免疫治療中，聯(lián)合治療經(jīng)常會(huì)在臨床上起到不錯(cuò)的效果，長(zhǎng)肽疫苗的設(shè)計(jì)也可以包含來(lái)源于不同抗原的CD8+和CD4+T細(xì)胞表位，也可以針對(duì)不同的腫瘤設(shè)計(jì)獨(dú)特的長(zhǎng)肽疫苗，這些都是值得思考和探索的。