毛鉤藤堿調(diào)控Shh信號通路對結(jié)直腸癌荷瘤鼠的抑瘤作用及CD4+、CD8+T細(xì)胞的影響①

王晨宇 李興旺 張軍杰 姚坤厚 華 龍 胡軍紅（河南大學(xué)淮河醫(yī)院普通外科一病區(qū)，開封 475000）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化道惡性腫瘤，因其進(jìn)展快、惡性程度高嚴(yán)重威脅人類的健康［1］。毛鉤藤堿（hirsutine，HS）為我國傳統(tǒng)中藥鉤藤中的吲哚類生物堿，屬于非競爭性拮抗劑和鈣離子通道阻斷劑，具有降壓、抗感染、心臟保護(hù)及抗腫瘤等藥理活性［2-3］。研究顯示，HS可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)其凋亡［4］，并具有逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌多藥耐藥的作用，但未見其對CRC體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的相關(guān)報(bào)道。Shh（sonic hedgehog）信號通路與消化道多種惡性腫瘤密切相關(guān)［5］。研究顯示Shh信號通路相關(guān)蛋白在食管癌、胃癌及CRC組織中均有高度表達(dá)［6］，HS的抗腫瘤作用是否與此有關(guān)，未見相關(guān)報(bào)道，為此，本研究擬建立CRC裸鼠移植瘤動物模型，觀察Shh信號通路蛋白及CD4+、CD8+T細(xì)胞的變化，進(jìn)一步探討HS抑瘤作用的具體機(jī)制和靶點(diǎn)，為臨床上抗結(jié)腸癌新藥的研制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物BALB/c-nu裸鼠，4～6周齡，雄性，40只，體質(zhì)量18～22 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。動物合格證號：201911179。動物許可證號：SCXK（京）2019-1-003，動物批次號：201907013。

1.1.2藥品與試劑HS（批號：16122-307，純度≥98%，5 mg/支）購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；SW480結(jié)腸癌細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；Shh信號通路特異性抑制劑環(huán)巴胺（cyclopamine）購自美國Sigma公司；兔抗人Glil、Gli2及Shh多克隆抗體購自美國Abcam公司；兔抗人Smo和Ptch1多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；胎牛血清、胰蛋白酶及青霉素-鏈霉素混合液均購自浙江天杭生物科技有限公司。

1.1.3儀器IX73倒置熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯光學(xué)有限公司；BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀購自Beckman公司；B5060EK CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自德國Hearers公司；JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)購自美國Bio-Tek生物儀器有限公司；ZHYLS1C型動物自主活動儀購自安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)復(fù)蘇結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至含10%熱滅活的胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液，迅速置于飽和濕度、37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)并進(jìn)行傳代，收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，用0.5%胰蛋白酶消化傳代，使用PBS溶液配置成細(xì)胞濃度為1.8×107個/ml的細(xì)胞懸液。

1.2.2CRC荷瘤鼠模型建立 將配置好的結(jié)腸癌SW480細(xì)胞混懸液接種于實(shí)驗(yàn)裸鼠的右腋部皮下，每只裸鼠接種0.1 ml，接種5 d后，可觀察到裸鼠接種瘤細(xì)胞的部位出現(xiàn)扁平或橢圓形的包塊，并且逐漸增大，視為裸鼠結(jié)腸癌皮下移植瘤模型建立成功［7］。

1.2.3動物分組和給藥方法 將造模成功的40只BALB/c-nu裸鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為：荷瘤鼠模型組（Model）、陽性藥對照組（環(huán)巴胺組，Cyclopamine）、HS低劑量（HS-low）、HS中劑量（HS-medium）和高劑量組（HS-high），每組8只。在造模第8天，皮下移植瘤直徑生長至1 cm左右時進(jìn)行各組的藥物干預(yù)，陽性藥對照組腹腔注射20 μmol/L環(huán)巴胺0.2 ml，HS干預(yù)組分別腹腔注射5、10、20 mg/kg的HS，荷瘤鼠模型對照組給予等量的生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥21 d。

1.2.4檢測荷瘤鼠體質(zhì)量和相對腫瘤體積的變化 各組于給藥后每天測量每只荷瘤鼠的體質(zhì)量，計(jì)算各組荷瘤鼠平均體質(zhì)量，每天的體質(zhì)量增長率（%）=（m給藥第n天-m給藥第1天）/m給藥第1天×100%。各組荷瘤鼠在停藥后第2天處死前，隔天使用游標(biāo)卡尺測量每只荷瘤鼠腫瘤的短徑（b）與長徑（a），腫瘤體積=（a×b2）×1/2，計(jì)算各組荷瘤鼠平均瘤體積，并計(jì)算相 對 瘤 體 積 增 長 率（%）=（V給藥第n天-V給藥第1天）/V給藥第1天×100%［8］。停藥后第2天，眼眶收集靜脈血后，處死各組裸鼠，無菌操作剝離腫瘤組織，放于分析天平上稱取瘤重，計(jì)算各組平均瘤重，抑瘤率（%）=（m模型組平均瘤重-m實(shí)驗(yàn)組平均瘤重）/m模型組平均瘤重×100%［9］。

