N6-甲基腺苷相關(guān)lncRNAs是預(yù)測(cè)腎癌患者預(yù)后和免疫浸潤的潛在生物標(biāo)志物①

肖勝英 閆志廣 曾福仁 邱 俊 盧義晨 朱小東

（湖南省人民醫(yī)院（湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科），長沙 410016）

據(jù)美國癌癥協(xié)會(huì)推測(cè)，2021 年將出現(xiàn)超過76 080 例腎癌（renal cell carcinoma，RCC）新病例，約13 780 例將死于該病［1］。隨著診斷技術(shù)、手術(shù)和分子治療的進(jìn)步，腎癌患者的預(yù)后得到顯著改善。然而，晚期腎癌患者的預(yù)后仍然很差，五年生存率約為11%［2］。據(jù)報(bào)道，分子標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用可為癌癥患者提供預(yù)后價(jià)值［3］。

N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修飾是在真核生物的mRNA、miRNA、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和其他RNA 分子上發(fā)現(xiàn)的最常見和最豐富的修飾之一。這些修飾是可逆的，可影響RNA 分子的轉(zhuǎn)錄、加工、翻譯和代謝［4］。m6A 修飾受m6A 調(diào)節(jié)器調(diào)控，包括“寫入器”（甲基轉(zhuǎn)移酶）、“讀取器”（識(shí)別蛋白）和“擦除器”（去甲基化酶）［5］。m6A 調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的關(guān)鍵生物過程，包括干細(xì)胞更新、細(xì)胞分化和對(duì)DNA 損傷的反應(yīng)［6］。m6A 調(diào)節(jié)因子的異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生、免疫調(diào)節(jié)異常和惡性腫瘤進(jìn)展有關(guān)［6-7］。有報(bào)道稱，甲基轉(zhuǎn)移酶樣因子14（METTL14）的表達(dá)水平與腎癌的病理和臨床分期呈負(fù)相關(guān)，但與總生存期（overall survival，OS）呈正相關(guān)［8］。因此，m6A 調(diào)節(jié)的lncRNAs可能對(duì)癌癥的增殖和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要［4］。研究證明，m6A 調(diào)節(jié)因子的失調(diào)與腎癌的發(fā)生有關(guān)［9］。然而，m6A 調(diào)節(jié)因子對(duì)lncRNA 的作用機(jī)制尚不明確。因此，了解腎癌中m6A 相關(guān)lncRNAs 的具體機(jī)制有助于識(shí)別腎癌的治療靶點(diǎn)和與其預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物。

本研究從癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫中提取了14 087 個(gè)lncRNAs 表達(dá)譜，通過生物信息學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析鑒定了m6A 相關(guān)的lncRNAs。結(jié)果表明，27個(gè)m6A相關(guān)lncRNAs在腎癌中具有預(yù)后價(jià)值。此外，本研究構(gòu)建了一個(gè)新的預(yù)后模型，即9 個(gè)m6A相關(guān)的lncRNAs的預(yù)后簽名（m6A-LPS），該模型用于預(yù)測(cè)腎癌患者的OS。此外，本研究分析了不同亞組間腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）和免疫相關(guān)性的差異，以闡明免疫細(xì)胞浸潤及其與臨床預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 資料 于2021 年4 月從TCGA 數(shù)據(jù)門戶（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載腎癌患者的RNA-seq 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)。共得到539 個(gè)腎癌樣本和72 個(gè)鄰近正常組織數(shù)據(jù)，納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理證實(shí)的腎癌；②同時(shí)獲得的關(guān)于mRNA表達(dá)譜和OS 的信息。最后納入530 例腎癌患者和相應(yīng)臨床病理信息（年齡、生存時(shí)間、生存狀態(tài)、性別、分級(jí)和TNM 分期）進(jìn)一步分析。使用caret 包將530 例腎癌患者隨機(jī)分配到訓(xùn)練集（266 例患者）或驗(yàn)證集（264 例患者）隊(duì)列。表1 為兩個(gè)隊(duì)列的臨床病理特征基線資料。根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)確定了23個(gè)m6A 相關(guān)基因，包括“寫入器”［METTL3、METTL14、METTL16、WTAP、VIRMA（KIA1499）、RBM15、RBM15B 和ZC3H13］、“擦除器”（FTO 和ALKBH5）和“讀取器”（YTHDC1、YTHDC2、FMR1、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、LRPPRC、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、HNRNPC、HNRNPA2B1 和RBMX），并從TCGA數(shù)據(jù)集中提取相應(yīng)表達(dá)矩陣。

