基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的多葉棘豆總黃酮抗炎作用機(jī)制研究

楊立國，郝俊生 ，薩其拉吐 ，蘇都那布其，王秀蘭

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028043；2.內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；3.通遼市食品藥品檢驗所，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

多葉棘豆為豆科植物多葉棘豆Oxytropis myriophylla 的干燥全草，味苦、甘，性涼、鈍、輕、糙，具有殺“粘”、清熱、燥“協(xié)日烏素”等功效，臨床上用于瘟疫、發(fā)癥、丹毒等癥，在歷代蒙、藏醫(yī)籍中均有記載，為蒙、藏醫(yī)臨床常用藥［1］。多葉棘豆作為蒙藥最早收載于蒙古族醫(yī)學(xué)專著《認(rèn)藥白晶鑒》中，具有殺“粘”、消腫、解毒的功效，在巴特日七味丸、清感九味丸、額日敦-嘎日迪等蒙藥復(fù)方制劑中廣泛應(yīng)用［2］。幾十年來，中外學(xué)者對蒙藥多葉棘豆的化學(xué)組成進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)多葉棘豆主要含有黃酮類成分［3-12］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，棘豆屬植物大多具有抗炎的功效［13］。然而，雖然多葉棘豆在蒙醫(yī)臨床上已應(yīng)用多年，但多葉棘豆總黃酮抗炎作用機(jī)制仍不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從蒙藥多成分、多靶點的特點出發(fā)，整體上分析闡述蒙藥的作用機(jī)制，利于推進(jìn)蒙藥作用機(jī)制的深入研究［14］。為了深入探討多葉棘豆總黃酮類成分抗炎藥效機(jī)理，筆者擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和技術(shù)，預(yù)測蒙藥多葉棘豆總黃酮類成分發(fā)揮抗炎藥效的靶點和通路，進(jìn)而闡明蒙藥多葉棘豆總黃酮類成分抗炎作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究使用的數(shù)據(jù)庫、研究平臺等詳見表1。

表1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究使用的數(shù)據(jù)庫和平臺Tab. 1 Databases and platforms for network pharmacology research

1.2 多葉棘豆黃酮類成分收集與活性成分篩選

經(jīng)Scifinder和中國知網(wǎng)檢索多葉棘豆化學(xué)成分相關(guān)中英文文獻(xiàn)，總結(jié)國內(nèi)外學(xué)者從多葉棘豆中分離鑒定出的黃酮類化學(xué)成分，再以Swiss ADME中Bioavailability Score參數(shù)對上述黃酮類化學(xué)成分進(jìn)行篩選得到潛在活性成分。

1.3 多葉棘豆黃酮類活性成分靶點預(yù)測

通過PubChem 數(shù)據(jù)庫檢索上述活性成分，將活性成分二維結(jié)構(gòu)Canonical SMILES 格式文件導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，設(shè)置物種為Homo sapiens，預(yù)測活性成分的潛在靶點，刪除Probability值為0的靶點。

1.4 多葉棘豆抗炎作用靶點的收集

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索炎癥相關(guān)靶點，輸入關(guān)鍵詞為inflammation，設(shè)置物種為Homo sapiens，篩選score評分大于10的靶點。將多葉棘豆黃酮類活性成分潛在靶點與炎癥相關(guān)靶點取交集，得到多葉棘豆抗炎作用靶點。

1.5 核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將交集靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，設(shè)置分析生物體為Homo Sapiens，置信度得分設(shè)置為0.9后進(jìn)行分析并保存數(shù)據(jù)（TSV 文件）。將上述文件導(dǎo)至Cytoscape 3.9.1 軟件，通過Network analyzer 模塊分析，構(gòu)建蒙藥多葉棘豆黃酮類成分發(fā)揮抗炎藥效的核心靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.6 GO、KEGG通路富集分析

將交集靶點導(dǎo)至DAVID數(shù)據(jù)庫，設(shè)置相關(guān)參數(shù)，得到GO和KEGG信號通路。

1.7 蒙藥-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將蒙藥多葉棘豆的成分、靶點、疾病數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件，通過Merge工具構(gòu)建蒙藥-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 多葉棘豆黃酮類活性成分

