桃金娘葉乙醇提取物對(duì)小鼠蓖麻油性腹瀉及兔離體空腸平滑肌的影響

文靜 羅凱萍 方瑩瀅 呂遠(yuǎn)霞 周艷梅 李春臣 吳小橋 楊春妮 張建武

(川北醫(yī)學(xué)院 1藥學(xué)院，四川 南充 637100；2醫(yī)學(xué)影像學(xué)院；3臨床醫(yī)學(xué)院)

桃金娘為桃金娘科植物桃金娘Rhodomyrtus tomentosa(Ait)Hassk.的干燥根，其果實(shí)、花、葉均可入藥，具有養(yǎng)血、止血、澀腸、固精之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，桃金娘還具有抗氧化〔1〕、抗菌〔2〕、抗病毒〔3〕、降血糖〔4〕等作用，在醫(yī)藥、保健品和化妝品中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。桃金娘因其收澀之性而具有澀腸固精之功效，臨床可用于治療慢性痢疾〔5〕。然而目前僅有少數(shù)報(bào)道桃金娘為一些藥用食品和組合藥物的藥味之一，可用于治療幼兒腹瀉、病毒性細(xì)菌性感染腹瀉及內(nèi)服治療慢性結(jié)腸炎，并未廣泛應(yīng)用于臨床腹瀉的治療，其對(duì)胃腸道的作用及作用機(jī)制也鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)從離體和在體兩個(gè)方面評(píng)估桃金娘在胃腸道方面的作用，為臨床治療腹瀉提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器

1.1.1試劑 95%乙醇、碳酸氫鈉、氯化鉀、葡萄糖、磷酸二氫鈉、硫酸鎂、無(wú)水氯化鈣、氯化鈉、氯化鐵、氯化鋁、醋酸鉀(成都市科隆化學(xué)品有限公司)，純化水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)，乙酰膽堿(成都化夏化學(xué)試劑有限公司，純度：99%，批號(hào)：2017032301)，維拉帕米(美國(guó) MedChemExpress 生物科技公司，純度：99.97%，批號(hào)：25193)，蓖麻油(河南省華龍藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20180407)，沒(méi)食子酸(中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，批號(hào)：MUST-19032801，純度：99.04%)，乙腈(Northscht，色譜純)，生理鹽水(浙江國(guó)鏡藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H33020482)

臺(tái)氏液制備：將氯化鈉 40 g，氯化鉀 1 g，氯化鈣 1 g，二水合磷酸二氫鈉 0.325 g，一水合葡萄糖 5.5 g，碳酸氫鈉 5 g，七水合硫酸鎂 1.3 g，溶于1 000 ml純化水中，備用。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器 Agilent-1220 高效液相色譜儀(Agilent，美國(guó))，色譜柱(Aglient-ZORBAX SB-C18)，電子分析天平(Mettle AE 240)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，RE-52AA)，真空減壓干燥箱(武漢奧普森試驗(yàn)設(shè)備有限公司，ZK 6050B)，HW-400E恒溫平滑肌槽，BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，F(xiàn)T-100生物張力傳感器(四川成都泰盟公司)，優(yōu)普純水/超純水制造系統(tǒng)(四川優(yōu)普超純科技有限公司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(YDYQ,101-2A)，粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司，F(xiàn)W177)，超聲儀(東莞市柯橋超聲設(shè)備有限公司，KQ-300DE)。

1.1.3藥物的提取 桃金娘葉購(gòu)于廣西玉林市，經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院楊蘭老師鑒定為桃金娘科植物桃金娘Rhodomyrtus tomentosa(Ait)Hassk.的葉。將自然風(fēng)干的桃金娘葉用粉碎機(jī)粉碎成粗粉，精密稱定100 g，置于1 L的圓底燒瓶中，加入10倍量95%乙醇(分析純)，浸泡24 h，然后回流提取3次，每次3 h，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成浸膏，置于真空減壓干燥箱中干燥，得桃金娘葉乙醇提取物(RText)，經(jīng)計(jì)算浸出率為33.26%。提取物置于4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性昆明小鼠(體重18～22 g)和健康大白兔體重(2.0～2.5 kg)均購(gòu)買于川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心〔許可證編號(hào)：SYXK(chuan)2018-076〕。將動(dòng)物置于12 h光照黑暗循環(huán)條件下飼養(yǎng)，且將溫度控制在23～26℃。飼養(yǎng)期間動(dòng)物可以自由獲取食物和水。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循動(dòng)物倫理和實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則。

