BRAFV600E 和TERT啟動(dòng)子突變?cè)诩谞钕偃轭^狀癌中的作用研究

陳勇

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科甲乳三病區(qū)，蚌埠 233004）

甲狀腺癌是臨床上較為常見的惡性腫瘤[1]，甲狀腺乳頭狀癌（Papillary Thyroid Carcinoma，PTC）是其中最為常見的一種亞型，占比高達(dá)4/5[2]。經(jīng)過臨床治療，多數(shù)甲狀腺乳頭狀癌患者可以取得較好的療效，但仍有十分之一的患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)[3]。越來越多的研究表明，BRAF基因 在多個(gè)癌癥中均存在廣泛的突變[4-5]。不同的BRAF突變具有不同的臨床和治療意義，尤其是V600E和非V600E突變之間的區(qū)別[6]。近年來隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，BRAF及TERT啟動(dòng)子突變?cè)诩谞钕侔┌l(fā)病過程中的作用越來越受到重視。本研究通過對(duì)PTC腫瘤細(xì)胞進(jìn)行BRAFV600E以及TERT的檢測(cè)，探討了突變體在PTC中的作用功能。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性分析2018年8月至2021年8月在我院就診的甲狀腺乳頭狀癌（PTC）患者68例，平均年齡（40.62±11.92）歲，其中男性13人，女性55人，多灶腫瘤4例，單發(fā)64例。侵犯包膜33例，未侵犯包膜35例。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N0期36例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移pN1期32例。根據(jù)BRAFV600E啟動(dòng)子突變情況分為突變組及無突變組，無突變組有23例，平均年齡（40.05±12.81）歲。突變組45例，平均年齡（40.12±13.18）。

納入的研究對(duì)象：確診為甲狀腺乳頭狀癌患者，無其他惡性腫瘤，無精神疾病，術(shù)后病理切片確診為甲狀腺乳頭狀癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：病史病例不完全者；既往有嚴(yán)重心肝腎等重要臟器功能障礙者；既往有服用甲狀腺素藥史者。

所有患者對(duì)研究?jī)?nèi)容知情，且均簽署知情同意書，并獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法 將PTC腫瘤樣本進(jìn)行DNA的提取。采用試劑盒進(jìn)行DNA的提取，所有操作嚴(yán)格按照操作指南，提取完畢后進(jìn)行濃度測(cè)定，放置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）檢測(cè)BRAFV600E及TERT啟動(dòng)子突變的情況。登錄NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)，查找到BRAF和TERT基因的序列，由上海生物公司進(jìn)行引物設(shè)計(jì)并合成，設(shè)計(jì)BRAF基因上游引物序列5'-CATCTCACCTCATCCTAACACA-3'，下游引物序列5'-GCCTCAATTCTTACCATCCACAA-3'。設(shè)置PCR反應(yīng)體系（基因組DNA：1 μL；前引物：2 μL；后引物：2 μL；2X Taq PCR MasterMix：25 μL；ddH2O：20 μL），反應(yīng)條件（①94℃，3 min；②94℃，30 sec；③55℃，30 sec④72℃，1 min；⑤72℃，5 min；②-④*30）。

同理，設(shè)計(jì)TERT基因上游引物序列5'-GGGCTCCCAGTGGATTC-3'，下游引物序列5'-CC AC TACCGCGAGGTG-3'，設(shè)置PCR反應(yīng)體系（基因組DNA：1 μL；前引物：2 μL；后引物：2 μL；dNTP mix：1 μL；GC-RICH resolution solution:10 μL；GCRICH Reaction buffer:10 μL；GC-RICH System enzyme mix:1 μL；ddH2O：23 μL），PCR擴(kuò) 增 結(jié) 束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過比對(duì)條帶大小確定是否為目標(biāo)產(chǎn)物。確認(rèn)無誤后送至金唯智生物公司進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，比對(duì)測(cè)序結(jié)果以及正常序列，探討是否存在突變。

