基于網(wǎng)絡藥理學的淫羊藿治療糖尿病心肌病的機制研究

梁金花，林俊顏，李春河，羅苑苑，陳日墾，鄭珍珍

1.廣東醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院內分泌科，廣東 湛江 524000；

2.國家呼吸醫(yī)學中心、呼吸疾病國家重點實驗室、廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科、廣州呼吸健康研究院，廣東 廣州 510120；

3.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣東 廣州 510120；

4.廣東醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院呼吸科，廣東 湛江 524000

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)主要由糖尿病(diabetesmellitus，DM)引起，DM長期影響導致心臟初始舒張功能和晚期收縮功能障礙，與高血壓和冠狀動脈疾病無關[1]。DM是一個主要的全球健康問題，估計全世界有3.66億人受到影響[2]，并且會導致心力衰竭(HF)的發(fā)生，事實上，高血糖、高脂血癥和胰島素信號傳導中斷可能與DCM的發(fā)展相一致。DCM包括一系列心臟異常，包括心臟肥大、心肌纖維化、糖尿病微血管病、舒張和收縮性心臟功能障礙[3]。心肌細胞內脂肪酸代謝升高、脂質沉積和葡萄糖代謝受抑制是DCM的主要病理特征[4]。DCM患者胰島素抵抗會導致代謝紊亂，從而上調與游離脂肪酸攝取和氧化相關的蛋白質表達。增加的脂肪酸β-氧化產(chǎn)生過量的活性氧(ROS)并導致心臟氧化應激，長期氧化應激促進心臟纖維化、心肌細胞肥大和心功能不全，從而加劇DCM的發(fā)展[5-6]。

淫羊藿[Epimedium(yinyanghuo)]別稱仙靈脾，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其化學成分包括4大類，分別為生物堿、木脂素、多糖以及黃酮、多糖與黃酮類化合物的生物活性相對較強，是傳統(tǒng)的溫腎壯陽中藥，具有補腎壯陽、祛風濕、強筋骨等功效，用于治療高血壓、冠心病、骨質疏松、更年期綜合征、陽痿、半身不遂、四肢麻木等，淫羊藿還常與其他中藥聯(lián)合用于治療DM及其并發(fā)癥[7-8]。近年來，為了充分發(fā)揮淫羊藿的作用，醫(yī)學領域對其進行了大量的研究，并在有關研究不斷推進的過程中取得了諸多研究成果[9-11]。國內學者研究顯示淫羊藿總黃酮可能通過降低血糖、抗氧化等途徑對DM小鼠血管內皮損傷起到保護作用[12]。其中淫羊藿苷(Icariin)是一種從淫羊藿中分離出來的黃酮類化合物，是淫羊藿中的主要活性成分[13]。有研究揭示了Icariin對各種疾病狀況的治療作用，包括心血管疾病[14-16]和DM誘發(fā)的疾病[17]。Icariin通過多種途徑如抗氧化、抗炎和脂質調節(jié)活性發(fā)揮作用[14]，研究顯示淫羊藿苷通過增加線粒體中sirtuin-1的表達而產(chǎn)生保護心肌細胞免受氧化應激損傷的作用[18]。然而淫羊藿中仍有很多成分如檢測淫羊藿次苷Ⅱ(ICAⅡ)、朝藿定等可能會對心血管疾病發(fā)揮作用，如ICAⅡ能夠上調miR-181c，激活下游的相關的信號通路，從而恢復血管內皮細胞功能[19]，總體來說目前其他成分的研究還很欠缺。本研究通過網(wǎng)絡藥理學分析淫羊藿治療DCM的作用，在基于計算機軟件構建網(wǎng)絡后，確定了該藥用植物的作用機制，希望為未來開發(fā)淫羊藿相關有效成分提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 獲取淫羊藿的主要有效活性成分選擇TCMSP平臺檢索淫羊藿所含有的化學成分，再以化合物的藥動力學參數(shù)中的類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18，口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，caco-2 permeability≥-0.4和half-life≥3 h為篩選標準，篩選出淫羊藿中主要的有效活性成分。

