紫草油對激素依賴性皮炎豚鼠模型的影響及機制

馬文禮，馬小娟，馬娟弟，張紅霞，楊帆，王麗新

糖皮質(zhì)激素因其顯著的調(diào)節(jié)免疫、抗炎、美白等作用，被廣泛用于多種皮膚病的治療。長期應用后停藥易誘發(fā)停藥反應，表現(xiàn)為皮膚紅斑、痤瘡、脫屑，并伴有刺痛、燒灼、瘙癢等不適，恢復用藥后皮損可緩解，使患者身體及心理產(chǎn)生依賴，嚴重影響患者身心健康[1]。皮膚屏障分布于皮膚最外層，作為機體與外界環(huán)境隔離的最關鍵結構，對維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和抵御外來物質(zhì)的侵襲具有重要作用。兜甲蛋白(LOR)作為皮膚屏障最主要蛋白，其含量占角質(zhì)層總蛋白80%，另一關鍵蛋白質(zhì)絲聚蛋白(FLG)經(jīng)半胱氨酸蛋白酶-14(Caspase-14)切割分解為游離氨基酸，為皮膚提供天然保濕因子，維持皮膚水分[2]。HDD的特征性表現(xiàn)為皮膚屏障相關蛋白的破壞，隨著皮膚屏障破壞，角質(zhì)形成細胞衍生的炎癥級聯(lián)反應啟動，輔助性T細胞和嗜酸性粒細胞增多[3]。

紫草油為皮膚科常用制劑，臨床報道其對多種皮膚病療效顯著[4]，但目前對其作用機理的研究尚匱乏。本研究以紫草油對HDD豚鼠進行干預，從調(diào)節(jié)免疫和皮膚屏障修復機理角度探討其作用機理，為臨床用藥提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1動物 健康2月齡雌性白化豚鼠32只，體重(330±20)g，購自寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心[許可證號：SYXK(寧)2020-0001]。實驗研究已通過寧夏醫(yī)科大學動物倫理委員會審查(批準代碼：IACUC-NYLAC-2021-053)。

1.1.2藥品 丙酸氯倍他索粉劑(中國食品藥品檢定研究院，批號：100302-201804)。0.03%他克莫司軟膏(浙江萬晟藥業(yè)有限公司)。紫草藥材(寧夏明德中藥飲片有限公司，批號：20210201)。芝麻油(上海太太樂食品有限公司)。

1.1.3試劑 IL-4(JL21520)、IFN-γ (JL11665)、IgE(JL11287)ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)。FLG(美國Affinity，DF13653)；LOR(美國Thermo Fisher Scientific)；Caspase-14(美國Novus)。0.25%胰酶蛋白消化液(北京索萊寶科技有限公司，T1350)；山羊抗兔的二抗、山羊抗鼠的二抗、DAB顯色劑、ECL發(fā)光試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，ZB2301、ZB2305、ZLI-9018、SC-2048)。

1.1.4實驗儀器 超微量紫外可見分光光度計DS-11(美國丹諾爾)；BP310P型稱量天平(德國Sartorius公司)；Centrifuge5417R型低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)。

1.2方法

1.2.1紫草油制備 取紫草藥材適量，粉碎，以10倍量芝麻油浸泡藥材1 h后，145 ℃高溫加熱1 h后，放置冷卻即得[5]。

1.2.2HDD豚鼠模型建立 32只豚鼠分別于背部左右兩側選取5 cm×5 cm區(qū)域脫去毛發(fā)。隨機選取8只豚鼠作為空白組，右側涂抹75%酒精，左側涂抹生理鹽水，剩余24只右側涂抹0.05%丙酸氯倍他索酊劑[6]，左側涂抹75%乙醇， 2次/d，連續(xù)7周。

1.2.3分組及給藥 將上述24只HDD模型豚鼠隨機分3組，即模型組、治療組、陽性對照組。模型組右側皮膚涂抹生理鹽水，治療組右側皮膚涂抹紫草油，陽性對照組右側皮膚涂抹0.03%他克莫司軟膏， 2次/d，連續(xù)3周。

1.2.4皮脂測試儀、皮膚鏡及紅外成像系統(tǒng)檢測 使用皮脂檢測儀、皮膚鏡分別對上述4組豚鼠雙側皮膚于治療前、治療后進行檢測，對皮膚水分、油分重復檢測3次，取均值作為皮膚水分、油分值；皮膚鏡采集皮膚組織圖像；紅外成像系統(tǒng)測量雙側皮溫。

