丹參總黃酮提取工藝的優(yōu)化及其抑菌活性研究

龍 旭，王蕾萌，龔 莉，雷亞婷，郭 惠，靳如意

(陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省秦嶺中草藥應(yīng)用開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心，陜西 咸陽(yáng) 712046)

丹參為唇形科(Labiatae)鼠尾草屬(SalviamiltiorrhizaBunge.)植物的根莖，因根莖顏色多為紅色且形似參類(lèi)而得名[1-2]。丹參味苦，性微寒，歸心經(jīng)、肝經(jīng)，具有祛瘀止痛、舒筋活血、清心避暑、抗菌消炎、涼血消癰等功效[1-6]，可用于治療月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、熱痹疼痛、冠心病、高血壓、心絞痛、心肌缺血、肝硬化、腫瘤等癥[4-8]。丹參中的丹參素、丹酚酸、丹酚酸甲酯、迷迭香酸、咖啡酸等為水溶性成分，具有改善微循環(huán)、抗血栓等作用[5]。丹參中以松香烷型二萜類(lèi)化合物為主的成分，如丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、丹參酮Ⅵ、異丹參酮、隱丹參酮等為脂溶性成分，具有抗癌、保護(hù)心臟和神經(jīng)的作用[5-8]?；诘ⅫS酮類(lèi)物質(zhì)廣泛的藥理活性，其相關(guān)藥物研發(fā)成為研究熱點(diǎn)。

黃酮類(lèi)物質(zhì)傳統(tǒng)的提取工藝主要包括浸漬法、滲漉法、水煮法、有機(jī)溶劑回流提取法等，但普遍存在雜質(zhì)含量高、提取率低、提取時(shí)間長(zhǎng)、溶劑消耗量大等缺點(diǎn)。超聲提取法利用超聲波輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、機(jī)械振動(dòng)、擾動(dòng)效應(yīng)和攪拌等多種作用，加快物質(zhì)分子振動(dòng)的頻率和速度，提高溶劑的穿透力，從而擊破植物細(xì)胞壁，高效、快速地提取細(xì)胞內(nèi)容物[9]。與傳統(tǒng)的水煮法及有機(jī)溶劑回流提取法相比，超聲提取法具有速度快、提取率高、適用范圍廣、不破壞中藥材活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)。丹參總黃酮可破壞細(xì)菌DNA致其死亡，尤其對(duì)革蘭氏菌的抑制效果顯著，可開(kāi)發(fā)為天然防腐劑[10]。在此，作者通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)超聲提取法和熱回流提取法提取丹參總黃酮進(jìn)行比較研究，再通過(guò)響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化丹參總黃酮的提取工藝，并研究丹參總黃酮對(duì)革蘭氏菌的抑制活性，為陜西省道地藥材丹參的高效提取及深入開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

丹參(根莖)，西安藥材市場(chǎng)。

硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇，均為分析純；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC 純度98%)；二次水，自制。

TP-A200型電子天平，福州華志科學(xué)儀器有限公司；FSJ-A03D1型粉碎機(jī)，廣東小熊電器有限公司；HJ-3A型磁力攪拌器，常州丹瑞實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；SHB-Ⅲ型真空泵，西安大康生物科技有限公司；DHG-9030型干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV1102型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海天美科技儀器有限公司；KQ-400KDE型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；RE-200A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，西安予輝儀器有限公司。

1.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)[11]配制系列濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，于最大吸收波長(zhǎng)510 nm處分別測(cè)定其吸光度，以濃度(c)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，擬合得到線性回歸方程為：A=0.0011+9.42286c，R2=0.99996。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

1.3 丹參總黃酮的提取

將丹參于50 ℃干燥5 h，自然冷卻后，粉碎，過(guò)80目篩，得到丹參細(xì)粉，于密封袋保存，備用。精確稱(chēng)取5.0 g丹參細(xì)粉于回流瓶中，按料液比1∶10(g∶mL，下同)加入50 mL一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇，65 ℃超聲提取50 min或回流提取120 min，抽濾；殘?jiān)貜?fù)提取2次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，萃取，定容后，測(cè)定510 nm處吸光度。按下式計(jì)算丹參總黃酮提取率(mg·g-1)：

式中：c為經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到的提取液中總黃酮濃度，mg·mL-1；V為提取液體積，mL；m為丹參細(xì)粉質(zhì)量，g。

