一種基于植物瞬時表達(dá)研制新冠病毒重組蛋白疫苗的方法①

王弘瑞 趙麗娟 房明麗 楊 明（吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)教研室，長春 130021）

新型冠狀病毒又稱為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2），是一種單鏈正股RNA病毒，可引起致命的呼吸道感染，造成肺部炎癥，又稱新冠肺炎（COVID-19）［1-2］。COVID-19具有傳播速度快，潛伏期長，發(fā)病率高等特點(diǎn)，對全球范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生和人類生命安全已造成嚴(yán)重的威脅［3-4］。截至目前，COVID-19疫情已經(jīng)持續(xù)了2年多，然而由于COVID-19疫苗的產(chǎn)能不足及病毒的變異特點(diǎn)，世界各地的衛(wèi)生組織和國家依然處于努力控制COVID-19傳播的狀態(tài)［5］。

SARS-CoV-2表面的刺突（S）蛋白上的受體結(jié)合區(qū)（receptor binding domain，RBD）能識別宿主細(xì)胞膜上的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（angiotensin converting enzyme，ACE2）介導(dǎo)病毒入侵宿主細(xì)胞，S蛋白對于病毒與細(xì)胞受體的結(jié)合及與細(xì)胞膜的融合均發(fā)揮關(guān)鍵作用［6-7］。目前，用于人群接種的幾種COVID-19疫苗，均是以SARS-CoV-2的S蛋白作為靶點(diǎn)［8］。如mRNA疫苗、腺病毒載體疫苗及滅活病毒疫苗等，均能在一定程度上誘導(dǎo)抗S蛋白的中和抗體，阻斷SARS-CoV-2對機(jī)體的侵染［9］。然而這幾種疫苗也表現(xiàn)出了一定的限制性，如mRNA疫苗的成本高且不易保存；腺病毒載體疫苗易引發(fā)血栓問題［10］；滅活病毒疫苗的有效性和安全性也有待進(jìn)一步提高［11］。相比之下，重組蛋白疫苗具有更為平衡的有效性和安全性，且成本較低。對于SARS-CoV-2的重組蛋白疫苗生產(chǎn)的主要問題在于如何選擇一種高效且快速的表達(dá)系統(tǒng)［12］。

常見的蛋白表達(dá)系統(tǒng)有原核表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)及植物表達(dá)系統(tǒng)等。植物的蛋白表達(dá)系統(tǒng)相比于傳統(tǒng)系統(tǒng)具有很多優(yōu)點(diǎn)，如高效、快速、低成本及易擴(kuò)大化生產(chǎn)等［13］。在植物表達(dá)系統(tǒng)中，可以根據(jù)外源基因所在位置可將植物表達(dá)系統(tǒng)分為轉(zhuǎn)基因植物穩(wěn)定表達(dá)以及植物瞬時表達(dá)系統(tǒng)［14］。盡管轉(zhuǎn)基因植物有穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)，但生產(chǎn)穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物品系費(fèi)時費(fèi)力，而且生物安全法規(guī)也禁止在野地中種植轉(zhuǎn)基因植物［15］。因此，采用植物瞬時表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)蛋白則是一種更為快速有效的方法。目前比較成熟的方法是利用根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）將外源質(zhì)粒DNA滲透到植物細(xì)胞中進(jìn)行快速表達(dá)［16］。采用農(nóng)桿菌滲透法不僅可在短時間內(nèi)獲得非常高的蛋白質(zhì)積累，而且還消除了環(huán)境污染的風(fēng)險［17］。因此，基于植物瞬時表達(dá)系統(tǒng)的高產(chǎn)、快速和生物安全性等特點(diǎn)，其成為了基礎(chǔ)研究和重組蛋白疫苗工業(yè)化生產(chǎn)等多種應(yīng)用的最佳選擇之一。

