甘薯無(wú)糖組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用

解曉紅，解紅娥，王凌云，王萌，吳宇浩，張鴻興，李江輝

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 棉花研究所，山西 運(yùn)城 044000）

甘薯用途多樣，營(yíng)養(yǎng)豐富，被世界衛(wèi)生組織列為13種最佳蔬菜之首，是現(xiàn)代人追求的功能食品[1-3]。近幾年來(lái)，甘薯種植面積穩(wěn)中有升，但由于種植區(qū)域引種混亂、長(zhǎng)期連作、病蟲(chóng)害綜合防治盲目，使得病毒病發(fā)生日趨嚴(yán)重，造成減產(chǎn)50%～80%，甚至絕收，甘薯病毒病已成為甘薯產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的制約因素[4-6]。甘薯脫毒健康種苗快繁技術(shù)體系的建立[7-9]，很好地解決了病毒病困擾問(wèn)題，但脫毒組培苗在傳統(tǒng)微繁殖中，以蔗糖作為組培苗生長(zhǎng)碳源進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng)，導(dǎo)致脫毒組培苗的光合能力弱，生長(zhǎng)質(zhì)量差[10-11]，組培苗經(jīng)多次繼代快繁后，出現(xiàn)黃、枯葉，莖尖生長(zhǎng)萎靡、死亡，而后又呈二次多頭生長(zhǎng)；加之傳統(tǒng)組培微生物污染嚴(yán)重，生根質(zhì)量差，移栽馴化死苗現(xiàn)象嚴(yán)重，移栽成活率低，難以滿(mǎn)足生產(chǎn)中優(yōu)質(zhì)脫毒健康種苗產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

無(wú)糖培養(yǎng)技術(shù)是環(huán)境控制技術(shù)與組織培養(yǎng)技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，是用CO2代替糖作為碳源使組培苗進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng)，通過(guò)動(dòng)態(tài)調(diào)整CO2濃度，人工控制光、溫度、濕度，優(yōu)化生長(zhǎng)環(huán)境，提高脫毒組培苗的自身光合能力和適應(yīng)外界環(huán)境能力，減少微生物污染率，從而促進(jìn)植株健壯生長(zhǎng)[12-16]。同時(shí)無(wú)糖培養(yǎng)的組培苗可一次性過(guò)渡成苗，提高了培養(yǎng)效率及移栽成活率，縮短了馴化緩苗時(shí)間，有效降低組培苗的生產(chǎn)成本[17]。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者在微環(huán)境控制、CO2影響及裝置、成本分析等方面進(jìn)行了諸多的研究，研究結(jié)果已在花卉、中草藥、馬鈴薯、草莓、花椰菜等多種植物中得到成功應(yīng)用[18]。

本研究探討無(wú)糖培養(yǎng)條件下不同基質(zhì)及濕度對(duì)甘薯組培苗生長(zhǎng)狀況的影響，旨在為提高甘薯組培苗生長(zhǎng)質(zhì)量、改良甘薯種苗（薯）健康繁育提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

晉甘薯9號(hào)、晉甘薯3號(hào)組培苗由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所甘薯室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同基質(zhì)處理對(duì)無(wú)糖培養(yǎng)組培苗影響 將試驗(yàn)基質(zhì)砂子、蛭石裝到無(wú)糖培養(yǎng)盒中，加入適量的營(yíng)養(yǎng)液（硝酸銨鈣2.0 g/L+KH2PO4170 mg/L），使基質(zhì)手握成團(tuán)，指縫不滴水，把剪切成2～3 cm莖段的甘薯組培苗移入培養(yǎng)盒中。為簡(jiǎn)化程序、節(jié)約成本，2種基質(zhì)均不作滅菌處理，定期噴灑營(yíng)養(yǎng)液確保盒內(nèi)濕度在85%以上，每個(gè)處理30盒，每盒移植90苗。15 d調(diào)查組培苗的移栽成活率、細(xì)菌感染率、長(zhǎng)勢(shì)和生根數(shù)等。每處理每次隨機(jī)選取5盒調(diào)查，重復(fù)3次。