1.4 丹參總黃酮的抑菌活性評(píng)價(jià)

1.4.1 菌懸液的制備

將一定量的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌接種至滅菌的培養(yǎng)基中，(36±1) ℃培養(yǎng)24 h，再用滅菌生理鹽水稀釋至103～105CFU·mL-1。

1.4.2 抑菌圈直徑的測(cè)定

采用濾紙片浸漬法測(cè)定抑菌圈直徑。將0.5 cm定性濾紙圓片置于離心管中，高壓滅菌后，干燥，備用。以滅菌生理鹽水稀釋丹參總黃酮提取濃縮液，分別配成梯度濃度1 mg·mL-1、5 mg·mL-1、10 mg·mL-1和20 mg·mL-1的丹參總黃酮溶液，過(guò)濾除菌后，加入含0.5 cm定性濾紙圓片的離心管中，浸泡30 min；超凈工作臺(tái)上，將滅菌培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，紫外滅菌冷卻后，加入103～105CFU·mL-1菌懸液20 μL，涂布均勻；用無(wú)菌鑷子夾取浸有丹參總黃酮溶液的濾紙圓片，略干后放入培養(yǎng)皿中；將培養(yǎng)皿于36 ℃培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑，平行測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 丹參總黃酮提取工藝的優(yōu)化

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1.1 料液比對(duì)丹參總黃酮提取率的影響(圖2)

圖2 料液比對(duì)丹參總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids from Salvia miltiorrhiza

從圖2可知，超聲提取法的丹參總黃酮提取率高于熱回流提取法，且超聲提取法的總黃酮提取率受料液比的影響較小。隨著料液比的減小，即提取溶劑用量的增加，兩種方法的總黃酮提取率均呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1∶10時(shí)，總黃酮提取率最高。這是由于，溶劑乙醇用量增加，其與丹參細(xì)粉有效接觸的比表面積增大，促使黃酮類(lèi)有效成分?jǐn)U散并轉(zhuǎn)移至溶劑中，提取率快速提高；但溶劑用量過(guò)大時(shí)，溶質(zhì)占比減小，黃酮類(lèi)有效成分在溶劑中的比例降低，后處理過(guò)程中總黃酮損失增大，導(dǎo)致總黃酮提取率降低。

2.1.1.2 提取時(shí)間對(duì)丹參總黃酮提取率的影響(圖3)

圖3 提取時(shí)間對(duì)丹參總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids from Salvia miltiorrhiza

從圖3可知，基于熱效應(yīng)、空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)，超聲提取法所耗時(shí)間較短、丹參總黃酮提取率略高。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種方法的總黃酮提取率均呈先升高后降低的趨勢(shì)，且超聲提取法的總黃酮提取率下降趨勢(shì)比熱回流提取法的緩慢。當(dāng)提取時(shí)間為30 min時(shí)，超聲提取法的總黃酮提取率達(dá)到最高；當(dāng)提取時(shí)間為90 min時(shí)，熱回流提取法的總黃酮提取率達(dá)到最高。這是由于，溶劑與丹參細(xì)粉接觸時(shí)間延長(zhǎng)促使溶劑充分浸潤(rùn)丹參細(xì)粉，溶解至溶劑中的黃酮類(lèi)有效成分增加，總黃酮提取率升高；但提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，總黃酮中的熱敏組分在高溫下會(huì)發(fā)生分解，導(dǎo)致總黃酮提取率下降。

2.1.1.3 提取溫度對(duì)丹參總黃酮提取率的影響(圖4)

圖4 提取溫度對(duì)丹參總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of total flavonoids from Salvia miltiorrhiza

丹參中的丹參酮ⅡA、丹酚酸B等物質(zhì)含有醌類(lèi)結(jié)構(gòu)，在高溫下會(huì)發(fā)生氧化、聚合等反應(yīng)，加熱溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致有效成分被破壞，因此，提取溫度對(duì)丹參總黃酮提取率的影響較大。從圖4可知，隨著提取溫度的升高，兩種方法的總黃酮提取率均呈先升高后降低的趨勢(shì)，且相同提取溫度下，超聲提取法的總黃酮提取率高于熱回流提取法的。當(dāng)提取溫度為65 ℃時(shí)，超聲提取法的總黃酮提取率達(dá)到最高；當(dāng)提取溫度為75 ℃時(shí)，熱回流提取法的總黃酮提取率達(dá)到最高。這是由于，超聲波的空化作用和機(jī)械作用大大提高了溶劑與溶質(zhì)的摩擦力和剪應(yīng)力，促進(jìn)有效物質(zhì)快速溶解，而提取溫度過(guò)高，溶劑與溶質(zhì)間的熱效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致總黃酮中的熱敏組分發(fā)生分解，使總黃酮提取率下降。