1.2.5自主活動實(shí)驗(yàn)檢測荷瘤鼠自主活動次數(shù)的變化 在各組裸鼠處死前每隔1 d觀察小鼠狀態(tài)，并測定各組荷瘤鼠的自主活動次數(shù)。將荷瘤鼠放在動物自主活動儀里適應(yīng)2 min，待小鼠穩(wěn)定后，記錄5 min內(nèi)各組小鼠的自發(fā)活動次數(shù)（隔斷光線活動次數(shù)）［8］。

1.2.6免疫組化法（IHC）檢測荷瘤鼠移植瘤Shh信號通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平 采用10%的中性甲醛固定各組裸鼠無菌操作剝離的腫瘤組織，并制備石蠟切片，脫蠟至水，參考文獻(xiàn)［10-11］的方法進(jìn)行免疫組化法操作，熱抗原修復(fù)，3%H2O2去離子水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉，加入兔抗人Glil（1∶1 000）、Gli2（1∶1 000）、Shh（1∶1 000）多克隆一抗及Smo（1∶1 000）和Ptch1（1∶1 000）多克隆一抗，4℃過夜，二抗（1∶1 000）37℃孵育60 min，DAB顯色，蘇木精染核，二甲苯透明，中性樹膠封固，光學(xué)顯微鏡下觀察。Shh、Ptch1、Smo蛋白以細(xì)胞膜或細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性，Gli1、Gli2蛋白則以細(xì)胞漿或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。高倍鏡視野下各切片根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)（率）的判斷標(biāo)準(zhǔn)，采用Universal Imaging Porporation圖像分析系統(tǒng)和Meta Morph軟件系統(tǒng)分析各組陽性細(xì)胞的IOD值，并進(jìn)行定量分析。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測荷瘤鼠移植瘤和外周血中CD4+及CD8+T細(xì)胞水平 參考文獻(xiàn)［12］的方法制備腫瘤細(xì)胞和外周血細(xì)胞混懸液。外周血細(xì)胞混懸液制備：收集外周血，加入3 ml紅細(xì)胞裂解液低溫裂解10 min，隨后離心（300 r/min，離心半徑15 cm）10 min，分離上清后再次加入3 ml紅細(xì)胞裂解液低溫裂解，再次低溫離心（300 r/min，離心半徑15 cm）10 min后，使用PBS重懸收集細(xì)胞沉淀。腫瘤細(xì)胞混懸液制備：無菌眼科手術(shù)剪破碎移植瘤組織，使用大量程移液槍吹散后過200目細(xì)胞濾網(wǎng)，低溫離心（300 r/min，離心半徑15 cm）10 min，分離上清后使用PBS重懸即可。分別吸取腫瘤和外周血細(xì)胞懸液，加入500 μl Binding Buffer懸浮細(xì)胞，再加入相應(yīng)抗體染色后避光孵育，低溫離心（300 r/min，離心半徑15 cm）10 min后，分離上清，PBS洗滌后使用多聚甲醛定容，在過350目濾網(wǎng)后，流式上機(jī)檢測混懸液中CD4+及CD8+T細(xì)胞水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用±s表示，多組間均數(shù)比較采用oneway ANOVA檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；P＜

0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組CRC荷瘤鼠自主活動次數(shù)比較 如圖1所示，CRC腫瘤的生長明顯影響各組裸鼠的自主活動次數(shù)，隨著時間的推移，各組裸鼠的自主活動次數(shù)均明顯減少。各用藥組用藥7 d后，模型組活動次數(shù)下降最為顯著，與其他各藥物干預(yù)組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。值得注意的是，在HS干預(yù)11 d后，低、高劑量組荷瘤鼠的自主活動次數(shù)與陽性藥環(huán)巴胺組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且HS高劑量組荷瘤鼠的自主活動次數(shù)下降最為緩慢（P＜0.05）。

圖1 各組CRC荷瘤鼠自主活動次數(shù)（±s）Fig.1 Number of autonomous activities of in each group（±s）