1.3 觀察指標(biāo) 分析比較BRAFV600E和TERT啟動(dòng)子與甲狀腺乳頭狀癌的相關(guān)聯(lián)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，年齡、腫瘤大小等計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BRAFV600E啟動(dòng)子突變與年齡、腫瘤大小及送檢淋巴結(jié)數(shù)目之間的關(guān)系BRAFV600E啟動(dòng)子突變率為66.18%，突變組與無突變組在年齡、腫瘤大小及送檢淋巴結(jié)數(shù)目之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 BRAFV600E啟動(dòng)子突變與年齡、腫瘤大小及送檢淋巴結(jié)數(shù)目之間的關(guān)系

2.2 TERT啟動(dòng)子突變與年齡、腫瘤大小及送檢淋巴結(jié)數(shù)目之間的關(guān)系TERT啟動(dòng)子突變率為11.76%，突變組與無突變組在年齡及送檢淋巴結(jié)數(shù)目之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在腫瘤大小上具有差異性，突變組的腫瘤明顯大于無突變組（P＜0.05），見表2。

表2 TERT啟動(dòng)子突變與年齡、腫瘤大小及送檢淋巴結(jié)數(shù)目之間的關(guān)系

2.3 BRAFV600E+TERT啟動(dòng)子突變與年齡、腫瘤大小及送檢淋巴結(jié)數(shù)目之間的關(guān)系BRAFV600E啟動(dòng)子聯(lián)合TERT突變的發(fā)生率為7.35%，突變組與無突變組在年齡及送檢淋巴結(jié)數(shù)目之間并無明顯差異性（P＞0.05），在腫瘤大小上具有差異性，突變組的腫瘤明顯大于無突變組（P＜0.05），見表3。

表3 BRAFV600E+TERT啟動(dòng)子突變與年齡、腫瘤大小及送檢淋巴結(jié)數(shù)目之間的關(guān)系

2.4 BRAFV600E及TERT啟動(dòng)子突變與臨床特征的關(guān)系 對(duì)BRAFV600E及TERT啟動(dòng)子突變與臨床特征之間進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)BRAFV600E是否突變與中央?yún)^(qū)轉(zhuǎn)移之間具有差異性，其突變狀態(tài)與腫瘤組織有無中央?yún)^(qū)轉(zhuǎn)移存在差異（P＜0.05）；TERT的突變狀態(tài)與腫瘤組織有無腺外浸潤(rùn)存在差異（P＜0.05）；BRAFV600E+TERT啟動(dòng)子的聯(lián)合突變狀態(tài)與腺外浸潤(rùn)、包膜侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有無之間存在差異（P＜0.05）。見表4。

表4 BRAFV600E及TERT啟動(dòng)子突變與臨床特征的關(guān)系

3 討論

根據(jù)2021年世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，甲狀腺癌在全球造成586000例病例，在2020年的發(fā)病率中排名第9，女性的全球發(fā)病率為每100000人中10.1人，是男性的3倍[7-8]。相比于高的發(fā)病率,這種疾病的死亡率要低得多，女性為每10萬人0.5人，男性為0.3人每10萬人，估計(jì)有44000人死亡。發(fā)病率的上升主要是由于分化型甲狀腺癌(Differentiated Thyroid Cancers，DTC)和乳頭狀甲狀腺癌(PTC)的診斷增加[9]。在過去的30年中，濾泡性(FTC)、間變性(ATC)和髓樣(MTC)甲狀腺癌的發(fā)病率一直保持相對(duì)穩(wěn)定。但是隨著醫(yī)學(xué)檢測(cè)手段的發(fā)展，廣泛的使用成像技術(shù)、活檢程序[例如，細(xì)針穿刺(FNA)]、醫(yī)學(xué)監(jiān)測(cè)以及居民醫(yī)療保健的改善等，促進(jìn)了臨床PTC的檢出率[10-11]。由此產(chǎn)生的過度診斷總是伴隨著過度治療，根據(jù)美國(guó)預(yù)防服務(wù)工作組的說法，對(duì)無癥狀成人進(jìn)行TC篩查相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)可能超過其潛在益處[12]。