2.1.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)丹參總黃酮提取率的影響(圖5)

從圖5可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，兩種方法的丹參總黃酮提取率的變化趨勢(shì)基本一致，均呈先升高后略下降的趨勢(shì)，且超聲提取法的總黃酮提取率略高于熱回流提取法的。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%時(shí)，超聲提取法與熱回流提取法的總黃酮提取率均達(dá)到最高，分別為4.12 mg·g-1、3.82 mg·g-1；但繼續(xù)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，總黃酮提取率反而下降。這是由于，丹參有效成分分為水溶性成分和脂溶性成分，若乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)低，脂溶性成分不能被充分溶解；而乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高，水溶性成分溶解性降低，導(dǎo)致總黃酮提取率下降。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)丹參總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of total flavonoids from Salvia miltiorrhiza

2.1.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

對(duì)比兩種提取方法的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，超聲提取法總體優(yōu)于熱回流提取法。以丹參總黃酮提取率為響應(yīng)值，以料液比(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(D)為自變量，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化丹參總黃酮的超聲提取工藝。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平如表1所示，設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

采用Design-Expert軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到二次回歸方程：Y=4.14+0.0175A-0.0167B+0.0933C+0.0258D-0.0575AC+0.0500AD+0.0550BC-0.0550BD+0.0275CD-0.1779A2-0.1792B2-0.1767C2-0.1829D2，R2=0.9945。

回歸模型的方差分析如表3所示。

表3 方差分析

從表3可知，模型P<0.0001，說(shuō)明回歸模型高度顯著，模型擬合度高，實(shí)驗(yàn)誤差較小。一次項(xiàng)B、交互項(xiàng)CD對(duì)丹參總黃酮提取率的影響顯著；一次項(xiàng)A的影響極顯著；一次項(xiàng)C、D，交互項(xiàng)AC、AD、BC、BD，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2的影響高度顯著。由F值可知，各因素對(duì)丹參總黃酮提取率影響的大小順序?yàn)椋禾崛囟?C)>乙醇體積分?jǐn)?shù)(D)>料液比(A)>提取時(shí)間(B)。

2.1.2.2 最佳工藝的確定及驗(yàn)證

通過(guò)Design-Expert軟件對(duì)二次回歸方程求一階導(dǎo)，得到最佳超聲提取工藝如下：料液比1∶10、提取時(shí)間22 min、提取溫度68 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)86%，丹參總黃酮提取率理論值為4.151 mg·g-1。在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，總黃酮平均提取率為4.140 mg·g-1，相對(duì)平均偏差為0.10%，RSD值為0.14%，與理論值接近。

2.2 丹參總黃酮的抑菌活性

植物源黃酮可破壞細(xì)菌細(xì)胞壁膜的完整性及通透性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均具有一定的抑制效果。通過(guò)測(cè)定抑菌圈直徑，考察不同濃度丹參總黃酮的抑菌活性，結(jié)果如表4所示。

表4 不同濃度丹參總黃酮的抑菌活性

從表4可知，丹參總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌有明顯的抑制作用，且隨著濃度的增加，丹參總黃酮的抑菌作用越強(qiáng)。在相同濃度下，丹參總黃酮對(duì)革蘭氏菌的抑制作用大小為：大腸埃希菌>金黃色葡萄球菌>銅綠假單胞菌。因此，丹參總黃酮可作為天然抗菌劑進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)超聲提取法和熱回流提取法提取丹參總黃酮進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)超聲提取法優(yōu)于熱回流提取法，再通過(guò)響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化丹參總黃酮的超聲提取工藝，確定最佳超聲提取工藝為：料液比1∶10(g∶mL)、提取時(shí)間22 min、提取溫度68 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)86%，在此條件下，丹參總黃酮提取率為4.140 mg·g-1，與理論值(4.151 mg·g-1)接近。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丹參總黃酮對(duì)革蘭氏菌的抑制作用大小為：大腸埃希菌>金黃色葡萄球菌>銅綠假單胞菌。