miR-34a對膀胱尿路上皮癌細胞Beclin1介導的自噬及吉西他濱化療敏感性的影響

楊濤 王剛 孫福振 李守賓 郭留雄 鄧新娜 劉俊江

(河北省人民醫(yī)院 1泌尿外科，河北 石家莊 050000；2腫瘤四科)

膀胱癌的病理類型主要包括膀胱尿路上皮癌、膀胱癌和膀胱鱗狀細胞癌。膀胱尿路上皮癌是膀胱癌最常見的病理類型，以前稱為膀胱移行細胞癌，占膀胱癌患者總數(shù)的90%以上〔1〕，其特點為發(fā)展迅速、復發(fā)率高，患者5年生存率僅為6%且預后極差〔2〕。微小RNA(miRNA)是一類長度為20～25 nt，具有基因調(diào)控功能的小分子非編碼RNA，其中，過表達miR-34a可提高胃癌對抗癌藥物的敏感性〔3〕。而過表達miR-34a還能夠抑制癌細胞生長，前人研究發(fā)現(xiàn)，降低miR-34a表達水平可以促進膀胱癌細胞的增殖〔4〕。自噬是一個吞噬自身細胞質(zhì)蛋白或細胞器并使其包被進入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物的過程，在機體生理和病理過程中常見〔5〕，其發(fā)揮的正負面作用尚不完全清楚。但是，有研究發(fā)現(xiàn)，自噬是耐化療的重要機制，可幫助腫瘤細胞克服紫杉醇等化療藥物引起的代謝應激，保護腫瘤細胞存活并產(chǎn)生耐藥〔6〕。而腫瘤抑制因子可以通過抑制自噬，提高膀胱癌細胞對吉西他濱的化療敏感性〔7〕。但是，目前miR-34a對膀胱尿路上皮癌細胞J82中Beclin1介導的自噬及吉西他濱化療敏感性的影響尚未見報道。本研究通過使用前期構(gòu)建的J82耐吉西他濱細胞株(J82/Gem)，并轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物，研究過表達miR-34a對J82/Gem自噬及化療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株和藥物 膀胱尿路上皮癌細胞株J82購自美國Sciencell公司；吉西他濱(規(guī)格：0.2 g×8瓶)購自江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司。

1.1.2主要試劑及儀器 含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Giboc公司；RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；細胞自噬染色檢測試劑盒〔單丹磺酰尸胺(MDC)染色法〕購自索萊寶生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Genecopoeia公司；miR-34a NC(miR-34a陰性對照)、miR-34a模擬物(miR-34a mimics)及miR-34a和U6引物均由上海生工生物工程有限公司合成；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜、十二烷基硫酸鈉(SDS)和β-actin鼠抗均購自美國Sigma公司；蛋白提取試劑盒、電化學發(fā)光(ECL)顯色試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒均購自北京中杉金橋生物科技有限公司；CCK-8細胞活性檢測試劑盒、Beclin1、微管相關蛋白輕鏈(LC)3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62鼠抗和辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG二抗均購自美國Abcam公司；酶標儀Fax-20100購自美國INStat公司；尼康SMZ745光學顯微鏡購自上海普赫生物科技有限公司；FACSCanto流式細胞儀購自美國Beckman公司；TL988 qRT-PCR儀購自西安天隆科技有限公司；全能型凝膠成像分析系統(tǒng)ChemiDoc-MP購自山東三瑞科技有限公司；轉(zhuǎn)膜儀和電泳儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.2細胞培養(yǎng)與分組 J82細胞使用含有10% FBS DMEM/F12培養(yǎng)基，在37℃含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本研究前期通過吉西他濱誘導建立J82/Gem細胞系(J82耐吉西他濱細胞系)，為維持耐藥表型，用0.5 μg/ml的吉西他濱培養(yǎng)J82/Gem細胞。并將J82/Gem細胞分別轉(zhuǎn)染miR-34a NC(miR-34a NC組)和miR-34a mimics(miR-34a mimics組)，轉(zhuǎn)染24 h，另取未轉(zhuǎn)染J82/Gem細胞(J82/Gem組)和J82細胞(J82組)，均使用含0.5 μg/ml的吉西他濱培養(yǎng)24 h后，檢測其增殖、凋亡和自噬。

