反相聚合物填料層析純化萬古霉素工藝研究

張愛玲，王冬燕，韓笑笑，王圓超，張志江*，葛鹍鵬*

(1.華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司 微生物藥物國家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 052160；2.華北制藥華勝有限公司，河北 石家莊 052160)

萬古霉素(Vancomycin，分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示)是由東方擬無枝酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種糖肽類抗生素[1]，分子式為C66H75Cl2N9O24，分子量為1 449.25，為白色或類白色粉末,早期由美國禮萊公司開發(fā)生產(chǎn)，1958年獲FDA批準(zhǔn)上市[2]。萬古霉素對(duì)耐甲氧西林葡萄球菌(MRSA)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)、肺炎鏈球菌及腸球菌等多數(shù)革蘭氏陽性菌均有良好的抑制作用，因其不易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性，曾被譽(yù)為“人類對(duì)付頑固性耐藥菌株的最后一道防線”[3]，通常不作為一線抗菌藥物應(yīng)用，只在常用抗菌藥物無效時(shí)應(yīng)用。近年來，隨著耐藥細(xì)菌感染病例增多，萬古霉素市場需求量逐漸增大，同時(shí)對(duì)萬古霉素純度也有了更高的要求。

圖1 萬古霉素的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular formula of Vancomycin

萬古霉素可通過優(yōu)化的發(fā)酵工藝進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)[4]，其發(fā)酵液中除目標(biāo)產(chǎn)物外，還含有金屬離子、菌絲體、多種蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)。萬古霉素的分離純化方法有樹脂提取法、沉淀法、柱層析法、鹽析法、膜過濾法等[5]。規(guī)?；a(chǎn)常采用陶瓷膜[6]或超濾系統(tǒng)[7]過濾萬古霉素發(fā)酵液。過濾后的萬古霉素發(fā)酵液通常經(jīng)樹脂提取、濃縮、脫色等預(yù)處理過程得到萬古霉素粗品，然后采用柱層析法獲得高純度的萬古霉素。李寧等[8]采用混合型陽離子交換層析介質(zhì)獲得純度95%以上的萬古霉素。

反相色譜法因柱效高、分離能力強(qiáng)等優(yōu)勢，是分離純化蛋白、多肽類藥物使用較為廣泛的一種方法。近年來，國內(nèi)單分散多孔反相聚合物微球的制備及其應(yīng)用越來越多[9]。作者以國產(chǎn)單分散反相聚合物填料為層析介質(zhì)，甲醇-水溶液為流動(dòng)相，以萬古霉素的純度及收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用柱層析法純化萬古霉素粗品，考察洗雜劑濃度及體積、洗脫劑濃度、洗雜及洗脫流速、載樣量對(duì)層析純化萬古霉素的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

反相聚合物填料，蘇州納微科技有限公司。

萬古霉素粗品(純度93.20%)，華北制藥華勝有限公司；甲醇，分析純，天津永大化學(xué)試劑有限公司；蒸餾水，自制。

島津LC-2030C型高效液相色譜儀，島津企業(yè)管理(中國)有限公司；KQ-500B型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；玻璃層析柱(Φ50 mm×250 mm)。

1.2 方法

1.2.1 裝柱

用蒸餾水清洗層析柱，并充分潤濕層析柱內(nèi)壁。將反相聚合物填料攪拌均勻，超聲10 min除去氣泡。層析柱上端進(jìn)口連接加料裝置，一次性將填料轉(zhuǎn)入層析柱中，連接進(jìn)料管進(jìn)蒸餾水，在快流速下將填料壓實(shí)，層析柱填充好填料。

1.2.2 平衡

用蒸餾水洗去填料保護(hù)液，再用1.0 BV蒸餾水平衡層析柱，待用。

1.2.3 上樣

稱取萬古霉素粗品，用蒸餾水溶解并配制濃度為35 mg·mL-1的樣品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾。將樣品溶液以2 BV·h-1的流速加入層析柱中。

