線(xiàn)粒體自噬對(duì)術(shù)前睡眠剝奪老齡大鼠術(shù)后認(rèn)知功能的影響

陳勇 姚鵬 詹芬芳 王忠 胡衍輝 余樹(shù)春 徐國(guó)海

(1 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科 江西省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330006；2孝感市中心醫(yī)院)

隨著全球老齡化社會(huì)的到來(lái)以及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，老年人手術(shù)種類(lèi)及數(shù)量日趨增多，伴隨著麻醉技術(shù)、手術(shù)操作及監(jiān)護(hù)儀器等各方面的大大提高，老年患者術(shù)后死亡率已明顯下降，但臨床研究發(fā)現(xiàn)，老年患者術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)的發(fā)生率卻顯著增加。手術(shù)和高齡等是導(dǎo)致POCD的主要影響因素〔1〕，且手術(shù)和高齡均對(duì)睡眠質(zhì)量有重要影響，尤其是老年患者，術(shù)前睡眠剝奪屬于普遍現(xiàn)象，研究表明其可加重認(rèn)知障礙〔2〕，但具體機(jī)制尚不清楚。線(xiàn)粒體自噬是指損傷的線(xiàn)粒體通過(guò)自噬機(jī)制選擇性清除受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)〔3〕，線(xiàn)粒體自噬參與腦缺血再灌注損傷過(guò)程〔4〕，但其對(duì)術(shù)前睡眠剝奪老齡大鼠術(shù)后認(rèn)知功能的影響尚不清楚，本研究擬通過(guò)建立睡眠剝奪老齡大鼠模型，觀察大鼠發(fā)生認(rèn)知障礙時(shí)線(xiàn)粒體自噬的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物選擇及分組 選擇64只SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，20～22月齡，體重550～700 g，將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照(C)組、睡眠剝奪(SD)組、手術(shù)(S)組和睡眠剝奪+手術(shù)(SS)組各16只。SD組和SS組采用改良多平臺(tái)水環(huán)境睡眠剝奪法建立睡眠剝奪模型，S組和SD組行脛骨骨折加髓內(nèi)固定術(shù)。

1.2睡眠剝奪大鼠模型的建立 參照文獻(xiàn)〔5〕介紹的方法：選擇透明水箱(20 cm×30 cm×40 cm)，水箱內(nèi)放10個(gè)圓形平臺(tái)(高5 cm、直徑2 cm)，每?jī)蓚€(gè)平臺(tái)之間距離為5 cm，然后向水箱中注水，使平臺(tái)高出水面1 cm，將大鼠放到平臺(tái)上進(jìn)行連續(xù)72 h的睡眠剝奪，同時(shí)持續(xù)給予日光燈照射。

1.3脛骨骨折加髓內(nèi)固定術(shù) 參照文獻(xiàn)〔6〕介紹的方法在大鼠睡眠剝奪結(jié)束后24 h進(jìn)行。將大鼠麻醉后，對(duì)其右后肢進(jìn)行開(kāi)放性脛骨骨折手術(shù)，同時(shí)行髓內(nèi)固定術(shù)。C組和SD組僅接受與S組相同的麻醉。

1.4條件性恐懼記憶實(shí)驗(yàn) 分別于術(shù)后1、3、7 d(T1～T3)時(shí)采用Fear Condition實(shí)驗(yàn)測(cè)定大鼠認(rèn)知功能。將大鼠放入條件恐懼箱中適應(yīng)環(huán)境3 min，并測(cè)定其“僵立”時(shí)間。24 h后開(kāi)始恐懼訓(xùn)練，將大鼠放入原條件恐懼箱中適應(yīng)2 min，并給予電擊(1 s，45 V)，間歇2 min 后再次給予電擊，共電擊3次，適應(yīng)性訓(xùn)練結(jié)束后將大鼠放在條件恐懼箱內(nèi)停留30 s。適應(yīng)性訓(xùn)練結(jié)束1 h后，將大鼠再次放入恐懼箱內(nèi)，觀察其3 min內(nèi)每一次的“僵立”時(shí)間，同時(shí)計(jì)算條件誘導(dǎo)僵立時(shí)間百分比。