1.2.2 基質(zhì)濕度處理對(duì)無(wú)糖培養(yǎng)組培苗影響 以蛭石作為基質(zhì)，加入營(yíng)養(yǎng)液（2 g/L硝酸銨鈣+170 mg/L KH2PO4）。試驗(yàn)設(shè)6個(gè)處理，即蛭石∶營(yíng)養(yǎng)液（g∶mL）A. 660∶880；B. 660∶850；C. 640∶880；D. 640∶850；E. 670∶820；F. 670∶800。每盒移植90苗，用封口膜封閉培養(yǎng)盒。每個(gè)處理30盒。15 d調(diào)查組培苗的爛根率和長(zhǎng)勢(shì)，以組培苗85%生根為標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)生根時(shí)間，每處理每次隨機(jī)選取5盒調(diào)查，重復(fù)3次。

1.2.3 無(wú)糖培養(yǎng)與傳統(tǒng)培養(yǎng)對(duì)比研究 傳統(tǒng)培養(yǎng)：將已接種45～55 d的甘薯組培苗剪切成2～3 cm莖段接種在無(wú)激素添加的MS培養(yǎng)基上，于光強(qiáng)約1 600 μmol/（m2·s）、光周期12 h/d、溫度（28±1）℃條件下進(jìn)行快繁培養(yǎng)，接種450瓶（每瓶6株，共2 700株）。

無(wú)糖培養(yǎng)：將已接種45～55 d的甘薯組培苗剪切成2～3 cm莖段移植到裝有蛭石的無(wú)糖培養(yǎng)裝置中進(jìn)行微繁殖和生根培養(yǎng)。移栽后放入密閉房間培養(yǎng)架上，前2 d不進(jìn)行光照；自第3天始開(kāi)2盞燈，約80 μmol/（m2·s），第8天始開(kāi)4盞燈，約160 μmol/（m2·s），光 照12 h/d，溫 度（28±1）℃。0～5 d脫毒苗處于緩苗期，光合作用較弱，不進(jìn)行CO2供氣；避免培養(yǎng)盒中濕度下降過(guò)快，植株發(fā)生萎蔫[17]。第5天開(kāi)始供CO2200～600 mL/min，第10天開(kāi)始供CO22 000 mL/min。CO2工作時(shí)間同光照時(shí)間一致，12 h/d。移植30盒（每盒90株，共2 700株）。

30 d后，每處理每次隨機(jī)選取450株（5盒無(wú)糖培養(yǎng)、75瓶傳統(tǒng)組培），調(diào)查傳統(tǒng)組培和無(wú)糖培養(yǎng)的污染率，重復(fù)3次；同時(shí)每重復(fù)隨機(jī)選取20個(gè)植株調(diào)查株高、根數(shù)、根長(zhǎng)、單株鮮質(zhì)量和株干質(zhì)量等。

1.2.4 組培苗網(wǎng)棚移栽 傳統(tǒng)組培苗移栽參照“甘薯脫毒苗圃地直接移栽技術(shù)研究”[19]。

無(wú)糖培養(yǎng)組培苗外移。無(wú)糖培養(yǎng)25 d后，打開(kāi)上盒蓋，在自然條件下進(jìn)行煉苗過(guò)渡，第3天視基質(zhì)干濕程度適當(dāng)噴水，4～5 d外移溫室。從無(wú)糖培養(yǎng)盒中直接拿出組培苗，移栽到溫室土壤中，溫室土壤濕度13%～14%，環(huán)境濕度75%以上。

分3次移栽，傳統(tǒng)組培和無(wú)糖培養(yǎng)每次各移栽900株，7 d調(diào)查不同培養(yǎng)方式甘薯組培苗移栽的成活率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 27.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)糖培養(yǎng)中不同基質(zhì)對(duì)培養(yǎng)效果的影響

結(jié)果表明，以透氣性好、保水性能佳、污染源少的蛭石為作基質(zhì)，晉甘薯3號(hào)和晉甘薯9號(hào)組培苗細(xì)菌（霉菌）感染率分別為1.18%和0.96%，成活率99%以上，組培苗葉綠、生長(zhǎng)健壯。以砂子作基質(zhì)，晉甘薯3號(hào)和晉甘薯9號(hào)的細(xì)菌（霉菌）感染率分別為12.74%和10.59%，成活率分別為79.26%和93.04%（表1），可見(jiàn)，以蛭石作為基質(zhì)無(wú)糖培養(yǎng)效果明顯優(yōu)于砂子。此外，同種基質(zhì)培養(yǎng)下，晉甘薯9號(hào)的各指標(biāo)均優(yōu)于晉甘薯3號(hào)。

表1 基質(zhì)對(duì)無(wú)糖培養(yǎng)效果的影響（15 d）Tab.1 Effects of substrate on sugar free culture（15 d）