表1 TCGA訓(xùn)練和驗(yàn)證集中患者的臨床病理特征［例（%）］Tab.1 Clinicopathological features of patients in TCGA training and validation cohorts［n（%）］

1.2 方法

1.2.1 lncRNA 注釋 Genome Reference Consortium Human Build 38（GRCh38）的lncRNA 注釋文件來自GENCODE 網(wǎng)站（https：//www.gencodegenes.org/hu‐man/），用于注釋TCGA數(shù)據(jù)集中的lncRNAs。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 首先，以Pearson相關(guān)分析挖掘數(shù)據(jù)集中的m6A 相關(guān)lncRNAs（|Pearsonr|>0.3和P<0.001）。與已發(fā)表的23 個(gè)m6A 相關(guān)基因中的一個(gè)或多個(gè)lncRNA 的表達(dá)值相關(guān)（|Pearsonr|>0.3和P<0.001）即為m6A 相關(guān)的lncRNA。進(jìn)行單變量Cox 回歸分析以過濾數(shù)據(jù)集中的與m6A 預(yù)后相關(guān)lncRNA?！癵lmnet”R 包被用于最小絕對(duì)收縮和選擇算子（LASSO）Cox 回歸（懲罰參數(shù)通過10 倍交叉驗(yàn)證估計(jì)）［10］，共發(fā)現(xiàn)9 個(gè)m6A 相關(guān)lncRNAs 可預(yù)測(cè)腎癌患者預(yù)后。以LASSO 回歸算法獲得回歸系數(shù)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分方程：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=系數(shù)×m6A相關(guān)lncRNA 表達(dá)水平總和。在該方程的基礎(chǔ)上，分別計(jì)算訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中每個(gè)患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。并以中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分為分界點(diǎn)將患者分為高危組和低危組。使用“ConsensusClusterPlus”包闡明腎癌中m6A 相關(guān)lnc-RNAs 的生物學(xué)特性。然后，將腎癌患者分為不同亞型。使用JAVA 程序?qū)SigDB 的Hallmark 基因集“h.all.v6.2.symbols.gmt”進(jìn)行基因集富集分析（GSEA），探索腎癌不同亞型間存活率差異的原因。兩種亞型間的富集途徑通過誤檢率<0.05 和歸一化富集評(píng)分（NES）確定。采用R 包“estimate package”計(jì)算每個(gè)患者的免疫評(píng)分［11］。通過CIBERSORT 網(wǎng)站（https：//cibersort.stanford.edu/）得到每個(gè)樣本中22 種免疫細(xì)胞類型比例，采用1 000 次排列算法，將CIBERSORTP<0.05 的樣本進(jìn)行亞組間的免疫浸潤水平差異比較，亞組按照聚類亞型和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 R4.0.2 和SPSS24.0 軟件用于統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較癌組織與正常組織中m6A 相關(guān)lncRNAs 的表達(dá)水平。兩個(gè)及兩個(gè)以上的亞組采用學(xué)生t檢驗(yàn)和單因素方差分析比較。應(yīng)用卡方檢驗(yàn)比較訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中的分類變量。兩組間差異比較采用log-rank 檢驗(yàn)。Pearson 相關(guān)性檢驗(yàn)用于分析亞型、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、臨床病理特征、程序性死亡配體1（PD-L1）和免疫浸潤水平間的相關(guān)性。Cox 回歸模型用于單變量和多變量分析，以確定風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與其他臨床特征相結(jié)合的獨(dú)立預(yù)后價(jià)值。受試者工作特征曲線（ROC）用于評(píng)估m(xù)6A 相關(guān)lncRNAs 的預(yù)后簽名在三年和五年OS 的預(yù)測(cè)效率。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鑒定腎癌患者中m6A 相關(guān)的lncRNAs 使用“GENCODE”網(wǎng)站上下載的文件，基于ensemble ID，在TCGA 數(shù)據(jù)集中共識(shí)別14 087 個(gè)lncRNAs 用于后續(xù)分析。從TCGA數(shù)據(jù)集中提取了23個(gè)m6A相關(guān)基因的表達(dá)矩陣。通過Pearson相關(guān)分析尋找m6A相關(guān)的lncRNAs，得到239個(gè)與m6A顯著相關(guān)的lncRNAs，隨后將其與預(yù)后信息結(jié)合，進(jìn)行單變量Cox 回歸分析（P<0.05）。最后，在TCGA 數(shù)據(jù)集中篩出27 個(gè)與腎癌患者OS顯著相關(guān)的m6A相關(guān)lncRNAs（圖1A），其表達(dá)水平在腎癌和正常組織中差異很大（圖1B）。AL008718.3、AC009948.2、AF117829.1、LINC01409、AL133243.3、AC084018.1、AC005253.1、AC090589.3、RUSC-1AS1、AC012615.6、RAD51-AS1、AL162586.1、AL928654.2、AC006435.2、AL136295.7、LINC00115、AC245052.4、AC114730.3、ARHGAP27P1-BPTFB1-KPNA2P3、AL135999.1、PTOV1-AS2、LINC00342 和AC00414在腎癌組織中的表達(dá)水平均高于正常鄰近組織（P<0.05）。AC018752.1、COL18A1-AS1、RPL34-AS1 和SNHG10 在腎癌組織中的表達(dá)水平明顯低于正常組織（P<0.05）。