2.2各組CRC荷瘤鼠腫瘤質(zhì)量和抑瘤率比較 如圖2、表1所示，與模型組比較，陽性藥環(huán)巴胺組及HS中、高劑量組腫瘤質(zhì)量均顯著降低（P＜0.05），HR低劑量組腫瘤質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與陽性藥環(huán)巴胺組比較，HS各劑量組腫瘤質(zhì)量和抑瘤率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著HR劑量增加，腫瘤質(zhì)量顯著降低，抑瘤率明顯提高。

表1 各組CRC荷瘤鼠腫瘤質(zhì)量和抑瘤率比較（±s，n=8）Tab.1 Comparison of tumor quality and tumor inhibition rate of colorectal cancer-bearing mice in each group（±s，n=8）

表1 各組CRC荷瘤鼠腫瘤質(zhì)量和抑瘤率比較（±s，n=8）Tab.1 Comparison of tumor quality and tumor inhibition rate of colorectal cancer-bearing mice in each group（±s，n=8）

Note：Compared with model group，1）P＜0.05；compared with cyclopamine group，2）P＜0.05.

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圖2 各組CRC荷瘤鼠移植瘤圖示Fig.2 Diagram of transplanted tumors in each group of CRC tumor-bearing mice

2.3各組CRC荷瘤鼠體質(zhì)量增長率和相對腫瘤體積的比較 如圖3所示，各組荷瘤鼠體質(zhì)量增長率增長趨勢基本一致，其中以荷瘤鼠模型組的體質(zhì)量增長率提高最為顯著。與模型組比較，陽性藥環(huán)巴胺組在干預(yù)10 d后，相對腫瘤體積增長率顯著降低（P＜0.05）；HS中、高劑量組在干預(yù)12 d后相對腫瘤體積增長率均顯著降低（P＜0.05），HS低劑量則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與陽性藥環(huán)巴胺組比較，HS各劑量組在干預(yù)12 d后相對腫瘤體積增長率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），隨著HS劑量的增加，相對腫瘤體積增長率明顯降低。

圖3 各組CRC荷瘤鼠體質(zhì)量增長率和相對腫瘤體積增長率比較Fig.3 Weight growth rate and relative tumor volume growth rate of CRC tumor-bearing mice in each group were compared

2.4HS對CRC荷瘤鼠移植瘤中Shh信號通路關(guān)鍵蛋白的影響 如表2所示，與模型組比較，陽性藥環(huán)巴胺組及HR中、高劑量組Shh信號通路關(guān)鍵蛋白Glil、Gli2及Shh、Smo和Ptch1表 達(dá) 量 均 顯 著 降 低（P＜0.05或P＜0.01），而HS低劑量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與陽性藥環(huán)巴胺組比較，HR各劑量組Glil、Gli2及Shh、Smo和Ptch1表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），并且隨著劑量的增加，上述蛋白的表達(dá)量均下降。

表2 各組CRC荷瘤鼠移植瘤中Shh信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)量的比較（±s，n=8）Tab.2 Comparison of expression of key proteins of Shh signaling pathway in transplanted tumors of CRC tumor-bearing mice in each group（±s，n=8）

表2 各組CRC荷瘤鼠移植瘤中Shh信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)量的比較（±s，n=8）Tab.2 Comparison of expression of key proteins of Shh signaling pathway in transplanted tumors of CRC tumor-bearing mice in each group（±s，n=8）

Note：Compared with model group，1）P＜0.05，2）P＜0.01；compared with cyclopamine group，3）P＜0.05，4）P＜0.01.

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2.5HS對CRC荷瘤鼠移植瘤和外周血中CD4+及CD8+T細(xì)胞水平的影響 如表3、圖4、5所示，與模型組比較，陽性藥環(huán)巴胺組及HS中、高劑量組移植瘤和外周血中CD4+及CD8+T細(xì)胞水平均顯著提高（P＜0.05或P＜0.01），而HS低劑量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與陽性藥環(huán)巴胺組比較，HS各劑量組移植瘤和外周血中CD4+及CD8+T細(xì)胞水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），并且隨著劑量的增加，CD4+及CD8+T細(xì)胞水平提高。

圖4 各組CRC荷瘤鼠外周血和移植瘤中CD4+T細(xì)胞水平Fig.4 Levels of CD4+T cells in peripheral blood of CRC tumor-bearing mice and transplanted tumors in each group

表3 各組CRC荷瘤鼠移植瘤和外周血中CD4+及CD8+T細(xì)胞水平的比較（±s，n=8）Tab.3 Comparison of levels of CD4+and CD8+T cells in transplanted tumor and peripheral blood of CRC tumor-bearing mice in each group（±s，n=8）

表3 各組CRC荷瘤鼠移植瘤和外周血中CD4+及CD8+T細(xì)胞水平的比較（±s，n=8）Tab.3 Comparison of levels of CD4+and CD8+T cells in transplanted tumor and peripheral blood of CRC tumor-bearing mice in each group（±s，n=8）

Note：Compared with model group，1）P＜0.05，2）P＜0.01；compared with cyclopamine group，3）P＜0.05，4）P＜0.01.