利用農(nóng)桿菌滲透法可以將目的基因?qū)氲街参锛?xì)胞中進(jìn)行瞬時表達(dá)。本氏煙草（Nicotiana benthamiana）因其具有全面的生物學(xué)特性、產(chǎn)量高、多種表達(dá)載體相容性好以及易滲透等優(yōu)點(diǎn)，可作為瞬時表達(dá)重組蛋白的首選植物［18］。采用上述方法進(jìn)行瞬時表達(dá)的蛋白質(zhì)通常會在農(nóng)桿菌滲透后4～8 d達(dá)到積累高峰。此后，通過收獲植物葉片，從中提取目的蛋白并進(jìn)行純化［19］。而純化的重組蛋白疫苗進(jìn)一步通過生化和免疫學(xué)鑒定后，可在動物模型中進(jìn)行功能檢測來評估其有效性［20］。本研究設(shè)計一種采用本氏煙草來瞬時表達(dá)的SARS-CoV-2 S重組蛋白疫苗生產(chǎn)方案，并對此過程和結(jié)果進(jìn)行了詳細(xì)闡述。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)試劑SARS-CoV-2 S重組蛋白基因的根癌農(nóng)桿菌GV3101菌株購自北京博邁生物有限公司，質(zhì)粒系自行構(gòu)建；羧芐青霉素（Carbenicillin）和利福平（Rifampicin）均購自北京博奧拓達(dá)科技有限公司；酵母提取物營養(yǎng)肉湯（YenB）培養(yǎng)基（0.75%酵母提取物和0.8%營養(yǎng)肉湯，pH=7.0）、瓊脂粉均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；2-嗎啉乙磺酸（MES）緩沖液（pH=5.5）購自美國Sigma公 司；PBS緩 沖 液（pH=5.2）、苯 甲 基 磺 酰 氟（PMSF）、鎳離子金屬螯合親和層析介質(zhì)（Ni-NTA）、葡聚糖凝膠G-25、咪唑緩沖液、His-tag抗體、Sepharose和sephedex-G25層析介質(zhì)均購自美國GE Healthcare公司。本氏煙草植物種子由吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部劉金亮教授饋贈；育苗塊購自壽光益園中科農(nóng)資公司）；水溶性肥料購自春天農(nóng)資公司；育苗盒購自蘇州純氧園藝設(shè)施公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器及場地721s可見光分光光度計（Lengquang Tech公司）；臺式恒溫振蕩器（上海習(xí)仁科學(xué)儀器有限公司）；人工氣候植物培養(yǎng)室（博易智匯科技北京有限公司建造）；勻漿機(jī)（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；離心機(jī)（湖南湘立科學(xué)儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1植物煙草的培養(yǎng) 將育苗塊置于育苗盒中，加入約2 L去離子水，浸泡2 h，使育苗塊完全吸水膨脹。向育苗塊的中心播種2～4粒本氏煙草種子，并添加去離子水至育苗塊底部約1/4處，然后將育苗箱放置于人工氣候培養(yǎng)室中，恒溫25℃，相對濕度60%～80%，16 h/8 h的光照條件。約3周后，去除育苗盒蓋，加入2 L（濃度為1.48 g/L）的水溶性肥料繼續(xù)培養(yǎng)，在后續(xù)生長過程中，保持每2～3 d施肥1次。當(dāng)煙草植物在生長第5周時，選擇5片生長旺盛且分布均勻的葉片留下，并摘除其他葉片。當(dāng)煙草生長到第6周時，葉片生長到接近手掌大小，可用于下一步的農(nóng)桿菌滲透。

1.2.2SARS-CoV-2 S重組蛋白農(nóng)桿菌滲透液的制備 構(gòu)建并培養(yǎng)包含SARS-CoV-2 S重組蛋白編碼基因的農(nóng)桿菌，制備農(nóng)桿菌滲透液。首先，構(gòu)建包含SARS-CoV-2 S重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌：將SARS-CoV-2 S蛋白N末端區(qū)域（NTD）中的部分片段與RBD融合，并在其C段加入His-tag便于純化，隨后將該融合蛋白的編碼基因連接到MagnICON植物瞬時表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌GV3101中，從而獲得含有的目的基因的農(nóng)桿菌。

將攜帶有目的基因的農(nóng)桿菌菌株接種于含羧芐青霉素（100 μg/ml）和利福平（333 μg/ml）的5 ml YenB液體培養(yǎng)基中，30℃以200 r/min的條件搖床培養(yǎng)24 h，直到OD600達(dá)到1.0。次日，將5 ml菌液接種于新的100 ml YenB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)約16 h，使其OD600值達(dá)到1.5～1.8。收集菌液，6 000 g離心15 min，棄上清，得到細(xì)菌沉淀，10 ml pH=5.5的MES緩沖液重懸細(xì)菌沉淀，并測量其OD600值。根據(jù)其OD600值用MES緩沖液進(jìn)一步稀釋。