DTC（包括低分化形式）的診斷工作包括術(shù)前和術(shù)后病理和分子評(píng)估?！? cm的結(jié)節(jié)不需要進(jìn)行術(shù)前FNA細(xì)胞學(xué)檢查,應(yīng)根據(jù)病變大小和超聲外觀來決定是否抽吸較大的結(jié)節(jié)[13]。細(xì)胞學(xué)結(jié)果被分為與不同惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的診斷類別。大多數(shù)惡性甲狀腺腫瘤可以通過細(xì)胞學(xué)識(shí)別。值得注意的例外是FTC和新定義的“具有乳頭狀核特征的非侵入性甲狀腺濾泡腫瘤”(NIFTP)，它們通常在各種甲狀腺細(xì)胞學(xué)報(bào)告方案中被歸類為不確定的[14-15]。除非有絲分裂活動(dòng)明顯增加和/或壞死，否則基于FNA對(duì)低分化癌的診斷也具有挑戰(zhàn)性[16]。通過評(píng)估惡性腫瘤標(biāo)志物（包括通常在腫瘤中過度表達(dá)的蛋白質(zhì)，例如HBME1或galectin-3）和與惡性腫瘤特別相關(guān)的分子改變（例如BRAF突變、RET融合、其他新基因改變），可以促進(jìn)FNA診斷[17]。另外有研究表明，血漿glactin-3、sIL-2R水平聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于診斷甲狀腺癌較單獨(dú)應(yīng)用具有更高的臨床價(jià)值,并且與甲狀腺癌分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[18]。

甲狀腺乳頭狀癌(PTC)是一種上皮惡性腫瘤，它是最常見的甲狀腺腫瘤，PTC的一個(gè)關(guān)鍵特征是它能夠侵入鄰近的結(jié)構(gòu)，如淋巴管[19]。BRAF突變是PTC中最常見的遺傳改變，約占PTC的29%~69%[20]。高 細(xì) 胞 變 異 （PTC的 侵 襲 性 變 異）中BRAFV600E突變的高頻率表明BRAFV600E突變可能與PTC侵襲性表型相關(guān)，研究表明，BRAFV600E通過誘導(dǎo)基因組不穩(wěn)定性促進(jìn)了PTC的發(fā)生發(fā)展[21]。TERT是端粒酶的催化亞基，其啟動(dòng)子區(qū)最常見的兩個(gè)突變分別是C228T和C250T，這兩個(gè)突變能夠增強(qiáng)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)甲狀腺癌的發(fā)生[22]。最近，有研究顯示TERT啟動(dòng)子的突變和BRAF突變之間存在一定的相關(guān)性[23]。自TERT突變首次報(bào)道以來，它與BRAF突變被廣泛認(rèn)為與甲狀腺乳頭狀癌的致病機(jī)理有關(guān)[24]。

在本研究中，BRAFV600E啟動(dòng)子突變率為66.18%，突變組與無突變組在年齡、腫瘤大小及送檢淋巴結(jié)數(shù)目之間并無明顯差異（P＞0.05）。TERT啟動(dòng)子突變率為11.76%，突變組的腫瘤明顯大于無突變組（P＜0.05）。BRAFV600E啟動(dòng)子聯(lián)合TERT突變的發(fā)生率為7.35%，突變組的腫瘤明顯大于無突變組（P＜0.05）。對(duì)BRAFV600E及TERT啟動(dòng)子突變與臨床特征之間進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)BRAFV600E是否突變與中央?yún)^(qū)轉(zhuǎn)移之間具有差異性，其突變狀態(tài)與腫瘤組織有無中央?yún)^(qū)轉(zhuǎn)移存在差異 （P＜0.05）；TERT的突變狀態(tài)與腫瘤組織有無腺外浸潤(rùn)存在差異（P＜0.05）；BRAFV600E+TERT啟動(dòng)子的聯(lián)合突變狀態(tài)與腺外浸潤(rùn)、包膜侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有無之間存在差異（P＜0.05）。

綜上，在PTC患者中，BRAFV600E的突變率較高，與患者臨床特征關(guān)聯(lián)性不強(qiáng)，TERT的突變率較低，與患者腫瘤大小相關(guān)，對(duì)PTC患者預(yù)后評(píng)估具有指導(dǎo)意義，同時(shí)出現(xiàn)BRAFV600E及TERT啟動(dòng)子突變的發(fā)生率較低，且與患者的腫瘤轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)存在相關(guān)性，對(duì)PTC風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估有重要價(jià)值。BRAFV600E和TERT啟動(dòng)子的突變情況的檢測(cè)為臨床甲狀腺乳頭狀癌的診治提供了一定的參考價(jià)值，但是其仍有一定的局限性。