經(jīng)文獻(xiàn)檢索、總結(jié)后發(fā)現(xiàn)，從多葉棘豆中共分離得到黃酮類化學(xué)成分43個［3］，以Swiss ADME中Bioavail?ability Score參數(shù)篩選后得到24個活性成分，其有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫編號、名稱和生物利用度分值詳見表2。

表2 多葉棘豆黃酮類活性成分Tab. 2 Active flavonoids from Oxytropis myriophylla

2.2 多葉棘豆黃酮類活性成分的靶點

對多葉棘豆中24個黃酮類活性成分進(jìn)行靶點預(yù)測，得到化合物1共21個靶點、化合物2共7個靶點、化合物3共101個靶點、化合物4共104個靶點、化合物5共22個靶點、化合物6共21個靶點、化合物7共109個靶點、化合物8共112個靶點、化合物9共127個靶點、化合物10共40個靶點、化合物11共40個靶點、化合物12共119個靶點、化合物13共67個靶點、化合物14共136個靶點、化合物15共34個靶點、化合物16共45個靶點、化合物17共120個靶點、化合物18共20個靶點、化合物19共114個靶點、化合物20共42個靶點、化合物21共134個靶點、化合物22共101個靶點、化合物23共108個靶點、化合物24共45個靶點，刪除重復(fù)靶點，共得到350個有效靶點。

2.3 多葉棘豆抗炎藥效靶點

采用GeneCards數(shù)據(jù)庫搜索炎癥靶點，得到評分大于10的靶點93個。將2.2中多葉棘豆黃酮類活性成分350個有效靶點與上述93個靶點取交集，得到18個多葉棘豆總黃酮抗炎作用靶點，見圖1和表3。

圖1 多葉棘豆總黃酮抗炎作用靶點韋恩圖Fig. 1 Venn diagram of anti-inflammatory targets of total flavonoids from Oxytropis myriophylla

表3 多葉棘豆總黃酮抗炎作用靶點信息Tab. 3 Anti-inflammatory targets information of total flavonoids from Oxytropis myriophylla

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

PPI網(wǎng)絡(luò)共包含18個節(jié)點，89條邊，平均節(jié)點度9.89，平均局部聚類系數(shù)0.828。見圖2。

圖2 多葉棘豆總黃酮抗炎作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)Fig. 2 PPI network of anti-inflammatory targets of total flavonoids from Oxytropis myriophylla

由圖2可知，PTGS2、MMP9、VEGFA、PPARG、STAT3等靶點的度值較高，說明上述靶點在PPI網(wǎng)絡(luò)中作用顯著，提示這些靶點可能在多葉棘豆總黃酮發(fā)揮抗炎作用中有重要作用。

2.5 GO、KEGG富集分析

將多葉棘豆總黃酮抗炎作用靶點上傳至DAVID 平臺，根據(jù)P<0.05為篩選條件，共收集到17條生物學(xué)過程（BP）條目，主要涉及血小板α顆粒腔、富含纖膠凝蛋白1顆粒腔、細(xì)胞表面、胞外空間、大分子復(fù)合物等；26條細(xì)胞組成（CC）條目，主要涉及蛋白復(fù)合物組裝的正向調(diào)節(jié)、肽基-絲氨酸磷酸化的正向調(diào)節(jié)、白細(xì)胞介素-6產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)、對乙醇的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)等；16條分子功能（MF）條目，主要涉及CCR5趨化因子受體結(jié)合、氧化還原酶活性、肽鏈內(nèi)切酶活性、蛋白磷酸酶結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合等。根據(jù)P值，用條形圖列出了BP、CC、MF前10個條目，見圖3。

圖3 關(guān)鍵靶點的生物學(xué)過程（1~10）、細(xì)胞組成（11~20）和分子功能分析（21~30）Fig. 3 Biological process（1~10），cellular component（11~20）and molecular function analysis（21~30）of key targets

將多葉棘豆總黃酮抗炎作用靶點上傳至DAVID 數(shù)據(jù)庫，根據(jù)P<0.05 為篩選條件，共收集到9 條KEGG信號通路，包括炎性腸病、NF-kappa B通路、TNF通路、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Th17細(xì)胞分化、HIF-1信號通路、乙型肝炎、丙型肝炎、JAK-STAT信號通路等，見圖4。