2.2 蛭石濕度對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響

基質(zhì)濕度是影響通氣性、微生物活動(dòng)重要因素之一，對(duì)組培苗生長(zhǎng)、誘發(fā)新根和成活起關(guān)鍵作用[19]。以蛭石為培養(yǎng)基質(zhì)，硝酸銨鈣2.0 g/L+KH2PO4170 mg /L作營(yíng)養(yǎng)液，研究濕度對(duì)試管苗生長(zhǎng)和移栽成活率的影響，結(jié)果表明，晉甘薯3號(hào)和晉甘薯9號(hào)均表現(xiàn)為F處理組培苗生長(zhǎng)及生根最好，其爛根率分別為6.21%和0.59%，生根天數(shù)約為8 d，原因可能是由于濕度比較小維持了基質(zhì)的通透性，便于組培苗根系的營(yíng)養(yǎng)吸收和呼吸。A、B、C、D處理由于濕度大，影響了通氣性，使組培苗根系呼吸、生長(zhǎng)受阻，造成組培苗感染病菌腐爛死亡（表2）。

表2 蛭石濕度對(duì)試管苗生長(zhǎng)的影響Tab.2 Effect of vermiculite humidity on the growth of test tube seedlings

2.3 傳統(tǒng)組培和無(wú)糖培養(yǎng)對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響

分別將2個(gè)處理的組培苗取出，洗凈基部培養(yǎng)基及基質(zhì)，測(cè)定株高、根數(shù)、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量，結(jié)果如表3所示，晉甘薯3號(hào)、晉甘薯9號(hào)無(wú)糖培養(yǎng)的株高較傳統(tǒng)組培分別高0.477、0.882 cm，差異顯著（P＜0.05）；生根數(shù)分別增加2.04、2.32條/株，差異顯著（P＜0.05）；根長(zhǎng)差異不顯著。單株鮮質(zhì)量分別平均增加2 613.9、2 654.7 mg，差異顯著（P＜0.05）；單株干質(zhì)量分別平均增加265.3、258 mg，差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）；無(wú)糖培養(yǎng)污染率分別為1.18%、0.96%，傳統(tǒng)組培污染率分別為15.11%、10.22%，差異極顯著（P＜0.01）。無(wú)糖培養(yǎng)條件下，甘薯組培苗通過(guò)光合自養(yǎng)合成自身所需的有機(jī)物，生長(zhǎng)速度快，生長(zhǎng)健壯。培養(yǎng)30 d統(tǒng)計(jì)組培苗生長(zhǎng)情況，無(wú)糖培養(yǎng)植株葉片增大，較直立，葉色濃綠，組培苗健壯；傳統(tǒng)組培植株葉片細(xì)小，有黃葉、枯葉（圖1）。

表3 不同培養(yǎng)方式對(duì)甘薯組培苗生長(zhǎng)的影響（30 d）Tab.3 Effects of different culture modes on growth of sweet potato tissue culture seedlings（30 d）

圖1 不同培養(yǎng)方式甘薯組培苗生長(zhǎng)對(duì)比Fig.1 Comparison of sweet potato tissue culture seedlings under different culture modes

2.4 傳統(tǒng)組培和無(wú)糖培養(yǎng)對(duì)組培苗移栽成活率的影響

溫室移栽7 d調(diào)查統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，無(wú)糖培養(yǎng)的晉甘薯3號(hào)和晉甘薯9號(hào)移栽成活率分別為97.74%和98.30%；傳統(tǒng)組培二者移栽成活率分別為90.04%和91.15%，差異顯著（P＜0.05）（表4），可見(jiàn)，無(wú)糖培養(yǎng)移栽的組培苗較傳統(tǒng)組培的組培苗緩苗時(shí)間短，成活率高?？赡苁且?yàn)闊o(wú)糖培養(yǎng)過(guò)程中自身合成的光合產(chǎn)物促進(jìn)了組培苗根系快速生長(zhǎng)，生根數(shù)量增加，根系粗壯，有韌性；傳統(tǒng)組培的組培苗從恒溫恒濕的異養(yǎng)環(huán)境移栽到網(wǎng)棚后，有些組培苗不能適應(yīng)自養(yǎng)環(huán)境而死亡。

表4 不同培養(yǎng)方式甘薯組培苗移栽成活率的影響（7 d）Tab.4 Effect of different culture modes on transplanting survival rate of sweet potato tissue culture seedlings（7 d）