1.2方法

1.2.1高效液相色譜法鑒定RT ext中的化學(xué)成分

1.2.1.1色譜條件 色譜柱Aglient-ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，采用等度洗脫(流動(dòng)相A為0.1%甲酸，流動(dòng)相B為乙腈，80∶20)，波長(zhǎng)為272 nm，流速為0.4 ml/min，柱溫28℃,進(jìn)樣量為5 μl。

1.2.1.2對(duì)照品溶液制備 精密稱定沒(méi)食子酸對(duì)照品，加甲醇溶解，搖勻，制成每1 ml含0.1 mg的沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液，對(duì)照品溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后置于4℃冰箱冷藏備用。

1.2.1.3供試品溶液制備 精密稱定RT ext 0.02 100 g，加甲醇溶解并定容至1 ml容量瓶中，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.2.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1急性毒性實(shí)驗(yàn)〔6,7〕選取18～22 g健康雄性小鼠36只，隨機(jī)分為6組，每組6只，分別灌胃0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0 g/kg的RT ext給各組小鼠，記錄灌胃后14 d內(nèi)的毒性跡象及死亡情況，小鼠在記錄期間可自由進(jìn)食飲水。以劑量為橫坐標(biāo)，死亡率為縱坐標(biāo)建立劑量反應(yīng)曲線確定其半數(shù)致死量(LD50)。采用單次給藥最大劑量來(lái)評(píng)估RT ext的安全性。

1.2.2.2蓖麻油誘導(dǎo)的腹瀉 本部分實(shí)驗(yàn)參照Guo等〔8〕及Tadesse等〔9〕的實(shí)驗(yàn)方法，先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，小鼠灌胃給予0.5 ml蓖麻油，篩選出表現(xiàn)為腹瀉的小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只。陰性對(duì)照組灌胃生理鹽水(20 ml/kg)，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃維拉帕米(50 mg/kg)，RT ext按照低、中、高濃度灌胃給藥，劑量分別為125、250和500 mg/kg。給藥之后將每只小鼠單獨(dú)放在事先準(zhǔn)備的籠子中，并在籠子下墊吸墨紙，以便觀察小鼠糞便情況。給藥處理30 min后，各組小鼠灌胃給予蓖麻油(20 ml/kg)誘導(dǎo)腹瀉。觀察給予蓖麻油后4 h內(nèi)的固體糞便、半固體糞便、液體糞便的數(shù)量及初始半固體糞便出現(xiàn)的時(shí)間，并用以下公式來(lái)判斷腹瀉程度。

排空指數(shù)=固體糞便數(shù)量×1+半固體糞便數(shù)量×2+液體糞便數(shù)量×3。

1.2.3體外實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1離體標(biāo)本的制備 選用健康家兔，實(shí)驗(yàn)前24 h作禁食(不禁水)處理，用木槌猛擊家兔枕部致死，立即剖開(kāi)腹腔，以幽門與十二指腸交界處為起始部取空腸部分。立即放入通有95% CO2和5% O2混合氣體的臺(tái)式液中，將腸內(nèi)容物清洗干凈并去除腸系膜，剪成1.5～2.0 cm的腸段，放入新鮮配制的臺(tái)氏液中，并于恒溫水浴箱(37℃±0.5℃)中保存，每隔10 min用臺(tái)氏液換洗一次，保持標(biāo)本活性。

1.2.3.2RT ext對(duì)離體空腸平滑肌自主收縮的影響 取一段腸管，一端用線結(jié)扎固定于通氣溝，另一端連接張力換能器。平滑肌槽需保持恒溫(37℃±0.5℃)，平滑肌槽中通入含95% CO2和5% O2的混合氣體，將氣泡速度調(diào)節(jié)為每秒鐘1～2個(gè)，設(shè)置前負(fù)荷為1 g，穩(wěn)定30 min后，依次累加RT ext〔0.01～10.00 mg(生藥)/ml〕，每次加藥時(shí)間間隔為200 s，另設(shè)陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，陰性對(duì)照組間隔3 min加臺(tái)氏液，陽(yáng)性對(duì)照組間隔3 min累計(jì)加入維拉帕米(0.001～10.000 μmol/L)，采用BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄腸管的收縮情況，觀察記錄加藥前后的平均值和最小值。