1.5TUNEL檢測(cè) 于術(shù)后第7天行為學(xué)測(cè)定完畢后立即處死取海馬組織，采用TUNEL檢測(cè)海馬神經(jīng)元凋亡情況。海馬組織乙醇脫水，石蠟包埋，切片，常規(guī)脫蠟脫水，3% H2O2室溫避光30 min,枸櫞酸鹽緩沖液洗滌,煮沸15 min,冷卻后漂洗,滴加50 μl TdT酶反應(yīng)液反應(yīng)60 min后；加辣根過(guò)氧化物酶-鏈霉親和素(Streptavidin-HRP)標(biāo)記液，避光30 min。滴加50 μl DAB底物溶液,室溫15 min,漂洗后滴加蘇木素染色1 min,沖洗、脫水、透明、封片。在顯微鏡下觀察，每張切片選取5個(gè)視野，取平均值。

1.6透射電鏡檢測(cè) 采用透射電鏡觀察海馬神經(jīng)元自噬情況。取海馬組織，1%鋨酸固定，常規(guī)脫水、透明，Epon 812包埋，制備厚度50～80 nm超薄切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色。采用透射電鏡進(jìn)行觀察，并拍照記錄。

1.7線(xiàn)粒體膜電位 采用JC-1探針?lè)y(cè)定線(xiàn)粒體膜電位。先使用組織線(xiàn)粒體分離試劑盒獲取線(xiàn)粒體，參照J(rèn)C-1檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)推薦比例稀釋JC-1，配制染色工作液。取稀釋好的JC-1染色工作液，加入純化線(xiàn)粒體。將兩者混勻后，采用激光共聚焦顯微鏡分別測(cè)定紅綠熒光強(qiáng)度，并計(jì)算兩者的比值，用于反映海馬神經(jīng)元線(xiàn)粒體膜電位。

1.8海馬LC3、Beclin1、Parkin及p62蛋白表達(dá)的測(cè)定 采用Western印跡法進(jìn)行檢測(cè)。取大鼠腦海馬組織，加入裂解液和磷酸酶抑制劑勻漿裂解提取胞質(zhì)和線(xiàn)粒體蛋白，測(cè)定蛋白濃度，標(biāo)記后-20℃保存。各取蛋白樣品上樣，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳至指示帶分離，然后轉(zhuǎn)膜，采用5%脫脂牛奶室溫封閉，加入一抗(稀釋度1∶1 000，Abcam公司，美國(guó))及內(nèi)參GAPDH(稀釋度1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜。次日TBST漂洗，然后孵育辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑顯影，Image Lab 拍照分析，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值反映目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.14組術(shù)后條件誘導(dǎo)僵立時(shí)間百分比比較 與C組比較，其余3組術(shù)后條件誘導(dǎo)僵立時(shí)間百分比明顯降低(P<0.05)；與SD組和S組比較，SS組術(shù)后條件誘導(dǎo)僵立時(shí)間百分比明顯降低(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 4組術(shù)后條件誘導(dǎo)僵立時(shí)間百分比比較

2.24組海馬線(xiàn)粒體膜電位、LC3-Ⅱ/LC-3Ⅰ、Beclin1、Parking及p62蛋白表達(dá)比較 C組在熒光濾片上觀察為高紅高綠，染料聚集明顯；與C組比較，S組和SD組表現(xiàn)為中紅高綠，紅色熒光下可見(jiàn)較多染料聚集，提示膜電位下降；與S組和SD組比較，SS組表現(xiàn)為低紅高綠，紅色熒光下僅有極少量染料聚集呈現(xiàn)亮紅色，提示膜電位明顯下降，見(jiàn)表2、圖1。與C組比較，其余3組海馬LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin1及Parkin蛋白表達(dá)明顯增加，p62蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)；與SD組和S組比較，SS組海馬LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin 1及Parkin蛋白表達(dá)明顯增加，p62蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)，見(jiàn)表2。

圖1 4組海馬線(xiàn)粒體膜電位的變化(醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，×200)

表2 4組海馬、線(xiàn)粒體膜電位、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1、Parkin及p62蛋白表達(dá)比較

2.34組海馬神經(jīng)元凋亡情況 C組海馬組織存在少量散在凋亡細(xì)胞；與C組〔(4.2±0.6)%〕比較，其余3組海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)升高(P<0.05)；與SD組〔(26.8±1.8)%〕和S組〔(28.4±1.7)%〕比較，SS組海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)明顯升高〔(38.5±2.6)%，P<0.05〕，見(jiàn)圖2。