3 結(jié)論與討論

無(wú)糖培養(yǎng)技術(shù)是環(huán)境控制技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)的結(jié)合，很好地解決了傳統(tǒng)有糖培養(yǎng)中微生物污染嚴(yán)重、植株生理代謝異常、生長(zhǎng)細(xì)弱、馴化階段植株死亡率高等問(wèn)題。甘薯無(wú)糖培養(yǎng)需要強(qiáng)制通入CO2，增加光照強(qiáng)度，促進(jìn)組培苗進(jìn)行光合作用生產(chǎn)有機(jī)物來(lái)維持和促進(jìn)生長(zhǎng)，所以進(jìn)行無(wú)糖培養(yǎng)的組培苗必須具有一定葉面積的外植體[14]。本試驗(yàn)中，采用已接種45～55 d組培苗剪切成2～3 cm莖段，帶有2～4個(gè)葉片，組培苗能充分進(jìn)行光合作用，生產(chǎn)的有機(jī)物促使組培苗生長(zhǎng)加快，葉片增大，葉色濃綠，根系發(fā)達(dá)，苗木健壯。此外，甘薯無(wú)糖培養(yǎng)需要一定基質(zhì)作為支撐物，基質(zhì)的通氣性和濕度是微生物活動(dòng)的重要因素之一，對(duì)組培苗生長(zhǎng)、誘發(fā)新根和成活起關(guān)鍵作用。選擇透氣性好、保水性能佳、污染源少的的蛭石作為支撐物，維持了基質(zhì)的通透性，可促進(jìn)組培苗根系營(yíng)養(yǎng)吸收和呼吸，組培苗生長(zhǎng)健壯，可以不經(jīng)過(guò)馴化階段直接移栽，縮短了培養(yǎng)周期。另外，試驗(yàn)選擇硝酸銨鈣2 g/L+磷酸二氫鉀170 mg/L代替MS作為營(yíng)養(yǎng)液澆灌，滿(mǎn)足了組培苗生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)，簡(jiǎn)化了程序，節(jié)約了生產(chǎn)成本。

作為一種新的培養(yǎng)方法，無(wú)糖培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成功在部分植物中得到廣泛應(yīng)用。屈云慧等[16]研究表明，情人草組培苗在不同基質(zhì)中無(wú)糖培養(yǎng)較傳統(tǒng)組培根數(shù)增加7～9條，根長(zhǎng)增加0.40～1.05 cm，生根率提高10.0%～18.3%。淡明等[20]研究認(rèn)為，甘蔗無(wú)糖培養(yǎng)株高較常規(guī)培養(yǎng)高1.03 cm，差異不顯著，無(wú)糖培養(yǎng)的植株鮮質(zhì)量比常規(guī)培養(yǎng)的多0.73 g，生根數(shù)和根長(zhǎng)分別為3.60條/株和1.08 cm，與常規(guī)培養(yǎng)差異顯著。肖玉蘭等[21]以非洲菊試管苗為試材，用MS無(wú)糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，采用2孔透氣封口膜，濾膜微孔直徑0.5 μm，在光照8 000 lx+CO23 920 mg/m3條件下，植株生根快，健壯，葉片大，干物質(zhì)含量高。張婕等[22]對(duì)黃菖蒲無(wú)糖培養(yǎng)研究認(rèn)為，無(wú)糖培養(yǎng)組培苗株高、葉長(zhǎng)、葉數(shù)、根長(zhǎng)和根數(shù)等生長(zhǎng)指標(biāo)高于傳統(tǒng)組培方式，且增加濃度能大大加快植株生長(zhǎng)速度。我們?cè)诟适砩系难芯窟M(jìn)一步支持了這些結(jié)果。隨著植物無(wú)糖培養(yǎng)技術(shù)理論體系的日臻成熟，這一技術(shù)將以低成本生產(chǎn)高質(zhì)量微扦插種苗的優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用于植物工廠化、規(guī)?；a(chǎn)中。

本研究獲得了無(wú)糖培養(yǎng)的適宜基質(zhì)為蛭石，最佳濕度為蛭石∶營(yíng)養(yǎng)液（g∶mL）=670∶800，與傳統(tǒng)組培比較顯著提高了甘薯組培苗生長(zhǎng)質(zhì)量和移栽成活率。研究?jī)H從無(wú)糖培養(yǎng)的基質(zhì)及其濕度對(duì)甘薯組培苗生長(zhǎng)質(zhì)量方面進(jìn)行了初步的探討研究，對(duì)于甘薯無(wú)糖培養(yǎng)組培苗最適宜光合速率的最佳CO2濃度、最佳光照強(qiáng)度等問(wèn)題還需進(jìn)一步深入探討。