1.2 有效活性成分的靶點預測以活性成分為關鍵詞，通過PubChem進行檢索，確定淫羊藿的結構信息，接下來在Swiss Target Prediction平臺中檢索有關結構信息，確定研究所需的靶點信息。

1.3 DCM相關靶點預測選擇GeneCards平臺以“diabetic cardiomyopathy”為檢索詞查找DCM相關靶點信息。將淫羊藿有效活性成分和DCM的有關靶點信息進行對比分析，確定淫羊藿治療DCM的作用靶點。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網(wǎng)絡構建在String平臺中導入上一步驟獲得的靶點信息，使用Multiple Proteins，將Organism設置成Homo Sapiens，接下來向Cytoscape version 3.8.2工具中導入獲得的信息，構建網(wǎng)絡并進行分析，最后獲得研究所需的PPI關系圖。

1.5 靶點GO富集及KEGG通路注釋分析用R語言對淫羊藿與DCM的共作靶點進行分析，獲得GO富集分析所需的氣泡圖以及條形圖，最后通過轉換獲得相應的原始基因靶點。

1.6 靶點KEGG通路富集分析及KEGG關系網(wǎng)絡構建通過轉換使ID成為相應的文本文件，基于R語言工具處理獲得文本文件、氣泡圖與條形圖。在Cytoscape3.8.2工具中導入通過perl處理后得到的KEGG文件，對KEGG關系網(wǎng)進行繪制。

2 結果

2.1 淫羊藿主要有效活性成分與潛在靶點的篩選結果基于數(shù)據(jù)庫篩選出淫羊藿中主要的有效活性成分有17個，見表1，經(jīng)過SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫預測并構建成分靶點集，得到淫羊藿潛在活性成分靶點551個。

表1 淫羊藿主要有效活性成分Table1 Main activeingredients of Epimedium

2.2 DCM潛在靶點信息基于GeneCards可以得到330個DCM的靶點基因，將已經(jīng)獲得的淫羊藿中有效活性成分作用的靶點基因取交集，可獲得兩者的共同靶點有58個(圖1)。

圖1 淫羊藿與糖尿病心肌病共同靶點韋恩圖Figure 1 Venn diagram of the common target of Epimedium and diabetic cardiomyopathy

2.3 淫羊藿主要有效活性成分-核心靶點網(wǎng)絡本研究通過Cytoscape 3.8.2工具繪制的靶點圖(圖2)，圖中綠色、紅色、棕黃色與藍色部分分別對應的是淫羊藿、DCM、活性成分與靶點。節(jié)點的重要程度與連線的密集程度間具有正相關的關系，也就是如連線較少，那么節(jié)點的重要性便相對較差，相應的如連線較多，那么節(jié)點的重要程度便相對較高。在STRING中輸入得到的58個靶點信息，可以構建出PPI網(wǎng)絡圖(圖3)，通過R語言提取出中度值居于前30位的基因(圖4)。

圖2 淫羊藿有效活性成分-核心靶點網(wǎng)絡Figure 2 Theeffectiveactiveingredient-Hub target network of Epimedium

圖3 淫羊藿與糖尿病心肌病靶點PPl網(wǎng)絡Figure3 PPl network of Epimedium target and diabetic cardiomyopathy target

圖4 PPI的核心基因Figure4 Hub genesof PPI

2.4 淫羊藿-DCM相關靶點GO富集分析使用R語言對淫羊藿-DCM相關靶點進行GO富集分析。經(jīng)R語言運行后總共得到74個功能，以前20作為分界，可得到如下兩圖所示的條形圖(圖5)與氣泡圖(圖6)。如富集較少，那么圖形的顏色便相對較為趨近于藍色，如富集較為顯著，那么圖形的顏色便較為趨近于紅色，圖像的橫坐標代表的是富集數(shù)量。GO富集分析描述了淫羊藿治療DCM的靶點參與protein serine/threonine kinase activity、insulin receptor substrate binding、protein kinase C activity和calcium-dependent protein kinase Cactivity等。