1.2.4 洗脫

上樣后，先用低濃度甲醇-水溶液洗雜，再用高濃度甲醇-水溶液洗脫，分段收集洗脫液，取樣檢測，合并萬古霉素純度≥96%的洗脫液。采用高效液相色譜儀檢測洗雜液中的雜質(zhì)濃度、洗脫液中的萬古霉素濃度，按式(1～2)計(jì)算雜質(zhì)降低率(%)、萬古霉素收率(%)。

(1)

(2)

式中：c雜為洗雜液中的雜質(zhì)濃度，mg·mL-1；c雜0為樣品溶液中的雜質(zhì)濃度，mg·mL-1；V雜為洗雜液體積，mL；V0為樣品溶液體積，mL；cVB為純度≥96%的洗脫液中的萬古霉素濃度，mg·mL-1；cVB0為樣品溶液中的萬古霉素濃度，mg·mL-1；VVB為純度≥96%的洗脫液體積，mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 洗雜劑濃度及體積的選擇

洗雜過程是用較低濃度的溶劑體系將萬古霉素粗品溶液中與填料結(jié)合力較弱的雜質(zhì)洗脫下來，以利于洗脫時(shí)獲得更高的產(chǎn)品純度和收率。為了更容易實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，方便操作，洗雜劑與洗脫劑采用相同的溶劑體系，即甲醇-水溶液。

按1.2.3操作，上樣結(jié)束后，分別用3%、4%、5%、6%、7%甲醇-水溶液進(jìn)行洗雜實(shí)驗(yàn)，洗雜劑體積3 BV，洗雜劑流速2 BV·h-1，收集洗雜液，取樣檢測雜質(zhì)及萬古霉素濃度，計(jì)算雜質(zhì)降低率和萬古霉素?fù)p失率，結(jié)果見表1。

由表1可知，用3%～6%甲醇-水溶液洗雜時(shí)，隨著甲醇濃度的增加，雜質(zhì)降低率和萬古霉素?fù)p失率均升高；用7%甲醇-水溶液洗雜時(shí)，由于更多的萬古霉素被洗下來，雜質(zhì)降低率下降,萬古霉素?fù)p失率上升。本著洗雜過程要洗掉更多的雜質(zhì)，而盡量減少萬古霉素?fù)p失的原則，選擇6%甲醇-水溶液作為洗雜劑。

表1 洗雜劑濃度對(duì)洗雜效果的影響/%

按1.2.3操作，上樣結(jié)束后，用6%甲醇-水溶液分別以2.0 BV、2.5 BV、3.0 BV、3.5 BV、4.0 BV、4.5 BV洗雜，收集洗雜液，取樣檢測雜質(zhì)及萬古霉素濃度，計(jì)算雜質(zhì)降低率和萬古霉素?fù)p失率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 洗雜劑體積對(duì)洗雜效果的影響Fig.2 Influence of volume of agent for washing impurity on removal impurity

由圖2可知，隨著洗雜劑體積的增加，雜質(zhì)降低率和萬古霉素?fù)p失率均逐漸升高；當(dāng)洗雜劑體積為3.5 BV時(shí)，雜質(zhì)降低率較高，萬古霉素?fù)p失率較低；繼續(xù)增加洗雜劑體積，雜質(zhì)降低率升幅變小，而萬古霉素?fù)p失率明顯升高。因此，洗雜劑體積選擇3.5 BV。

2.2 洗脫劑濃度的選擇

洗脫是層析純化萬古霉素的主要過程，采用較高濃度的甲醇-水溶液洗脫萬古霉素。

按1.2.3操作，上樣結(jié)束后，先用3.5 BV的6%甲醇-水溶液洗雜，再分別用10%、11%、12%、13%、14%、15%甲醇-水溶液洗脫，洗脫流速2 BV·h-1，分段收集洗脫液，取樣檢測，合并萬古霉素純度≥96%的洗脫液，計(jì)算萬古霉素收率，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著洗脫劑甲醇濃度的增大，洗脫液中的萬古霉素純度緩慢下降，收率先升高后下降，在甲醇濃度為12%時(shí)，收率最高。洗脫劑甲醇濃度較小時(shí)，洗脫液中的萬古霉素純度較高，但收率較低，這是由于部分萬古霉素吸附于填料上，沒有被完全洗脫下來。洗脫劑甲醇濃度偏大時(shí)，洗脫液中的萬古霉素純度有所降低，收率明顯降低，這是由于，甲醇濃度增大，更多的雜質(zhì)被洗脫下來，高純度部分減少。為了獲得高純度和高收率，洗脫劑選擇12%甲醇-水溶液。

