LKB1/AMPK通路在糖尿病肥胖大鼠心肌損傷中的作用

李小鸞 王葉 李永桂 張玲明 楊歷新

(青海省人民醫(yī)院內分泌科，青海 西寧 810000)

糖尿病(DM)是一種以高血糖、高脂血癥、胰島素抵抗為主要表現(xiàn)的代謝綜合征。近年來發(fā)病率逐漸上升，給患者和家庭帶來沉重的負擔〔1〕。我國DM發(fā)病以2型DM(T2DM)為主〔2〕，隨著物質生活水平的極大提高，肥胖和超重人口不斷增多，世界衛(wèi)生組織《糖尿病全球報告》指出，超重或肥胖是T2DM的最強危險因素〔3,4〕。研究發(fā)現(xiàn)，機體長期處于高糖刺激下可引起糖脂代謝紊亂、氧化及炎癥反應活化、心肌細胞肥大、纖維化，導致心血管疾病發(fā)生風險增加〔5〕。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)可以激活葡萄糖、脂肪酸相關能量代謝通路，而肝激酶(LK)B1作為AMPK的上游激酶，可以直接磷酸化AMPKα參與糖脂代謝〔6〕。目前已有研究發(fā)現(xiàn)通過調控LKB1/AMPK通路可以分別在肥胖〔7〕、DM〔8〕模型大鼠中改善糖脂代謝紊亂，降低氧化應激及炎癥反應。但是尚無文獻報道LKB1/AMPK通路在DM肥胖大鼠心肌損傷中的作用。本研究通過建立DM肥胖大鼠復合模型，探究LKB1/AMPK通路在DM肥胖大鼠心肌損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級SD雄性大鼠60只，體重(170±10)g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號:SCXK(京)2016-0011。動物均嚴格按照動物飼養(yǎng)規(guī)則喂養(yǎng)，溫度為24℃，濕度為50%，12 h明暗交替，自由飲水和攝食。

1.2主要試劑及儀器 鏈脲佐菌素(STZ,Sigma公司,S8050)；5-氨基咪唑-4-羧基酰胺核糖核苷(AICAR,CST,9944P)；大鼠三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CKMB)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、空腹胰島素(FINS)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為A110-1、A111-1、A032-1、E006-1、A056-1、A001-3、A003-1、H203-1)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑、放射免疫沉淀(RIPA)裂解液和二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(碧云天生物科技公司，批號分別為C0105、P0013B、P0012S)；Masson試劑盒(北京索萊寶生物技術有限公司，G1345)；兔抗p-AMPKα(Thr172，bs-4002R)、兔抗AMPKα(bs-2771R)、兔抗p-LKB1(bs-3249R)、兔抗LKB1(bs-3948R)、兔抗p-乙酰輔酶A羧化酶(ACC，bs-3039R)、兔抗ACC(bs-11912R)、兔抗GAPDH(bs-0755R)、羊抗兔IgG(H+L)/HRP(bs-40295G)，購自北京博奧森生物科技有限公司；多功能酶標儀(iMark680，Bio-Rad公司)、熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；Accu-Chek Active型羅氏活力血糖儀(羅氏血糖健康醫(yī)護公司)；超高分辨率小動物彩色多普勒超聲實時影像系統(tǒng)(Vevo 2100,加拿大VisualSonics公司)。

1.3動物模型復制及分組 大鼠適應性喂養(yǎng)1 w后，隨機挑選15只為空白組，采用標準飼料喂養(yǎng)；其余45只大鼠以高脂高糖飼料喂養(yǎng)加STZ注射的方法復制DM肥胖模型〔9〕(飼料配方為：64.75%基礎飼料+10%豬油+20%白砂糖+5%蛋白粉+0.05%維生素+0.2%礦物質)，喂養(yǎng)4 w后，按照體重高于空白組體重的10%為標準〔10〕，篩選出肥胖大鼠。將篩選出的肥胖大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素55 mg/kg(注射前大鼠禁食20 h)，3 d后尾尖處取血檢測空腹血糖，若血糖含量>16.7 mmol/L，且大鼠出現(xiàn)多食多飲多尿的表現(xiàn)，提示DM肥胖大鼠模型構建成功；共篩選出30只模型成功大鼠，平均體重(445.63±35.26)g，平均空腹血糖(FPG，25.24±1.48)mmol/L用于后續(xù)實驗。