圖5 GO富集條形圖Figure5 GO enrichment bar graph

圖6 GO富集氣泡圖Figure 6 GO enrichment bubblediagram

2.5 淫羊藿-DCM相關靶點KEGG通路富集分析KEGG通路富集分析及KEGG關系網(wǎng)絡構建選擇R語言工具，通過該工具進行處理后，得到的通路數(shù)量為159條，根據(jù)顯著性的大小選取居于前20位的通路，并繪制相應的條形與氣泡圖(圖7、圖8)。圖左側代表通路名稱，橫坐標代表靶點的數(shù)量，如果靶點數(shù)量越少，圖形的顏色便趨近藍色，靶點數(shù)量越多，圖形的顏色便趨近紅色。圖9為進行富集時居于前20位的基因和KEGG通路間的網(wǎng)絡圖，連線是指相互鏈接，內圈與外圈的圓形分別代表的是基因與通路，如圖形的顏色越深，且面積較大，說明相互關聯(lián)的數(shù)量也越多，通過觀察分析該圖不難發(fā)現(xiàn)KEGG通路與基因之間的網(wǎng)絡圖中關聯(lián)數(shù)量較多的基因主要有蛋白激酶B1(AKT1)、磷酸肌醇3激酶催化亞基β(PIK3CB)、磷酸肌醇3激酶催化亞基α(PIK3CA)、磷酸肌醇3-激酶調節(jié)亞基1(PIK3R1)和磷酸肌醇3激酶催化亞基δ(PIK3CD)等。

圖7 KEGG富集條形圖Figure7 KEGG enrichment bar graph

圖8 KEGG富集氣泡圖Figure8 KEGG enrichment bubblemap

圖9 淫羊藿治療糖尿病心肌病的KEGG關系網(wǎng)絡Figure 9 KEGG network of Epimedium in the treatment of diabetic cardiomyopathy

3 討論

DM有許多并發(fā)癥，其對心肌的影響較嚴重[20-21]，DM并發(fā)癥嚴重威脅著DM患者的生活質量[22]。DCM是DM的嚴重并發(fā)癥之一，死亡率高，被描述為存在心肌功能障礙而沒有任何其他常規(guī)心血管危險因素。DCM主要表現(xiàn)為心肌纖維化、心肌細胞肥大、細胞凋亡和代謝紊亂，最終導致心力衰竭[23-25]，盡管有研究從分子和細胞角度解釋發(fā)病機制，可能涉及過度氧化應激、纖維化、細胞凋亡和高血糖引起的炎癥，但仍有爭議[26-27]。

近年來在治療擴張型心肌病方面的選方用藥表現(xiàn)出更加全面、多樣與系統(tǒng)的特點[28]。通過淫羊藿中的主要成分淫羊藿苷及淫羊藿總黃酮等的有關動物實驗能夠發(fā)現(xiàn)，在治療擴張型心肌病方面淫羊藿可以發(fā)揮良好的作用，不過與病機相關的研究相對較少[29-30]。本研究篩選出淫羊藿中主要的有效活性成分有槲皮苷(quercetin)、木樨草素(luteolin)、乙酸亞油醇酯(linoleyl acetate)、山奈酚(kaempferol)等17個，發(fā)現(xiàn)58個靶點對DCM產(chǎn)生作用，利用PPI處理后確定了前5位的靶標，分別為蛋白激酶1(AKT1)、腫瘤壞死因子(TNF)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、腫瘤蛋白p53(p53)和內皮型一氧化氮合成酶[NOS3(eNOS)]等，因此推測這5個靶標可能是淫羊藿治療DCM的關鍵靶點。有研究發(fā)現(xiàn)AKT是信號轉導分子，其介導的信號轉導通路調節(jié)細胞分裂、分化、凋亡等活動[31]，而達格列凈可上調AKT/酪氨酸激酶(JAK)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路減輕DCM[32]。腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)是一些主要的促炎細胞因子，參與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展[33]，一項研究評估了左心室舒張功能障礙的促炎細胞因子水平，這是DM引起左心室功能障礙的最早表現(xiàn)，其發(fā)現(xiàn)血漿IL-6和TNF-α水平升高[34]。研究顯示二甲雙胍改善2型DM引起的左心室損傷中纖維化和血脂異常的活性氧(ROS)-p53-膠原蛋白(collagen)軸，還有研究顯示恢復細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK)/mTOR通路可預防DCM[35]，而淫羊藿能對Akt/mTOR起到抑制作用，同時還可以使p53激活[36]。Baumgardt等[37]發(fā)現(xiàn)通過BH4/eNOS/NO途徑限制DCM和缺血/再灌注損傷，而Duan等[38]發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷激活PI3K/AKT-eNOS通路可延緩內皮細胞衰老。