1.2.5樣本采集 于末次給藥12 h后,以3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，心尖取血，3 500 r/min條件下離心15 min，取上清液用凍存管分裝后，置-80 ℃冰箱保存。取豚鼠雙側脫毛區(qū)完整皮膚，部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，剩余部分用凍存管分裝后，置-80 ℃冰箱保存。

1.2.6血清炎癥因子檢測 取1.2.5中上清液，參照ELISA試劑盒說明對血清IL-4、IFN-γ、IgE水平進行檢測。

1.2.7皮膚組織病理性檢測 取1.2.5中4%多聚甲醛溶液固定后組織，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片(厚度為5 μm)，HE染色后封片，置于光學顯微鏡下觀察(×200)。

1.2.8免疫組織化學檢測皮膚組織FLG、LOR和Caspase-14蛋白表達 將切片常規(guī)脫蠟至水、經(jīng)抗原高壓修復、孵育、血清封閉、滴加PBS稀釋后的一抗，濕盒內(nèi) 4 ℃孵育過夜、PBS洗滌3次，5 min/次、滴加HRP標記的二抗，室溫孵育 30 min、同法洗滌3次、滴加新配的DAB顯色液顯色、蘇木素復染細胞核、脫水封片、鏡下觀察采圖(×400),細胞核為藍色，陽性表達為棕黃色。

1.2.9Western blot法檢測皮膚組織FLG、LOR和Caspase-14表達 將皮膚組織放入0.25%胰酶蛋白消化液中4 ℃浸泡16 h后，輕輕揭下表皮層，稱取50 mg剪碎，于液氮中研磨至細粉狀，分裝至離心管，加入RIPA裂解液500 μL，混勻，4 ℃放置過夜后，12 000 r/min，4 ℃條件下離心10 min，取上清液。運用超微量紫外可見分光光度計測定蛋白濃度，95 ℃條件下變性10 min。于SDS-PAGE凝膠上樣后電泳，PVDF轉膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉 2 h，加入PBS稀釋后的一抗，4 ℃過夜。PBST液洗滌3次，10 min/次。加入PBST稀釋后的二抗，作用90 min，同法洗滌后，暗盒中采用ECL法顯影，掃描膠片，Image-J軟件測定條帶灰度值。

2 結果

2.1各組豚鼠皮膚水分、油分含量及皮溫比較 與空白組相比，模型組水分、油分含量顯著降低，皮溫升高(P< 0.05)；與模型組相比，紫草油組、他克莫司組水分、油分升高，皮溫降低(F水分=11.92、F油分=13.29、F皮溫=7.95，P<0.05)，見表1。

表1 各組豚鼠水分、油分及皮溫比較Tab.1 Comparison of water content, oil content and skin temperature of guinea pigs in each n=8)

2.2各組豚鼠皮膚鏡特征 與空白組相比，模型組豚鼠皮膚可見毛細血管擴張，表面散在鱗屑覆蓋；與模型組相比，紫草油及他克莫司組可見鱗屑消退，毛細血管擴張改善(圖1)。

Normal group; Model group; Lithospermum oil group; Tacrolimus group圖1 各組豚鼠皮膚鏡特征Fig.1 Dermoscopy characteristics of guinea pigs in each group

2.3各組豚鼠皮膚組織形態(tài)學變化 與空白組相比，模型組豚鼠表皮角質(zhì)層角化不全，表皮增生，棘層肥厚，表皮突下延呈杵狀，真皮淺層致密的炎癥細胞浸潤(黃色箭頭示)；與模型組相比，紫草油組及他克莫司組角質(zhì)層增厚，表皮增生及真皮淺層炎癥細胞浸潤改善(圖2)。

Normal group; Model group; Lithospermum oil group; Tacrolimus group圖2 各組豚鼠皮膚組織病理 (HE×200)Fig.2 Histopathology of skin tissue of the guinea pigs in each group (HE×200)

2.4各組豚鼠血清中IL-4、IFN-γ、IgE水平變化 與空白組相比，模型組豚鼠血清中IL-4、IFN-γ、IgE水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，紫草油組、他克莫司組豚鼠血清中IL-4、IFN-γ、IgE水平均降低，差異有統(tǒng)計學意義(FIL-4=51.49、FIFN-γ=22.12、FIgE=17.96，P<0.05)，見表2。

表2 各組豚鼠血清中IL-4、IFN-γ、IgE水平變化Tab.2 Changes of IL-4, IFN-γ and IgE levels in serum of guinea pigs in each

