邊雞源乳酸菌飼喂雛雞免疫效果初探

肖明婧，楊逢清，閆芳

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801）

由于濫用抗生素，導(dǎo)致大量耐藥細(xì)菌，特別是多重耐藥致病菌的出現(xiàn)，并廣泛傳播，不僅給人類健康造成重大威脅，也導(dǎo)致家畜致病和致死率的上升[1]。目前，已開發(fā)出多種飼料中添加的抗生素替代物，主要包括生物酶制劑、益生菌、合生素和中藥提取物等，其中益生菌在養(yǎng)殖業(yè)中的發(fā)展勢(shì)頭迅猛，應(yīng)用廣泛，并已取得良好的效果[2]。

乳酸菌因其可產(chǎn)生抵抗外界病原微生物入侵的相關(guān)代謝產(chǎn)物而備受關(guān)注，這些物質(zhì)可抑制致病微生物的生長(zhǎng)、定植和感染宿主消化道，并可維持宿主消化道的健康和菌群平衡[3]。機(jī)體免疫細(xì)胞在乳酸菌菌體和其代謝產(chǎn)物的刺激下，產(chǎn)生了可增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答的一系列物質(zhì)[4]。王蕾等[5]研究表明，采用乳酸菌灌胃后，動(dòng)物的飼料轉(zhuǎn)化率提高，免疫力增強(qiáng)，生產(chǎn)性能得到很大提升。

邊雞是一種適宜在晉北地區(qū)飼養(yǎng)的地方品種，具有較強(qiáng)的抗病力和適應(yīng)性，在耐粗飼方面表現(xiàn)優(yōu)良，因其蛋肉兩用性受到消費(fèi)者歡迎，被列入農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《畜禽遺傳資源保護(hù)名錄》[6]。本研究分離了邊雞腸道中3株優(yōu)勢(shì)乳酸菌，通過比較添加混合乳酸菌與添加抗生素對(duì)雛雞體質(zhì)量、免疫力、抗氧化能力和抗體水平等指標(biāo)的影響，旨在進(jìn)一步探究將乳酸菌作為飼料添加劑替代抗生素的可行性。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1日齡雞雛100只（山西康牧養(yǎng)殖專業(yè)合作社）。G（唾液乳桿菌，GenBank登錄號(hào)：MN448316）、Y（植物乳桿菌，GenBank登錄號(hào)：MT645503）和F（嗜酸乳桿菌，GenBank登錄號(hào)：MT645504）3株乳酸菌菌株均分離自邊雞小腸。乳酸菌細(xì)菌培養(yǎng)基購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司，血清免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）和抗氧化試劑盒購(gòu)自太原安尼摩爾生物科技有限公司，雞新城疫（NDV）疫苗La Sota株購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司、新城疫抗原和陽(yáng)性血清購(gòu)自北京擎科生物有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 混合菌液制備 分別于MRS液體培養(yǎng)基中接種G、Y、F等3種菌株，37 ℃下?lián)u菌24～48 h，培養(yǎng)至活菌數(shù)達(dá)1.0×1010cfu/mL后，用生理鹽水稀釋至活菌數(shù)分別為1.0×109、1.0×108cfu/mL。將3株不同濃度乳酸菌按照體積比為1∶1∶1混合，配制成3種濃度的混合菌液。

1.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物的分組、飼養(yǎng)管理和免疫接種 根據(jù)《飼料添加劑安全使用規(guī)范》[7]和《微生物飼料添加劑通用要求》[8]設(shè)計(jì)試驗(yàn)。選取體質(zhì)量相近的1日齡雛雞100只，隨機(jī)分成對(duì)照組、抗生素添加組（50 mg/kg金霉素）和高劑量（1.0×1010cfu/mL）、中劑量（1.0×109cfu/mL）、低劑量（1.0×108cfu/mL）混合乳酸菌組，每組20只。預(yù)飼期1～7 d，飼喂相同日糧，試驗(yàn)期8～42 d，混合乳酸菌組每日灌服不同濃度的乳酸菌1 mL/只，對(duì)照組和抗生素組灌服等量生理鹽水。人工飼喂，自由采食飲水，溫度為25 ℃，相對(duì)濕度為50%～60%，定期通風(fēng)。在第7天和第25天，采用常規(guī)免疫方法（滴鼻點(diǎn)眼）給所有雞雛接種NDV疫苗。