GO富集分析顯示淫羊藿治療DCM的預測靶點參與蛋白絲氨酸蘇氨酸磷酸酶/蘇氨酸激酶激活、胰島素受體底物結合、蛋白激酶C激活和鈣依賴蛋白激酶C激活等。KEGG富集通路分析顯示淫羊藿治療DCM的主要通路有糖尿病心肌病、HIF-1信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終產(chǎn)物(AGE)-晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)信號通路、胰島素抵抗、生長激素的合成、分泌和作用通路和內分泌阻抗通路等，這與PPI網(wǎng)絡分析及GO富集分析結果相似。缺氧誘導因子-1(HIF-1)與DCM密切相關[39]，ROS和HIF1α依賴性IGFBP3上調阻斷IGF1存活信號，從而介導高糖誘導的心肌細胞凋亡，而外源性硫化氫通過抑制信號轉導及轉錄激活子3(STAT3)/HIF-1α通路可以防止高糖誘導的細胞凋亡和氧化應激[40]。相關研究發(fā)現(xiàn)AGE及其受體(RAGE)與DCM的發(fā)病機制有關，抑制RAGE/NF-κB信號通路和下游炎癥因子的表達，對DM大鼠相關心血管并發(fā)癥具有保護作用[41]。AGE及其與RAGE的相互作用促進細胞的增殖、ECM的積累和抑制細胞凋亡從而誘導血管重塑，AGE和RAGE相互作用產(chǎn)生的ROS調節(jié)細胞增殖、減弱細胞凋亡和收縮血管[42-43]，淫羊藿苷Ⅱ(ICAⅡ)和二甲雙胍(MET)可降低空腹血糖(FPG)、血紅蛋白A1c(HbA1c)和AGEs水平。ICAⅡ和MET還可能通過PI3K-AKT-mTOR通路增強信號傳導，以減少平滑肌細胞線粒體自噬[44]。生長激素促分泌素(GHS)在內分泌、代謝和心血管研究領域開辟了許多新的視角，表明其可能在DM和DM并發(fā)癥尤其是DCM中發(fā)揮治療應用，其可調節(jié)巨噬細胞和脂肪細胞中的過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)，PPAR-γ是胰島素致敏的重要調節(jié)劑。生長激素釋放肽(Ghrelin)還通過激活PI3K/AKT和c-Jun N-末端激酶(JNK)抑制對β細胞顯示出保護作用。在胰腺切除大鼠和鏈脲佐菌素治療的新生大鼠中，?；L素釋放肽(AG)和非酰化生長素釋放肽(UAG)給藥可降低葡萄糖水平并增加產(chǎn)生胰島素的β細胞數(shù)量和胰島素分泌，表明GHS在胰腺再生中可能發(fā)揮作用[41，45]。這些通路被激活可以促進細胞因子的分泌，其中最重要的包括TNF-α，這有助于炎癥反應[46]，而這些細胞因子可以加速DCM的進展。

本研究以網(wǎng)絡藥理學為基礎，針對淫羊藿治療DCM的作用機制進行研究，結果表明淫羊藿可能利用多靶點、多成分、多通路抑制氧化應激、炎癥反應、細胞自噬來改善DCM及心肌細胞氧化代謝功能，作用于AKT1、TNF、mTOR、TP53和NOS3(eNOS)等相關靶點。