2.5各組豚鼠表皮組織FLG、LOR和Caspase-14蛋白表達情況 免疫組織化學結果示，F(xiàn)LG、LOR和Caspase-14主要表達于表皮角質(zhì)層、顆粒層以及真皮層毛囊周圍(圖3)。Western blot法檢測結果示(圖4)，較之于空白組，模型組表皮組織FLG、LOR和Caspase-14表達顯著下調(diào)(P<0.01)；較之于模型組，紫草油組及他克莫司組FLG、LOR和Caspase-14表達顯著上調(diào)(FFLG=118.69、FLOR=52.88、FCaspase-14=32.45，P<0.01)。

圖3 各組豚鼠表皮組織FLG、LOR和Caspase-14免疫組織化學結果 (×400)Fig.3 Immunohistochemical results of FLG, LOR and Caspase-14 in guinea pig epidermis of each group (×400)

Note:1 indicated Normal group; 2 indicated Model group; 3 indicated Tacrolimus group; 4 Lithospermum oil group; Compared with normal group,# P<0.05,##P<0.01;compared to model group,*P<0.05, **P<0.01. Electropherogram of FLG, LOR and Caspase-14 expression in guinea pig epidermis of each group; FLG expression result; LOR expression result; Caspase-14 expression result圖4 Western blot法檢測各組豚鼠表皮組織FLG、LOR和Caspase-14表達結果Fig.4 Western blot method to detect the expression of FLG, LOR and Caspase-14 in guinea pig epidermis of each group

3 討論

HDD的發(fā)病機制目前尚不完全清楚，但主要認為與皮膚屏障破壞有關。長期外用糖皮質(zhì)激素使正常表皮分化受抑制，總蛋白和微絲蛋白等合成減少，最終引起皮膚屏障功能缺陷[3]。本研究結果顯示，經(jīng)丙酸氯倍他索局部外用7周后，模型成功建立，表皮組織相關屏障蛋白FLG、LOR和Caspase-14等被下調(diào)，經(jīng)皮膚失水量(TEWL)增加。

HDD急性損傷期的特征是 Th2 型細胞因子及IgE抗體的過度表達[7-8]，IL-4為經(jīng)典的Th2 型細胞因子，將Th0 細胞轉化為 Th2 細胞，并誘導IgE抗體合成，致使機體抵抗力降低；研究[9]表明，皮膚干燥、脫屑等也與IL-4過度表達存在相關性。IFN-γ是一種經(jīng)典的Th1 型細胞因子，在HDD損傷后期，IFN-γ等Th1 型細胞因子大量分泌，進一步促進炎癥反應及皮膚損傷[10]；有研究[11]顯示，藥物過敏患者血清IFN-γ可過度表達。因此，IL-4、IgE和 IFN-γ水平可作為皮膚炎癥嚴重程度的評估指標。本研究中HDD豚鼠經(jīng)停用激素制劑后，血清IL-4、IgE和 IFN-γ水平較空白對照組顯著升高。

本研究結果顯示，HDD豚鼠模型表皮增生，角質(zhì)層出現(xiàn)角化不全，表皮相關蛋白表達降低，這可能與炎癥級聯(lián)反應的形成有關。IL-4、IFN-γ可誘導HDD角質(zhì)形成細胞的凋亡增加而損傷皮膚屏障，降低表皮中FLG、LOR和Caspase-14的表達，不斷加重皮損程度和延長皮損持續(xù)時間，引起表皮增厚及角化不全[12]。

紫草油是將紫草以麻油等作為溶劑所提取的一種藥物劑型，因其具有抗炎、抗過敏、調(diào)節(jié)免疫作用，對多種皮膚病療效顯著[4]?，F(xiàn)代研究[13]發(fā)現(xiàn)，紫草具有抗菌、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等多重藥理作用。吳金環(huán)等[14]報道，紫草素作為紫草主要活性成分，能夠降低特應性皮炎小鼠血清IL-4表達，減輕皮損處炎癥反應，其機制可能與抑制TSLP/OX40L通路有關。紫草素還可降低血清IFN-γ及IgE而發(fā)揮抗炎作用[15]。

本課題采用紫草油對HDD豚鼠進行干預，發(fā)現(xiàn)其可不同程度降低HDD豚鼠血清IL-4、IgE和 IFN-γ水平，這與上述研究中紫草的抗炎功能相一致。紫草油還可增強表皮組織中FLG、LOR和Caspase-14的表達，促進皮膚屏障的形成，其作用機制可能與改善皮膚炎癥狀態(tài)有關。

綜上所述，紫草油可以抑制皮膚炎癥反應的發(fā)生，改善表皮增生，恢復受損的皮膚屏障相關蛋白的表達，降低TEWL，可為HDD的治療提供新思路。