1.2.3農(nóng)桿菌滲透煙葉瞬時表達(dá)SARS-CoV-2 S重組蛋白 需提前12 h左右將待滲透的煙草轉(zhuǎn)移到普通室溫環(huán)境下，葉片輕度脫水有助于液體的滲透。隨后，將制備好的農(nóng)桿菌滲透液倒入燒杯中，每次用注射器吸取大約10 ml的農(nóng)桿菌液用于滲透。選擇待滲透的目標(biāo)葉片，用針頭輕輕在葉片上刺穿1個小孔，然后將注射器的噴嘴對準(zhǔn)小孔，緩慢推動注射器，讓葉片慢慢吸收滲透液。此外，可以在葉子上挑選多個位點(diǎn)來進(jìn)行滲透，以達(dá)到將葉片完全滲透的目的。完成滲透后，添加去離子水至育苗塊底部約1/3處，隨后將育苗盤放回植物培養(yǎng)室，并監(jiān)測煙草葉片的生長狀況。

1.2.4SARS-CoV-2 S重組蛋白的分離、純化及鑒定 需要從滲透后的煙葉中提取和純化SARS-CoV-2 S重組蛋白，并進(jìn)行初步鑒定。煙葉中SARS-CoV-2 S重組蛋白的粗提：收獲滲透后第7天的煙葉，去除葉莖，留下兩側(cè)的葉片。將葉片和1.5倍體積的勻漿液（含2 mmol/L PMSF的PBS，pH=5.2）倒入勻漿機(jī)中，高速攪拌約2 min。接下來，將葉片勻漿液經(jīng)棉質(zhì)紗布過濾轉(zhuǎn)移入250 ml離心桶中，過濾過程需小心用紗布包裹勻漿，輕輕擠壓。將收集的過濾液在4℃下離心30 min（15 000 g），離心2次，隨后調(diào)整pH=5.2，4℃冰箱中過夜，此過程是基于等電點(diǎn)沉淀法來沉淀植物蛋白核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）。接下來，同樣的離心條件去除沉淀后的RuBisCO，將上清液pH值調(diào)回到7.0，再次離心處理。最后將離心獲得的上清液經(jīng)0.45μm的過濾器處理，獲得粗步提純的SARS-CoV-2 S重組蛋白液。SARS-CoV-2 S重組蛋白純化與鑒定：將粗步提純的SARS-CoV-2 S重組蛋白液經(jīng)過鎳離子親和層析柱，基于鎳離子與帶His-tag蛋白的結(jié)合來進(jìn)行純化；接下來，對洗脫的蛋白進(jìn)一步采取分子篩層析（Sephedex G-25）去除咪唑等小分子，最后，對純化的SARS-CoV-2 S重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析。

2 結(jié)果

2.1植物煙草的獲得 培養(yǎng)煙草可以為農(nóng)桿菌的滲透提供健康葉片，用于重組蛋白的表達(dá)。如圖1A、B所示，將育苗箱放置于人工氣候培養(yǎng)室中，維持在恒溫25℃，相對濕度為60%～80%，16 h/8 h的光照條件。約3周后，去掉育苗盒蓋，保持每2～3 d施肥1次，如圖1C所示。當(dāng)煙草生長到第6周時，葉片生長到接近手掌大小，如圖1D所示，可用于下一步的農(nóng)桿菌滲透。

圖1 人工氣候室中植物煙草的培育過程Fig.1 Cultivation process of tobacco plants in artificial climate chamber

2.2獲得SARS-CoV-2 S重組蛋白農(nóng)桿菌滲透液構(gòu)建 如圖2所示構(gòu)建SARS-CoV-2 S重組蛋白疫苗的農(nóng)桿菌。一般來說，用于滲透葉片的單一農(nóng)桿菌的OD600≤0.1。通過上述流程成功獲得可用于表達(dá)SARS-CoV-2 S重組蛋白的農(nóng)桿菌滲透液。

圖2 構(gòu)建SARS-CoV-2 S重組蛋白疫苗的農(nóng)桿菌示意圖Fig.2 Schematic diagram of Agrobacterium tumefaciens for constructing SARS-CoV-2 S recombinant protein vaccine