1.2.3 免疫指標(biāo)測(cè)定 試驗(yàn)第6、24、42天，每組選取6只雛雞采血，離心后將血清用于血凝試驗(yàn)（HA）和血凝抑制試驗(yàn)（HI）以測(cè)定NDV抗體效價(jià)。預(yù)飼期第7天空腹稱質(zhì)量，42 d采血，分離血清后冷凍保存，用于抗氧化指標(biāo)和血清免疫球蛋白含量的測(cè)定。采血后屠宰，分離胸腺、脾臟和法氏囊后稱質(zhì)量，計(jì)算免疫器官指數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

分別采用Excel 2016和SPSS 21.0對(duì)雛雞體質(zhì)量、免疫器官指數(shù)、血清免疫球蛋白含量、血清抗氧化指標(biāo)、新城疫抗體（NDV）效價(jià)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加混合乳酸菌對(duì)雛雞體質(zhì)量的影響

7、42 d時(shí)各組雛雞體質(zhì)量比較如表1所示。

表1 7、42 d時(shí)各組雛雞體質(zhì)量比較Tab.1 The comparison of body weight of chicks in different groups at 7 days and 42 days g

由表1可知，7 d時(shí)各試驗(yàn)組與對(duì)照組體質(zhì)量無 顯著差異（P＞0.05），42 d時(shí)各試驗(yàn)組與對(duì)照組雛雞體質(zhì)量差異顯著（P＜0.05），中劑量組的體質(zhì)量與抗生素組無顯著差異（P＞0.05）。說明在灌服混合乳酸菌后雛雞體質(zhì)量增長(zhǎng)較快，促生長(zhǎng)效果顯著（P＜0.05）。

2.2 混合乳酸菌對(duì)雛雞免疫器官指數(shù)的影響

由圖1可知，脾臟、胸腺、法氏囊等免疫器官指數(shù)在服用混合乳酸菌后，試驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）；雖然中劑量組在數(shù)值上高于抗生素組，但差異不顯著（P＞0.05）。說明各免疫器官在灌服受試物后生長(zhǎng)發(fā)育速度較快，灌服該受試物后可提高雛雞抵抗外界應(yīng)激的能力。

圖1 各組雛雞免疫指數(shù)比較Fig.1 The comparison of immunity indexes of chicks in different groups

2.3 混合乳酸菌對(duì)雛雞血清免疫球蛋白的影響

各組雛雞血清免疫球蛋白含量比較結(jié)果如圖2所示。

圖2 各組雛雞血清免疫球蛋白含量比較Fig.2 The comparison of serum immunoglobulin content of chicks in different groups

由圖2可知，服用混合乳酸菌后各劑量組和抗生素組與對(duì)照組血清中IgA含量差異顯著（P＜0.05），中劑量組和抗生素組IgA含量無顯著差異（P＞0.05）。各劑量組和抗生素組與對(duì)照組血清中IgG含量差異顯著（P＜0.05），中劑量組與抗生素組和高劑量組之間無顯著差異（P＞0.05），且抗生素組與高劑量組之間也無顯著差異（P＞0.05）。各劑量組和抗生素組與對(duì)照組血清IgM含量差異顯著（P＜0.05），IgM含量中劑量組高于抗生素組，但差異不顯著（P＞0.05）。以上結(jié)果說明混合乳酸菌液可提高雛雞血清中的免疫球蛋白含量，增強(qiáng)雛雞免疫力。