1.2.3.3RT ext對(duì)乙酰膽堿和氯化鉀誘導(dǎo)的空腸平滑肌的影響 設(shè)備連接同1.2.3.2，待空腸平滑肌標(biāo)本在肌槽中穩(wěn)定30 min后，分別加入乙酰膽堿(10 μmol/L)和氯化鉀(KCl，60 μmol/L)進(jìn)行預(yù)處理，待出現(xiàn)最大波峰后立即用新鮮配制的臺(tái)氏液反復(fù)沖洗直至基線恢復(fù)，之后再次加入同濃度乙酰膽堿和KCl預(yù)孵15 min，采用BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄空腸平滑肌的收縮曲線，然后再分別累加RT ext〔0.01～10.00 mg(生藥)/ml〕和維拉帕米(0.001～3.000 μmol/L)，記錄加藥后平均值和最小值。

1.2.3.4RT ext對(duì)CaCl2誘導(dǎo)的空腸平滑肌的影響 為了進(jìn)一步確定RT ext對(duì)Ca2+內(nèi)流的影響，設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)。首先讓腸管置于臺(tái)氏液中進(jìn)行平衡，待張力穩(wěn)定后用含有乙二胺四乙酸(EDTA)的無(wú)鈣高鉀(60 mmol/L)的溶液替換臺(tái)氏液30 min，以除去組織中的Ca2+。再換用不含EDTA的無(wú)鈣高鉀(60 mmol/L)溶液平衡15 min。然后加入RT ext構(gòu)建CaCl2(3×10-5～3×10-2mol/L)的劑量-效應(yīng)曲線，觀察RT ext不同劑量對(duì)空腸平滑肌收縮率的影響。然后加入維拉帕米(1 μmol/L)，構(gòu)建CaCl2(3×10-5～3×10-2mol/L)的劑量-效應(yīng)曲線，觀察空腸平滑肌收縮率的變化。在沒(méi)有RT ext和維拉帕米存在的情況下3×10-2mol/L CaCl2誘導(dǎo)的收縮被認(rèn)為是100%〔10〕。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析、配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1高效液相色譜法鑒別RT ext中的化學(xué)成分 RT ext中含沒(méi)食子酸。在上述1.2.1.1的色譜條件下，沒(méi)食子酸的分離度良好，空白、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的色譜見(jiàn)圖1。

圖1 空白(A)、標(biāo)準(zhǔn)品(B)、RT ext樣品(C)的HPLC色譜圖(1沒(méi)食子酸)

2.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.2.1急性毒性實(shí)驗(yàn) RT ext 0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0 g/kg灌胃給藥，在14 d觀察期內(nèi)未出現(xiàn)任何死亡或毒性跡象。在最大耐受量實(shí)驗(yàn)中，單次灌胃的RT ext的最高劑量為16 g/kg，而結(jié)果顯示小鼠在觀察期間沒(méi)有出現(xiàn)任何死亡及身體行為的變化，可預(yù)估其LD50值大于16 g/kg。

2.2.2蓖麻油誘導(dǎo)的腹瀉 與陰性對(duì)照組對(duì)比，維拉帕米組與RT低、中、高劑量組小鼠的半固體糞便產(chǎn)生時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.001)；與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性藥維拉帕米組與RT低、中、高劑量組腹瀉指數(shù)顯著均下降(P<0.001，P<0.01)，RT中劑量作用明顯(P<0.05)，RT低劑量有降低趨勢(shì)，但與陰性對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。提示RT ext對(duì)蓖麻油誘導(dǎo)的腹瀉有顯著的抗腹瀉活性，但其作用不及維拉帕米強(qiáng)。

表1 不同濃度RT ext對(duì)蓖麻油誘導(dǎo)小鼠腹瀉模型的初始半固體出現(xiàn)時(shí)間及排空指數(shù)的影響

2.3體外實(shí)驗(yàn)