圖4 關(guān)鍵靶點KEGG通路分析Fig. 4 KEGG pathway analysis of key targets

2.6 多葉棘豆總黃酮-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape 3.9.1 軟件繪制多葉棘豆總黃酮活性成分-作用靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，見圖5。圖5 中長方形為藥物，橢圓形為活性成分，菱形為作用靶點，六角形為疾病。按Degree值和BC值大小排序篩選核心成分和核心靶點，結(jié)果顯示5，4’-dihydroxy-7，3’-dimethoxyflavone、5，7-dihydroxy-6，4’-dimethoxyfla?vone、apigenin、luteolin、kaempferol等為核心成分，ABCB1、PTGS2、ALOX5、SYK、NOS2等靶點為核心靶點，可以看出蒙藥多葉棘豆總黃酮多成分-多靶點的作用特點。

圖5 多葉棘豆總黃酮抗炎作用活性成分-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)Fig. 5 Anti-inflammatory active components-key targets network of total flavonoids from Oxytropis myriophylla

3 討論

目前，臨床上對炎癥的治療仍以西藥治療為主，包括使用甾體抗炎藥和非甾體抗炎藥，因合成藥物有較強(qiáng)的毒副作用，越來越多的企業(yè)將抗炎藥物研發(fā)重點放在中藥及天然藥物上［15］。蒙醫(yī)藥學(xué)作為中醫(yī)藥學(xué)的重要組成部分，是蒙古族人民在長期的生產(chǎn)生活實踐中同疾病作斗爭的經(jīng)驗總結(jié)，千百年來世代相傳，形成了今日有系統(tǒng)學(xué)科的民族醫(yī)藥理論體系。由于內(nèi)蒙古地處祖國北疆，大部分地區(qū)氣候寒冷，加之蒙古族人民的游牧生活習(xí)慣，炎癥性疾病是地區(qū)常見病、多發(fā)病，蒙醫(yī)藥在治療該類疾病方面，積累了相當(dāng)豐富的經(jīng)驗，許多行之有效的內(nèi)服藥物應(yīng)用至今，為防治蒙古族人民乃至內(nèi)蒙古地區(qū)其他民族人民的炎癥性疾病作出了重大貢獻(xiàn)［16-18］。多葉棘豆作為常用蒙藥，廣泛應(yīng)用于炎癥性疾病，而發(fā)揮抗炎作用的藥效物質(zhì)很可能是黃酮類成分［19-21］。筆者采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對多葉棘豆總黃酮發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制進(jìn)行了探索，構(gòu)建了多葉棘豆黃酮類成分-靶點-炎癥網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測了多葉棘豆總黃酮發(fā)揮抗炎作用的潛在機(jī)制。首先，從蒙藥多葉棘豆黃酮類活性成分中共得到350個靶點，其中與炎癥交集靶點18個，對上述18個靶點進(jìn)行了GO及KEGG分析。通過18個交集靶點的GO分析可知，生物學(xué)過程、細(xì)胞組成、分子功能等均參與抗炎療效發(fā)揮，表明多葉棘豆總黃酮可通過調(diào)控多個生物學(xué)過程來發(fā)揮抗炎作用。KEGG分析顯示，核心靶點主要富集于NF-kappa B通路、TNF通路等，表明多葉棘豆總黃酮通過不同通路來治療炎癥性疾病。另外，由化學(xué)成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖可得排在前5 位的化學(xué)成分為5，4’-dihydroxy-7，3’-dimethoxyflavone、5，7-dihydroxy-6，4’-dimethoxyflavone、apigenin、luteolin和kaempferol等成分，排在前5位的靶點為ABCB1、PTGS2、ALOX5、SYK、NOS2等靶點。以上結(jié)果充分顯示了多葉棘豆多成分、多靶點治療炎癥的作用特點，既包含蒙醫(yī)藥整體論治的特色，也具有現(xiàn)代醫(yī)學(xué)精準(zhǔn)醫(yī)療的理念，符合蒙醫(yī)藥現(xiàn)代化的方針。綜上，本研究初步揭示了蒙藥多葉棘豆黃酮類成分發(fā)揮抗炎作用的潛在活性成分和可能的作用機(jī)制，為進(jìn)一步深入探討多葉棘豆抗炎藥效物質(zhì)及其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，然而，上述結(jié)論僅是推測，具體機(jī)制我們會通過后續(xù)細(xì)胞水平、動物試驗等手段進(jìn)行進(jìn)一步驗證。