圖1 m6A 相關(guān)lncRNAs 的表達(dá)及其在腎癌患者預(yù)后中的作用Fig.1 Expressions of m6A-related lncRNAs and their role in prognosis of RCC patients

2.2 TCGA 數(shù)據(jù)集中m6A-LPS 的構(gòu)建和驗(yàn)證 進(jìn)一步分析530 例腎癌患者和相應(yīng)的臨床病理信息。為構(gòu)建m6A-LPS 以預(yù)測(cè)腎癌患者的OS，基于TCGA訓(xùn)練集中的27 個(gè)預(yù)后相關(guān)的m6A 相關(guān)lncRNAs進(jìn)行LASSO Cox 分析并生成了包含9 個(gè)m6A 相關(guān)lncRNAs 的m6A-LPS，即AC018752.1、COL18A1-AS1、RPL34-AS1、AL008718.3、AC009948.2、AL133243.3、AL162586.1、AL136295.7和LINC00342。使用LASSO算法得到的系數(shù)計(jì)算TCGA 訓(xùn)練集和驗(yàn)證集的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，公式如下：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=1.659 2×AL008718.3 表達(dá)水平?0.460 4×AC018752.1 表達(dá)水平?1.044 3×COL18A1-AS1表達(dá)水平+0.637 1×AC009948.2表達(dá)水平?1.8806×RPL34-AS1 表達(dá)水平+0.461 1×AL133243.3 表達(dá)水平+0.193 2×AL162586.1 表達(dá)水平+0.118×LINC00342 表達(dá)水平?0.085 8×AL136295.7 表達(dá)水平。根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。圖2A、B 顯示了TCGA訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中9 個(gè)m6A-LPS 的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、熱圖、OS、OS 狀態(tài)和表達(dá)譜分布。在高危人群中，與m6A相關(guān)的高風(fēng)險(xiǎn)基因AC009948.2、LINC00342、AL008718.3、AL162586.1、AL133243.3和AL136295.7高表達(dá)，而保護(hù)性m6A相關(guān)基因如AC018752.1、COL18A1-AS1 和RPL34-AS1 在低風(fēng)險(xiǎn)人群中表達(dá)上調(diào)。Kaplan-Meier生存曲線顯示，在TCGA 訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中，具有高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的腎癌患者臨床結(jié)果較差（OS率低，OS時(shí)間短，P<0.000 1，圖2C、D）。結(jié)果表明，m6A-LPS 對(duì)TCGA 訓(xùn)練集中腎癌患者的OS有較好的預(yù)測(cè)能力（三年ROC AUC=0.737，五年AUC=0.779，圖3A、B）。在TCGA驗(yàn)證集中，9 個(gè)風(fēng)險(xiǎn)簽名的三年和五年AUC 值分別為0.703 和0.724（圖3C、D）。以上結(jié)果表明m6A-LPS 對(duì)腎癌患者具有穩(wěn)健的OS預(yù)測(cè)能力。