圖2 4組海馬神經(jīng)元凋亡情況(TUNEL染色，×100)

2.44組海馬組織超激結(jié)構(gòu)的變化 C組大鼠海馬線(xiàn)粒體分布均勻，線(xiàn)粒體膜完整，線(xiàn)粒體嵴清晰可見(jiàn)，未見(jiàn)明顯損傷的線(xiàn)粒體，無(wú)典型的線(xiàn)粒體自噬結(jié)構(gòu)；S組和SD組可見(jiàn)線(xiàn)粒體腫脹和空泡樣變性，并可見(jiàn)少量的自噬體形成；SS組可見(jiàn)線(xiàn)粒體明顯腫脹，內(nèi)部嵴破壞或消失，且呈現(xiàn)空泡樣結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖3。

圖3 4組海馬組織超微結(jié)構(gòu)的變化(透射電鏡，×2 500)

3 討 論

條件性恐懼記憶實(shí)驗(yàn)主要用于測(cè)定動(dòng)物學(xué)習(xí)、記憶和環(huán)境暗示之間的關(guān)聯(lián)能力。僵立是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物防御行為的一種，也是評(píng)價(jià)嚙齒類(lèi)動(dòng)物恐懼的可靠指標(biāo)〔7〕。僵立持續(xù)的時(shí)間越短，則證明動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力越差，反之，則證明動(dòng)物學(xué)習(xí)能力越強(qiáng)。因老年患者術(shù)前睡眠障礙發(fā)生率較普通患者明顯升高，因此，本研究選擇老齡大鼠作為研究對(duì)象，能夠較好地模擬老年術(shù)前睡眠剝奪現(xiàn)象。本研究結(jié)果提示，大鼠POCD模型制備成功。

本研究結(jié)果提示，術(shù)前睡眠剝奪或手術(shù)均可導(dǎo)致老齡大鼠認(rèn)知功能障礙，且術(shù)前睡眠剝奪可進(jìn)一步加重老齡大鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙。

有研究表明，線(xiàn)粒體自噬在腦缺血再灌注損傷中起著重要作用，并且對(duì)機(jī)體有一定的保護(hù)作用〔8，9〕。透射電鏡是檢測(cè)自噬體的金標(biāo)準(zhǔn)，線(xiàn)粒體是細(xì)胞凋亡的控制中心，跨膜電位的穩(wěn)定也是線(xiàn)粒體功能正常的標(biāo)志，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，可促使線(xiàn)粒體形態(tài)及功能發(fā)生變化，使線(xiàn)粒體膜電位下降或消失〔10〕。此外，LC3及Beclin1也是線(xiàn)粒體自噬的重要參與基因。LC3可分為L(zhǎng)C3-Ⅰ型和LC3-Ⅱ型，正常情況下，主要以LC3-Ⅰ型表達(dá)，當(dāng)發(fā)生自噬時(shí)，LC3-Ⅰ可經(jīng)泛素化形成LC3-Ⅱ，因此LC3也是特異性的自噬診斷指標(biāo)。Beclin1也稱(chēng)BECNl基因，是自噬起始的限速基因，也是自噬的調(diào)節(jié)蛋白，參與了線(xiàn)粒體自噬過(guò)程〔11〕。Parkin 廣泛表達(dá)于各組織和器官，尤以腦、心肌和骨骼肌等高耗能器官中含量豐富,主要介導(dǎo)底物泛素化，調(diào)節(jié)蛋白降解和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，可作為線(xiàn)粒體受損時(shí)的第一道防線(xiàn)〔12〕。p62在線(xiàn)粒體自噬中，發(fā)揮著標(biāo)記作用，同時(shí)也起到聚集受損的蛋白、線(xiàn)粒體及形成自噬小體的作用，且其表達(dá)水平與自噬活性呈反比〔13〕。本研究提示，術(shù)前睡眠剝奪可進(jìn)一步加重老齡大鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制可能與抑制線(xiàn)粒體自噬的過(guò)度激活有關(guān)，但具體通過(guò)哪條信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)及如何抑制線(xiàn)粒體自噬激活尚不清楚，這也是下一步的研究方向。

綜上，術(shù)前睡眠剝奪可進(jìn)一步加重老齡大鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制可能與抑制線(xiàn)粒體自噬的過(guò)度激活有關(guān)。