1.3qRT-PCR檢測各組細胞中miR-34a表達水平 采用RNA抽提試劑盒提取各組細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA置于-20℃冰箱保存待用。采用qRT-PCR法擴增miR-34a目的片段。反應體系和反應條件參照qRT-PCR試劑盒說明書。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt計算細胞中miR-34a相對表達水平。miR-34a及其內(nèi)參U6引物序列：miR-34a：上游5′-CAACAGAAGGCTCGAGCCTCCTGCATCCTTTCTTTC-3′、下游5′-ATTCTGATCAGGATCCTGGAGCTCACTTTC-CCAG-3′；U6:上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.4CCK-8法檢測各組細胞增殖活性及吉西他濱敏感性 收集培養(yǎng)24 h后的各組細胞，每孔100 μl接種至96孔板中，加入濃度為10%的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，于酶標儀上測定各孔在450 nm波長下的OD值，OD值越大表明其增殖活性越高。

取對數(shù)生長期的各組細胞，調(diào)整細胞濃度為5×104個/ml，每孔100 μl接種至96孔板中，置于37℃，含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h至細胞貼壁生長，分別加入終濃度為0.1，0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 μg/ml的吉西他濱處理24 h后，檢測細胞增殖活性，然后根據(jù)劑量-反應曲線計算吉西他濱的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.5流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率 收集培養(yǎng)24 h后的各組細胞，1 200 r/min離心5 min，棄培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入400 μl結(jié)合緩沖液懸浮細胞，再加入5 μl膜聯(lián)蛋白(Annexin)V染液，輕輕混勻后于2～8℃避光條件下孵育15 min；然后加入10 μl碘化丙啶(PI)輕輕混勻，于2～8℃避光繼續(xù)孵育5 min后，上流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.6MDC染色觀察各組細胞自噬小體 收集培養(yǎng)24 h后的各組細胞，使用PBS洗滌2遍，取1 ml PBS重懸細胞，加入1 μl濃度為50 mmol/L的MDC工作液，使MDC終濃度為0.05 mmol/L，37℃避光孵育30 min后，PBS再次洗滌3遍，吸取微量少量細胞懸液與載玻片上，蓋上蓋玻片，使用熒光顯微鏡觀察各組細胞自噬小體，并計算MDC陽性細胞率。

1.7Western印跡檢測各組細胞中自噬相關蛋白表達水平 收集培養(yǎng)24 h后的各組細胞，使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量，然后依次進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、轉(zhuǎn)PVDF膜、5%脫脂奶粉封閉、1∶2 000濃度稀釋后的Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、β-actin鼠抗4℃過夜孵育、含辣根過氧化物酶綴合的二抗(1∶5 000)中室溫孵育2 h，用ECL顯色試劑盒顯色，以β-actin內(nèi)參，全能型凝膠成像分析系統(tǒng)分析蛋白表達水平。

1.8統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1過表達miR-34a對J82/Gem細胞增殖活性及吉西他濱IC50值的影響 與J82組相比，J82/Gem組和miR-34a NC組細胞miR-34a表達水平降低，增殖活性和吉西他濱IC50值升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；與miR-34a NC組相比，miR-34a mimics組細胞miR-34a表達水平升高，增殖活性和吉西他濱IC50值降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 各組細胞miR-34a表達水平、增殖活性及吉西他濱IC50值比較

2.2過表達miR-34a對J82/Gem細胞凋亡率影響 與J82組〔(72.33±7.48)%〕相比，J82/Gem組和miR-34a NC組細胞凋亡率降低，差異具有統(tǒng)計學意義〔(14.58±1.83)%、(12.27±1.45)%，P<0.05〕；與miR-34a NC組相比，miR-34a mimics組細胞凋亡率升高，差異具有統(tǒng)計學意義〔(76.08±7.96)%,P<0.05〕。見圖1。