2.3.1RT ext對(duì)家兔離體空腸平滑肌自主收縮的影響 陰性對(duì)照組單加臺(tái)氏液后空腸平滑肌自主收縮并未受影響(圖2C)，RT ext可抑制兔空腸平滑肌的自主收縮，且呈濃度依賴性(圖2A)，0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00 mg/ml RT平滑肌百分收縮率分別為：(94.50±1.67)%、(90.76±2.41)%、(84.67±4.09)、(76.53±3.52)%、(46.37±3.02)、(27.63±2.74)%、(7.56±2.55)%，其作用與維拉帕米組的效果相似(圖2B)，0.01、0.03、0.30、1.00、3.00、10.00 μmol/L 維拉帕米平滑肌百分收縮率分別為(79.44±5.37)%、(87.44±2.97)%、(82.64±3.32)%、(69.70±2.33)%、(46.39±3.28)%、(21.25±3.35)%、(9.87±2.28)%，表現(xiàn)為平均收縮力下降，其EC50值分別為0.68 g/L 95%(CI：0.61～0.81 g/L，n=6)和0.57 μmol/L(95%CI：0.48～0.66 μmol/L，n=6)。

圖2 不同濃度RT ext(A)、維拉帕米(B)及臺(tái)式液(C)對(duì)兔離體空腸平滑肌自主收縮的影響(橫坐標(biāo)為時(shí)間，間隔200 s，縱坐標(biāo)為平滑肌收縮幅度)

2.3.2RT ext對(duì)Ach和KCl誘導(dǎo)的空腸平滑肌的影響 RT ext能濃度依賴性的抑制由Ach誘導(dǎo)的腸管收縮，EC50為0.43 mg/ml(95%CI：0.35～0.53 mg/ml，n=6)，維拉帕米的EC50為0.39 μmol/L(95%CI：0.344 6～0.435 3 μmol/L，n=6)。此外，RT ext能濃度：依賴性地抑制由KCl誘導(dǎo)的腸管收縮，EC50為0.13 mg/ml(95%CI：0.11～0.17 mg/ml，n=6)，維拉帕米的EC50為0.064 μmol/L(95%CI：0.056～0.070 μmol/L，n=6)。見(jiàn)表2、表3。

表2 不同濃度的維拉帕米對(duì)Ach和KCl預(yù)處理后兔離體空腸平滑肌百分?jǐn)?shù)收縮率的影響

表3 不同濃度的RT ext對(duì)Ach和KCl預(yù)處理后兔離體空腸平滑肌百分收縮率的影響

2.3.3RT ext對(duì)CaCl2誘導(dǎo)空腸平滑肌的收縮的影響 與CaCl2陰性對(duì)照組相比，RT ext 1 mg/ml和維拉帕米0.03 μmol/L可極顯著降低累加CaCl23×10-4～3×10-2mol/L時(shí)平滑肌的收縮率(P<0.001)；RT ext 3.00 mg/ml維拉帕米0.1 μmol/L可顯著降低累加CaCl21×10-4～3×10-2mol/L時(shí)平滑肌的收縮率(P<0.001,P<0.01)。RT ext可抑制CaCl2誘導(dǎo)的兔離體空腸平滑肌的手術(shù)，且呈劑量依賴性，其作用趨勢(shì)和維拉帕米一致。見(jiàn)表4。

表4 CaCl2對(duì)兔離體空腸在無(wú)和有RT ext及維拉帕米情況下平滑肌收縮率的影響

4 討 論

腹瀉是一種常見(jiàn)的消化道疾病，臨床多表現(xiàn)為腸黏膜的分泌旺盛與吸收障礙，胃腸蠕動(dòng)加快，排便次數(shù)增多，糞質(zhì)稀薄如同水樣或含有異常成分等。長(zhǎng)期腹瀉可引起患者腸道正常菌群失調(diào)、營(yíng)養(yǎng)不良、免疫力下降等〔11〕。據(jù)報(bào)道〔12〕，每年全球人群腹瀉發(fā)生率約為5%，嚴(yán)重危害人類健康，目前已成為全球發(fā)展中國(guó)家突出的公共衛(wèi)生問(wèn)題。腹瀉的致病因素較多，可由多種疾病引起，因此給臨床治療帶來(lái)了一定的困難。中醫(yī)藥理論強(qiáng)調(diào)“整體觀念”“辨證論治”，其“異病同治”的理論非常符合腹瀉的治療。中醫(yī)學(xué)根據(jù)腹瀉的便次頻繁、糞質(zhì)稀薄或完谷不化的癥候特點(diǎn)將其歸屬于“泄瀉”的范疇，其病名首見(jiàn)于《內(nèi)經(jīng)》，故中醫(yī)藥治療腹瀉已有非常悠久的歷史。

據(jù)報(bào)道，任何5 g/kg無(wú)毒物質(zhì)都是相對(duì)安全的〔13〕，而本研究的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，口服RT ext至16 g/kg不會(huì)產(chǎn)生任何毒性及死亡跡象，故認(rèn)為RT ext口服安全性良好，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