圖3 洗脫劑甲醇濃度對(duì)萬古霉素純度及收率的影響Fig.3 Influence of methanol concentration in eluent on purity and recovery of Vancomycin

2.3 洗雜、洗脫流速的選擇

按1.2.3操作，上樣結(jié)束后，先用3.5 BV的6%甲醇-水溶液洗雜，再用12%甲醇-水溶液洗脫，洗雜、洗脫流速(BV·h-1)分別為1.75、2.00、2.25、2.50、2.75、3.00，分段收集洗脫液，取樣檢測，合并萬古霉素純度≥96%的洗脫液，計(jì)算萬古霉素收率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 洗雜、洗脫流速對(duì)萬古霉素純度及收率的影響Fig.4 Influence of flow rate of impurity-washing and elution on purity and recovery of Vancomycin

由圖4可知，在洗雜、洗脫流速為1.75～2.25 BV·h-1時(shí)，萬古霉素純度與收率變化不明顯，純化效果較理想；而洗雜、洗脫流速超過2.50 BV·h-1后，由于流速過快，兩相間的平衡速度受到影響，純化效果明顯變差，收率降低。綜合考慮層析效率、萬古霉素純度及收率等因素，洗雜、洗脫流速均選擇2.25 BV·h-1。

2.4 載樣量的選擇

在層析分離純化的工業(yè)生產(chǎn)中，在保證分離純化效果的基礎(chǔ)上，載樣量決定層析效率。分別選用2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的載樣量，先用3.5 BV的6%甲醇-水溶液洗雜，再用12%甲醇-水溶液洗脫，洗雜、洗脫流速均為2.25 BV·h-1，分段收集洗脫液，取樣檢測，合并萬古霉素純度≥96%的洗脫液，計(jì)算萬古霉素收率，結(jié)果如表2所示。

表2 載樣量對(duì)萬古霉素純度及收率的影響/%

由表2可知，載樣量偏小時(shí)，萬古霉素純度高，但收率較低，層析效率低；載樣量過大時(shí)，收率高，層析效率較高，但純化效果變差，純度低；4.0%的載樣量有超出了填料負(fù)荷量的趨勢。綜合考慮層析效率、雜質(zhì)含量、萬古霉素純度及收率等因素，載樣量選擇3.5%。

2.5 優(yōu)選工藝驗(yàn)證

在優(yōu)選工藝條件下進(jìn)行3批次層析工藝驗(yàn)證，按照3.5%的載樣量稱取萬古霉素粗品，用蒸餾水溶解并稀釋至濃度為35 mg·mL-1，上樣后，在2.25 BV·h-1的洗雜、洗脫流速下，先用3.5 BV的6%甲醇-水溶液洗雜，再用12%甲醇-水溶液洗脫，分段收集洗脫液，取樣檢測，合并萬古霉素純度≥96%的洗脫液，計(jì)算萬古霉素收率，結(jié)果如表3所示。

表3 優(yōu)選工藝驗(yàn)證結(jié)果/%

由表3可知，采用優(yōu)選的層析工藝參數(shù)進(jìn)行萬古霉素粗品分離純化，工藝穩(wěn)定，萬古霉素收率較高，純度高、雜質(zhì)含量低，層析效率較高。

3 結(jié)論

采用反相聚合物填料對(duì)萬古霉素粗品進(jìn)行層析純化，得到較佳工藝條件為：載樣量3.5%，洗雜、洗脫流速2.25 BV·h-1，先用3.5 BV的6%甲醇-水溶液洗雜，再用12%甲醇-水溶液洗脫。層析純化后的萬古霉素純度由原來的93.20%提高到98.22%，收率達(dá)81%以上。該層析工藝除雜效果明顯，可在較高的效率下獲得高純度萬古霉素，有較高的應(yīng)用價(jià)值。