圖1 各組細胞凋亡

2.3過表達miR-34a對J82/Gem細胞自噬率的影響 與J82組〔(19.23±2.14)%〕相比，J82/Gem組和miR-34a NC組細胞自噬率升高，差異具有統(tǒng)計學意義〔(56.37±5.89)%、(58.65±5.90)%，P<0.05〕；與miR-34a NC組相比，miR-34a mimics組細胞自噬率降低，差異具有統(tǒng)計學意義〔(16.24±5.90)%,P<0.05〕。見圖2。

箭頭所示為MDC染色陽性細胞圖2 各組細胞自噬小體熒光顯微鏡觀察(×400)

2.4過表達miR-34a對各組細胞自噬相關蛋白表達水平的影響 與J82組相比，J82/Gem組和miR-34a NC組細胞Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表達水平升高，p62蛋白表達水平降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；與miR-34a NC組相比，miR-34a mimics組細胞Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表達水平降低，p62蛋白表達水平升高，差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表2、圖3。

表2 各組細胞中Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和P62蛋白表達水平比較

圖3 Western印跡檢測各組細胞自噬相關蛋白表達

3 討 論

膀胱尿路上皮癌是我國發(fā)病率最高的泌尿系統(tǒng)腫瘤，其生物學行為復雜，進展快，易復發(fā)，化療是常規(guī)手術后治療局部疾病的有效方法，然而患者易對化療藥物產(chǎn)生抵抗，是臨床治療失敗的主要原因〔8〕。吉西他濱是臨床上聯(lián)合順鉑化療膀胱癌的主要藥物，癌細胞對吉西他濱耐受性的出現(xiàn)，嚴重影響其治療效果〔9〕，所以，提高膀胱尿路上皮癌細胞對吉西他濱的敏感性是當下研究的熱點。本研究結(jié)果提示，J82對吉西他濱化療敏感性的作用機制與miR-34a密切相關，但尚需進一步研究。

自噬是一個嚴格調(diào)控的分解代謝過程，抑制自噬可能使腫瘤細胞對常見藥物敏感，或克服這些細胞對化療藥物的耐藥性〔10〕。Zeng等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)抑制自噬使可膀胱尿路上皮細胞癌對紫杉醇敏感，Sun等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)抑制自噬可增強非小細胞肺癌的化療敏感性。但是，關于自噬與細胞及疾病關系一直是爭論的焦點，細胞自噬是把雙刃劍，細胞既可通過提高自噬減少細胞壞死，減輕有毒物質(zhì)的積累，又可通過主動降低自身自噬活性，減少因自噬引起的細胞死亡〔13〕。而自噬蛋白Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ表達水平可反映自噬程度，自噬溶酶體降解底物p62表達的增加與自噬水平呈反相關〔14〕。本研究結(jié)果表明，J82/Gem細胞中自噬水平較高，提示抑制J82/Gem細胞中自噬可能提高其化療敏感性。

miR-34a不但參與癌癥發(fā)病機制的多種細胞和分子途徑，在腫瘤發(fā)生和化療耐藥中發(fā)揮重要作用〔15〕，而且還在癌癥干細胞參與的人尿路上皮性膀胱癌耐藥和復發(fā)過程中發(fā)揮關鍵作用〔16〕。Zhang等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)miR-34a在體內(nèi)外均可增加結(jié)直腸癌細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性。Li等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)miR-34a通過上調(diào)相關信號通路信號，提高體外骨肉瘤細胞對順鉑的敏感性。Liu等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)miR-34a通過靶向HMGB1基因，在急性髓系白血病細胞中促進細胞凋亡和抑制自噬。本研究結(jié)果表明，過表達miR-34a可抑制J82/Gem細胞自噬及自噬相關蛋白表達，提高J82/Gem細胞對吉西他濱的敏感性。有研究指出，miR-34a可通過抑制自噬，降低結(jié)腸癌細胞對奧沙利鉑的耐藥性〔20〕。提示miR-34a可能通過抑制自噬，提高J82/Gem細胞對吉西他濱的敏感性。

綜上，miR-34a可能通過抑制Beclin1介導的自噬，提高膀胱尿路上皮癌細胞對吉西他濱的化療敏感性，但其中的機制較為復雜，尚需深入研究。