將30只模型復制成功大鼠分為模型組和AMPK激活劑組，每組15只。AMPK激活劑組腹腔注射AICAR，劑量為100 mg/(kg·d)〔11〕，空白組和模型組腹腔注射等體積滅菌后的生理鹽水，連續(xù)5 d。5 d后進行取材和相關指標的檢測。

1.4取材及處理

1.4.1大鼠體重變化及Lee指數(shù) 實驗期間每周稱大鼠體質量并記錄，稱重前大鼠禁食過夜，末次稱重后經2%戊巴比妥鈉(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，測體長(鼻尖至肛門的距離)，計算Lee指數(shù)。

1.4.2左心室功能檢測 末次注射AICAR 2 h后，大鼠麻醉后，采用超高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)測量大鼠左心室收縮末期內徑(LVESD)、左心室舒張末期內徑(LVEDD)、射血分數(shù)(EF)，短軸縮短率(FS)。

1.4.3血糖、FINS水平測定 末次注射AICAR 2 h后，采集尾末梢毛細血管全血(取血前禁食8 h)，血糖儀檢測FPG水平，腹主動脈取血，離心分離血清，檢測大鼠FINS、HbA1c水平，計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。HOMA-IR=(FPG×FINS)/22.5。

1.4.4血清TC、TG、MDA、SOD、CKMB、CK水平 生化法檢測血清TC、TG、MDA及SOD活性，CKMB、CK水平，根據(jù)試劑盒說明書的操作方法測定。

1.4.5心肌HE染色、Masson染色 取血后，取出大鼠完整心臟，切取相同部位的心臟組織，4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，連續(xù)切3 μm薄片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫苯1 min，蒸餾水沖洗。常規(guī)HE、Masson染色，高倍光鏡下觀察心臟組織形態(tài)變化。

1.4.6Western印跡檢測心肌組織中相關蛋白的表達 采用Western印跡對LKB1、AMPKα、p-AMPKα(Thr172)、ACC及p-ACC蛋白表達進行測定。20 μg總蛋白配制成上樣體系，100℃煮沸5 min。將樣品加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中，濃縮膠90 V，分離膠120 V，恒壓電泳。采用濕式轉膜法將蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后,加入相應的一抗(LKB1、AMPKα、p-AMPKα、ACC及p-ACC,按1∶1 000的比例稀釋；GAPDH,1∶2 000稀釋)，4℃孵育過夜。TBST清洗后，加入適當濃度的二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h。ECL發(fā)光液A、B等量混合后滴加到膜上顯色。采用目的蛋白條帶與相應GAPDH的光密度值的比值作為其蛋白的表達量。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1大鼠體重變化及Lee指數(shù) 造模前大鼠體重各組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，造模后，與空白組相比，模型組和AMPK激活劑組大鼠體重顯著增加(P<0.05)；腹腔注射AICAR 5 d后，與空白組比較，模型組和AMPK激活劑組大鼠體重、Lee指數(shù)顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，AMPK激活劑組大鼠體重、Lee指數(shù)均有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 DM肥胖模型大鼠體重變化

2.23組左心室功能相關參數(shù) 與空白組相比，模型組和AMPK激活劑組LVESD、LVEDD顯著增大，EF、FS顯著下降(P<0.05)；與模型組相比，AMPK激活劑組LVESD、LVEDD明顯下降，EF、FS明顯升高(P<0.05)。見表2。

2.33組血糖、FINS水平 與空白組相比，模型組和AMPK激活劑組FPG、FINS、HOMA-IR、HbA1c明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，AMPK激活劑組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR、HbA1c明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 3組心功能、血糖及胰島素水平比較

2.43組血清TC、TG、CKMB、CK水平 與空白組相比，模型組和AMPK激活劑組血清TG、TC、CKMB、CK水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，AMPK激活劑組血清TG、TC、CKMB、CK水平明顯降低(P<0.05)。見表3。

2.53組血清MDA和SOD水平 與空白組相比，模型組和AMPK激活劑組MDA含量明顯增多，SOD含量明顯減少(P<0.05)；與模型組相比，AMPK激活劑組MDA含量明顯減少，SOD含量明顯增多(P<0.05)。見表3。

表3 3組血清TC、TG、HbA1c、CKMB、CK、MDA及SOD水平比較

2.63組心肌HE染色、Masson染色 空白組的心肌細胞形態(tài)規(guī)則、排列整齊、肌纖維完整，未見心肌細胞水腫、壞死；與空白組相比，模型組心肌細胞形態(tài)不規(guī)則、排列紊亂、局部肌纖維橫紋消失，可見心肌細胞水腫，纖維增生明顯，少量心肌細胞變性、壞死；與模型組相比，AMPK激活劑組心肌細胞水腫減輕，心肌纖維排列較為整齊，心肌纖維增生情況明顯好轉。見圖1。