2.4 混合乳酸菌對(duì)雛雞血清抗氧化指標(biāo)的影響

從圖3可以看出，高劑量組和抗生素組與對(duì)照組的MDA含量差異顯著（P＜0.05），而對(duì)照組和低劑量組無顯著性差異（P＞0.05），中、高劑量組和抗生素組的MDA含量差異不顯著（P＞0.05）。各劑量組與對(duì)照組的T-AOC含量差異顯著（P＜0.05），中劑量組與抗生素組無顯著性差異（P＞0.05）。高劑量組和抗生素組與對(duì)照組的SOD含量差異顯著（P＜0.05），中劑量組和抗生素組之間差異不顯著（P＞0.05）。各劑量組與對(duì)照組的GSHPx含量均存在顯著差異（P＜0.05），中劑量組高于抗生素組，但差異不顯著（P＞0.05）。上述研究結(jié)果表明，混合乳酸菌可有效提高血清中抗氧化物含量，提高機(jī)體抗氧化能力。

圖3 各組雛雞血清抗氧化指標(biāo)比較Fig.3 The comparison of serum antioxidant indexes of chicks in different groups

2.5 混合乳酸菌對(duì)雛雞新城疫抗體效價(jià)的影響

由表2可知，試驗(yàn)組雛雞NDV母源抗體第6天時(shí)轉(zhuǎn)為陰性。相比第6天，各組NDV抗體效價(jià)第24天時(shí)顯著上升，且試驗(yàn)組與對(duì)照組之間差異顯著（P＜0.05），中劑量組和抗生素組間無顯著差異（P＞0.05）；在第2次免疫后，42 d時(shí)，各組NDV抗體效價(jià)均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），中劑量組和抗生素組無顯著差異（P＞0.05）。

表2 各組雛雞新城疫抗體（NDV）效價(jià)比較Tab.2 Titer comparison of newcastle disease antibody（NDV） of chicks in different groups

3 結(jié)論與討論

3.1 添加混合乳酸菌對(duì)雛雞體質(zhì)量的影響

體質(zhì)量變化可直觀地反映益生菌對(duì)動(dòng)物機(jī)體的影響。益生菌的促生長(zhǎng)作用已得到廣泛證實(shí)，益生菌可通過調(diào)節(jié)腸道菌群平衡提高動(dòng)物的消化吸收能力并起到促生長(zhǎng)作用[9]。黃騰等[10]研究發(fā)現(xiàn)，使用植物乳桿菌飼喂蛋雞后增質(zhì)量效果明顯，與本研究結(jié)果一致。表明添加抗生素和乳酸菌均可提高動(dòng)物體質(zhì)量，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，且乳酸菌在一定程度上可替代抗生素在飼料中添加。

3.2 添加混合乳酸菌后對(duì)雛雞免疫器官指數(shù)的影響

胸腺、脾臟和法氏囊是家禽中樞免疫、外周免疫和體液免疫的主要器官，上述器官的發(fā)育情況直接反映了機(jī)體的免疫水平，免疫器官相對(duì)質(zhì)量的提高則反映了機(jī)體免疫系統(tǒng)的成熟和免疫功能的增強(qiáng)[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，添加不同劑量的混合乳酸菌可刺激雛雞免疫器官的生長(zhǎng)發(fā)育，各組免疫器官指數(shù)與抗生素組無顯著差異，但高劑量組并未表現(xiàn)出更好的效果，這與袁林等[13]的研究結(jié)果一致，說明給雛雞飼喂一定劑量的混合乳酸菌可促進(jìn)其免疫器官的生長(zhǎng)發(fā)育。