蓖麻油是從蓖麻的種子中提取而來(lái)，蓖麻油本身并無(wú)致瀉的作用，蓖麻油引起腹瀉的原因主要是其皂化后可生成刺激性較強(qiáng)的蓖麻油酸鈉，可促進(jìn)炎癥介質(zhì)的合成與釋放，引起小腸炎癥，致使腸腔積液，從而引起急性腹瀉。在蓖麻油誘導(dǎo)的小鼠腹瀉實(shí)驗(yàn)中，RT ext 低、中、高劑量均可顯著延長(zhǎng)半固體糞便出現(xiàn)的時(shí)間，表明桃金娘具有抗腹瀉活性。桃金娘的成熟果實(shí)中富含黃酮苷、酚類物質(zhì)；根和樹(shù)皮含有鞣質(zhì)、生物堿等；葉的主要成分為桃金娘油，也富含黃酮苷、水解鞣質(zhì)。已有研究證實(shí)桃金娘鞣質(zhì)可通過(guò)抑制胃腸收縮運(yùn)行或降低腸道蠕動(dòng)、降低腹腔毛細(xì)血管和腸絨毛膜通透性、抑制炎癥介質(zhì)合成釋放等機(jī)制產(chǎn)生抗腹瀉作用〔14〕。也有報(bào)道顯示，桃金娘4種酚類成分具有體外抗豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的藥理活性,鞣花酸、白藜蘆醇、沒(méi)食子酸具有抗豬流行性腹瀉病毒藥物研究和開(kāi)發(fā)價(jià)值〔15〕。而本研究也確定桃金娘中含有沒(méi)食子酸。此外，黃酮類化合物可以抑制自體蛋白和前列腺素的釋放〔16〕。因此推測(cè)，桃金娘的抗腹瀉活性可能與其所含有的鞣質(zhì)、酚類物質(zhì)及黃酮類成分發(fā)揮的抗炎等作用有關(guān)。

本研究經(jīng)結(jié)果顯示，RT ext可以抑制空腸平滑肌的自主收縮，且呈濃度依賴性；RT ext對(duì)乙酰膽堿所致平滑肌收縮有顯著的緩解作用，且呈濃度依賴性。本結(jié)果也進(jìn)一步印證RT ext可以緩解蓖麻油誘導(dǎo)的小鼠腹瀉這一現(xiàn)象。乙酰膽堿是腸神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)〔17〕，能激動(dòng)M膽堿受體，M受體耦聯(lián)G蛋白(GP)，使胞內(nèi)第二信使三磷酸肌醇(IP3)和二?；视?DG)濃度上升，進(jìn)而引起Ca2+釋放和底物蛋白磷酸化激發(fā)平滑肌產(chǎn)生收縮效應(yīng)〔18〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示RT ext能舒張乙酰膽堿誘導(dǎo)的空腸平滑肌收縮，作用趨勢(shì)與陽(yáng)性藥維拉帕米一致，因此推測(cè)RT ext對(duì)空腸平滑肌自主收縮的抑制作用可能與阻斷M受體有關(guān)。

平滑肌的收縮有賴于細(xì)胞質(zhì)中游離鈣的存在，阻斷鈣通道或是Ca2+釋放減少都會(huì)減弱腸平滑肌的收縮。L-型鈣通道是細(xì)胞興奮過(guò)程中調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度保持在正常范圍內(nèi)的主要離子通道〔19〕。高濃度的K+可打開(kāi)電壓依賴性L型鈣通道，允許外Ca2+內(nèi)流，從而促進(jìn)腸平滑肌的收縮〔20,21〕。而如果有物質(zhì)能夠松弛高K+誘導(dǎo)的腸平滑肌收縮則提示該物質(zhì)可能為鈣拮抗劑〔22〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RT ext能松弛氯化鉀誘導(dǎo)的腸平滑肌收縮，RT ext拮抗空腸平滑肌收縮的機(jī)制可能是通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)性方式抑制外鈣內(nèi)流。

綜上所述，RT ext具有顯著抗腹瀉的活性。且RT ext能濃度依賴性抑制離體兔空腸平滑肌的自主收縮，其作用機(jī)制可能與阻斷M受體及L型鈣離子通道有關(guān)。當(dāng)然，RT ext對(duì)胃腸道的其他作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。