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圖5 各組CRC荷瘤鼠外周血和移植瘤中CD8+T細(xì)胞水平Fig.5 Levels of CD8+T cells in peripheral blood of CRC tumor-bearing mice and transplanted tumors in each group

3 討論

茜草科植物鉤藤在我國資源豐富，廣泛應(yīng)用于治療心腦血管系統(tǒng)疾病方面，其中HS為其主要的吲哚類生物堿，在抗腫瘤方面表現(xiàn)出較強(qiáng)的藥理學(xué)活性［13］。研究顯示，HS可下調(diào)Bcl-2/Bax蛋白，通過線粒體途徑誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡，同時HS可選擇性誘導(dǎo)多種肺癌細(xì)胞凋亡，并能有效抑制肺癌裸鼠移植瘤的生長［14-16］。HS抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)其凋亡［4］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)HS能有效抑制結(jié)腸癌裸鼠移植瘤的生長，HS的干預(yù)顯著提高荷瘤鼠的自主活動次數(shù)，改善荷瘤鼠的活動狀態(tài)，降低瘤重，并且隨著劑量的增加，抑瘤率明顯提高、相對腫瘤體積增長率明顯降低。本研究還發(fā)現(xiàn)，Shh信號通路特異性抑制劑環(huán)巴胺組在抑瘤作用方面同樣具有較優(yōu)的效果，提示HS對結(jié)腸癌裸鼠的抑瘤作用可能與Shh信號通路有關(guān)。

Shh信號通路在調(diào)控干細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育中具有重要作用，近年來在食管癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了Shh信號的異常激活，通路中的Ptch、Gli基因及蛋白存在明顯的過表達(dá)，抑制Shh信號通路可以下調(diào)腫瘤細(xì)胞的惡性表型，誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡［17-19］。研究顯示，半乳糖凝集素9誘導(dǎo)CRC HT29細(xì)胞凋亡的作用與抑制Shh信號通路有關(guān)［20］。異甾體類生物堿環(huán)巴胺作為Shh信號通路特異性抑制劑在不同時間應(yīng)用均可抑制裸鼠直腸癌移植瘤的生長，表現(xiàn)出了較好的抑瘤作用［21］。在本研究中，陽性藥環(huán)巴胺組在提高荷瘤鼠自主活動次數(shù)，降低瘤重方面同樣具有較好的作用，這與以往報(bào)道一致，同時發(fā)現(xiàn)HS干預(yù)組Shh信號通路關(guān)鍵蛋白Glil、Gli2及Shh、Smo和Ptch1表達(dá)量與環(huán)巴胺組一樣均明顯降低，并且隨著毛鉤藤堿劑量的增加，Shh信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)量呈顯現(xiàn)不同程度的降低，以上均可表明HS對結(jié)腸癌裸鼠的抑瘤作用與Shh信號通路有關(guān)。

研究顯示，CRC組織的發(fā)生發(fā)展與癌組織局部微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及其亞型數(shù)量的變化相關(guān)［22］。CD4+、CD8+T細(xì)胞作為動物體內(nèi)自然發(fā)生的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的重要亞群，廣泛參與多種免疫性疾病，同時還與多種惡性腫瘤有關(guān)［23］。在CRC患者癌組織和癌旁組織中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞水平存在顯著差異，外周血中兩者的比例也明顯增加［24］。多項(xiàng)研究已證實(shí)，CD8+及CD4+水平對判斷CRC患者的預(yù)后有較好的參考價值［25］。在本研究中，環(huán)巴胺組及HS干預(yù)組中瘤體內(nèi)和外周血中CD4+及CD8+T細(xì)胞水平均顯著提高，并且隨著HS劑量的增加，CD4+及CD8+T細(xì)胞水平均呈現(xiàn)不同程度的提高，以上均表明，HS與環(huán)巴胺組在改善結(jié)腸癌裸鼠細(xì)胞免疫功能，提高機(jī)體免疫狀態(tài)方面同樣具有較好的作用，這也可能是HS改善荷瘤鼠的自主活動狀態(tài)，發(fā)揮較好抑瘤作用的另一個原因。

綜上所述，HS對CRC荷瘤鼠可改善荷瘤鼠的自主狀態(tài)，發(fā)揮較好的抑瘤作用，這可能與其抑制Shh信號通路，改善CD4+及CD8+T細(xì)胞水平有關(guān)。