3.3 添加混合乳酸菌對(duì)雛雞血清免疫球蛋白水平的影響

血清免疫球蛋白在機(jī)體免疫活動(dòng)過程中發(fā)揮著重要作用，免疫球蛋白是一類機(jī)體應(yīng)對(duì)外界病原入侵過程中發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)分子，血清中此類物質(zhì)的含量與機(jī)體抵抗外界病原入侵的能力有關(guān)[14]。IgG在病原微生物入侵機(jī)體的早期發(fā)揮了重要作用；IgM是分子量較大的免疫球蛋白，在病原微生物入侵早期發(fā)揮作用，但作用時(shí)間較短；IgA則主要在黏膜免疫中發(fā)揮作用，通過非特異性免疫協(xié)同作用清除機(jī)體內(nèi)的有害微生物[14]。本研究中，添加混合乳酸菌后，血清中的免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）含量相比對(duì)照組顯著提高，與袁文華[15]、賀馭[16]、邵洪偉[17]、周凌博等[18]的研究結(jié)果一致。中劑量組（1.0×109cfu/mL）與抗生素組的免疫球蛋白水平無顯著差異，可以在一定程度上替代抗生素的使用。

3.4 添加混合乳酸菌對(duì)雛雞抗氧化功能的影響

動(dòng)物機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)之間存在動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系，當(dāng)動(dòng)物患病或應(yīng)激時(shí)，產(chǎn)生的過量自由基若無法及時(shí)清除會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的損傷[19]，破壞正常細(xì)胞功能[20]。GSH-Px、SOD、T-AOC、MDA在機(jī)體抗氧化過程中發(fā)揮著重要作用，是衡量機(jī)體氧化和抗氧化能力的重要指標(biāo)[20]。本研究結(jié)果顯示，添加混合乳酸菌能顯著提升機(jī)體中GSH-Px、SOD、T-AOC的含量并降低MDA的含量，且中劑量組（1.0×109cfu/mL）與抗生素組無顯著差異。李樂[21]和劉硯涵等[22]研究也表明，采用乳酸菌飼喂蛋雞可增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力，加快蛋雞的生長(zhǎng)速度，并可替代抗生素在飼料中使用。

3.5 添加混合乳酸菌對(duì)新城疫抗體效價(jià)的影響

在家禽生產(chǎn)中，使用疫苗防控禽類流行性疾病的發(fā)生已成為主要手段[20]。沈玉林等[23]研究發(fā)現(xiàn)，疫苗的免疫效果受外界因素影響較大，飼料中霉菌和真菌產(chǎn)生的有害物質(zhì)帶來的疫苗效價(jià)抑制問題已成為養(yǎng)殖過程中一個(gè)不可忽視的因素。王興勇等[24]研究發(fā)現(xiàn)，疫苗的效價(jià)與采用的生物安全防治措施有關(guān)，通過添加具有免疫增強(qiáng)效果的物質(zhì)可提高機(jī)體的免疫力，目前已成為養(yǎng)殖和獸藥生產(chǎn)部門研發(fā)過程中的重點(diǎn)。本研究表明，NDV抗體水平在飼喂混合乳酸菌液后明顯提高，24 d時(shí)對(duì)雛雞進(jìn)行抗體水平檢測(cè)可見抗體水平上升，二次免疫后，抗體水平仍較高，說明在上述免疫方案下，將乳酸菌結(jié)合NDV疫苗使用，可顯著增強(qiáng)免疫效果。中劑量組（1.0×109cfu/mL）與抗生素組抗體水平無顯著差異（P＞0.05），但高劑量組并未體現(xiàn)出免疫增強(qiáng)作用，表明試驗(yàn)結(jié)果受混合乳酸菌濃度的影響。

灌服乳酸菌混合液對(duì)雛雞的體質(zhì)量和免疫器官的發(fā)育具有促進(jìn)作用，并提高了免疫力和機(jī)體清除氧化自由基的能力以及NDV抗體效價(jià)水平。本研究建議在飼料中添加混合乳酸菌的最佳濃度為1.0×109cfu/mL，在此濃度下與抗生素具有相近效果。