2.3農(nóng)桿菌滲透煙葉瞬時SARS-CoV-2 S重組蛋白的表達(dá) 采用注射滲透法，將SARS-CoV-2 S重組蛋白農(nóng)桿菌注射到煙葉中，來表達(dá)目的蛋白（如圖3），葉子呈現(xiàn)出了更深的顏色，表面煙葉已成功完成滲透。在小規(guī)模的實(shí)驗(yàn)室中，常用的農(nóng)桿菌滲透法為注射滲透法，它可植物葉片的多個位點(diǎn)進(jìn)行滲透，使植物葉片的利用率更高。該方法可在短時間內(nèi)獲得非常高的蛋白質(zhì)積累。

圖3 農(nóng)桿菌注射滲透法過程Fig.3 Syringe-infiltration process of Agrobacterium tumefaciens

2.4分離、純化及鑒定SARS-CoV-2 S重組蛋白將粗步提純的SARS-CoV-2 S重組蛋白液經(jīng)過鎳離子親和層析柱，對洗脫的蛋白進(jìn)一步采取分子篩層析最終獲得純化后的目的蛋白，見圖4A。對純化的SARS-CoV-2 S重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析，結(jié)果如圖4B、C，采用植物煙草成功的表達(dá)SARS-CoV-2 S重組蛋白，其分子量約為53.2 kD，顯示His-tag抗體可以很好地識別SARS-CoV-2 S重組蛋白。

圖4 SARS-CoV-2 S重組蛋白的純化及SDS-PAGE和Western blot分析Fig.4 Purification of SARS-CoV-2 S recombinant protein and SDS-PAGE with Western blot analysis

采用植物煙草瞬時表達(dá)SARS-CoV-2 S重組蛋白可快速獲得大量所需的目的蛋白，產(chǎn)量約為500μg/g新鮮葉片，表達(dá)量遠(yuǎn)高于常見的哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)。

3 討論

目前，用于重組蛋白生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)有很多，但各有其優(yōu)缺點(diǎn)。比如，原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白質(zhì)缺乏足夠的翻譯后修飾，常影響蛋白疫苗的免疫原性；而酵母、昆蟲及哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在進(jìn)行大量蛋白生產(chǎn)時，需投入大量資金來完善其基礎(chǔ)設(shè)施，從而增加了成本［21］。本研究介紹的基于植物的瞬時蛋白表達(dá)系統(tǒng)對于原核表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)及哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等傳統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)而言，具有多種優(yōu)點(diǎn)，如高效、快速、低成本、不攜帶動物病原體及易擴(kuò)大化生產(chǎn)等［22］。同時，植物表達(dá)系統(tǒng)還可對蛋白質(zhì)進(jìn)行必要的翻譯后修飾，有助于維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和正常功能。此外，隨著瞬時表達(dá)載體技術(shù)的飛躍發(fā)展，植物瞬時表達(dá)系統(tǒng)的靈活性和生產(chǎn)速度是哺乳動物或昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)所無法比擬的。

表達(dá)載體的選擇是植物瞬時表達(dá)系統(tǒng)中非常關(guān)鍵的一環(huán)。近年來基于“解構(gòu)病毒”策略研發(fā)的植物病毒表達(dá)載體因其能快速生產(chǎn)高水平重組蛋白的優(yōu)勢而備受青睞。此外，“解構(gòu)病毒”載體在提高生物安全性，降低環(huán)境風(fēng)險等方面也有一定的優(yōu)勢［23］。常用的“解構(gòu)病毒”載體包括“MagnICON”和“Geminiviral”等?！癕agnICON”載體是一種基于煙草花葉病毒和馬鈴薯X病毒基因組序列的RNA復(fù)制載體。為了在植物中瞬時表達(dá)重組蛋白，需要將目的基因克隆到“MagnICON”載體中，然后將這種攜帶目的基因的植物病毒載體轉(zhuǎn)化入根癌農(nóng)桿菌中［24］。既往研究表明，采用“MagnICON”植物病毒載體進(jìn)行瞬時表達(dá)，每克新鮮葉片可以在接種后的4～8 d內(nèi)生產(chǎn)出多達(dá)5 mg的重組蛋白，是目前已知的植物表達(dá)水平最高的一種“解構(gòu)病毒”載體［25］。因此，植物瞬時表達(dá)系統(tǒng)快速且高效表達(dá)蛋白的能力使其有望成為生產(chǎn)突發(fā)傳染性疾病如SARS-CoV-2蛋白類疫苗的表達(dá)系統(tǒng)之一。