圖1 3組心臟組織形態(tài)學改變(×400)

2.7Western印跡檢測心肌組織中LKB1/AMPKα通路相關蛋白的表達 與空白組相比，模型組和AMPK激活劑組心肌組織p-LKB1/LKB1、p-AMPKα/AMPKα、p-ACC蛋白表達顯著降低，ACC蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，AMPK激活劑組p-LKB1/LKB1、p-AMPKα/AMPKα、p-ACC蛋白的表達明顯升高，ACC蛋白表達明顯降低(P<0.05)。見表4、圖2。

表4 3組心肌組織中LKB1、AMPKα相關蛋白的表達

圖2 3組心肌組織中LKB1、AMPK相關蛋白表達

3 討 論

據(jù)報道，肥胖人群患DM的概率是普通人群的2～3倍〔12〕，而且DM肥胖患者常伴有血脂代謝異常、胰島素抵抗、糖耐量異常等，可引起心肌細胞損傷，增加心血管病變的風險，嚴重危害人民的健康和生命〔13〕。而目前關于DM肥胖引起心肌損傷的機制尚不明確，臨床缺乏有效的治療方法和藥物。

動物模型的構建是研究的基礎，目前關于DM肥胖動物模型的制備尚無明確的方法。肥胖動物模型的制備常選用高脂膳食喂養(yǎng)，而DM動物的制備方法較多，STZ誘導是較理想的方法。常用的有STZ一次性大劑量注射、STZ多次小劑量注射、STZ加高脂飲食誘導；給藥途徑有皮下、尾靜脈、舌下靜脈、腹腔，文獻報道也不一?？紤]到多次小劑量注射誤差較大，而且會增加動物感染的風險，靜脈注射不易操作，易損耗藥物；故本研究參照文獻〔9,14,15〕選擇高脂高糖飲食喂養(yǎng)4 w后，輔以STZ腹腔注射構建DM肥胖大鼠模型。結果提示DM肥胖模型大鼠心腔擴大，心臟泵血量顯著降低，不能滿足機體的需要，心臟泵血功能衰竭。CK、CKMB是特異性心肌酶，被廣泛認為是心肌損傷的重要標志物，其升高程度與心肌損傷程度密切相關。本研究結果提示，DM肥胖大鼠出現(xiàn)嚴重的心肌損傷。

AMPK是脂代謝的關鍵激酶，活化的AMPK可以使其下游蛋白ACC磷酸化，抑制ACC的活性，抑制脂肪、TC、TG的合成，改善糖脂代謝〔16〕。LKB1是AMPK上游激酶，可以在多種細胞內使AMPKα亞單位上的蘇氨酸172位磷酸化，從而激活AMPK，減少機體膽固醇和脂肪酸的生成，減輕脂肪酸誘導的氧化應激損傷〔17〕，進而調節(jié)機體的代謝及細胞增殖等〔18〕。高血糖是DM心肌損傷的獨立危險因素，當心肌細胞長期處于高血糖狀態(tài)下，可誘導活性氧的產生〔19〕，升高MDA水平，降低谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)活性，下調SOD蛋白和mRNA表達，誘導心肌細胞凋亡〔20,21〕。郭先中等〔22〕研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以激活LKB1/AMPK信號通路，降低TC、TG、MDA、TNF-α、IL-6水平和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3蛋白表達，升高SOD水平，改善大鼠糖脂代謝，降低氧化應激和炎癥反應，保護DM心肌病模型大鼠的心肌損傷；Hu等〔23〕發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以通過激活LKB1-AMPK信號通路來抑制鏈脲佐菌素引起的高血糖癥引起的氧化應激反應，改善DM小鼠的內皮功能障礙。AICAR是一種腺苷類似物，能夠模擬AMP功能，特異性激活AMPK〔24〕。本研究結果提示，DM肥胖模型大鼠出現(xiàn)脂代謝紊亂和氧化應激反應。DM肥胖大鼠存在LKB1/AMPK信號通路受到抑制的現(xiàn)象，出現(xiàn)糖脂代謝紊亂和氧化應激反應，心肌細胞嚴重受損；激活LKB1/AMPK信號通路可改善糖脂代謝紊亂和氧化應激反應，對DM肥胖大鼠心肌損傷具有保護作用。