圖2 m6A 相關(guān)lncRNAs 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分及其對(duì)腎癌患者預(yù)后的影響Fig.2 m6A-related lncRNAs risk score and their influence on prognosis of RCC patients

圖3 ROC曲線Fig.3 ROC curve

2.3 m6A-LPS的分層分析 為更好地評(píng)估m(xù)6A-LPS的預(yù)后能力，進(jìn)行分層分析以確認(rèn)m6A-LPS 是否保留其預(yù)測(cè)每個(gè)亞組OS的能力。與低風(fēng)險(xiǎn)患者相比，高風(fēng)險(xiǎn)腎癌患者在G1~2 和G3~4、Ⅰ~Ⅱ期和Ⅲ~Ⅳ期亞組的OS較差（圖4A~D）。還證明m6A-LPS具有預(yù)測(cè)年齡≤65 歲或>65 歲患者（圖4E、F）及不同性別患者（圖4G、H）OS 的能力。這些數(shù)據(jù)表明m6A-LPS可作為腎癌患者的潛在預(yù)測(cè)因子。

2.4 m6A-LPS 是腎癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素 應(yīng)用單變量和多變量Cox 分析評(píng)估m(xù)6A-LPS 是否是腎癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。根據(jù)TCGA 數(shù)據(jù)集中的腎癌患者數(shù)據(jù)，單變量Cox 分析顯示m6A-LPS 與OS 顯著相關(guān)［風(fēng)險(xiǎn)比（HR）：2.261，95%置信區(qū)間（CI）：1.884~2.713，P<0.001，圖4I］，而多變量Cox 分析進(jìn)一步表明m6A-LPS 是OS 的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子（HR：2.058，95%CI：1.655~2.560，P<0.001，圖4J）。因此，m6A-LPS 是驗(yàn)證集中腎癌患者OS 的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子（單變量分析HR：1.255，95%CI：1.149~1.371，P<0.001；多變量分析HR：1.206，95%CI：1.082~1.344，P<0.001，圖4K、L）。以上結(jié)果表明m6A-LPS是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，可能有助于腎癌的臨床預(yù)后評(píng)估。

圖4 模型驗(yàn)證的生存曲線和多變量和單變量獨(dú)立預(yù)后分析Fig.4 Survival curve for model validation and multivariate and univariate analysies of independent prog?nostic analysis

2.5 m6A 相關(guān)預(yù)后lncRNAs 的共識(shí)聚類與腎癌患者的特征和生存期顯著相關(guān) 根據(jù)m6A 相關(guān)預(yù)后lncRNAs 的表達(dá)水平與模糊聚類檢驗(yàn)比例的相似性，k=2 在k=2~9 間具有最好的聚類穩(wěn)定性。根據(jù)m6A相關(guān)預(yù)后lncRNAs的表達(dá)水平，將530例腎癌患者分為兩個(gè)亞型，即聚類1（n=313）和聚類2（n=217），見圖5A。27個(gè)m6A相關(guān)預(yù)后lncRNAs在聚類1中的表達(dá)水平大多低于聚類2（圖5B）。聚類1的OS比聚類2 長（P<0.001，圖5C）。分析27 個(gè)m6A 相關(guān)預(yù)后lncRNAs 與PD-L1 間的相關(guān)性，結(jié)果表明，AL008718.3、AL133243.3、SNHG10、LINC00115、AF117829.1、AC084018.1、AC005253.1 和PD-L1 的表達(dá)水平呈正相關(guān)（P<0.05，圖5D）。

圖5 TCGA 隊(duì)列中Cluster1/2 亞型腎癌的不同臨床病理特征和生存率以及m6A 預(yù)后lncRNAs 與靶基因的表達(dá)和關(guān)系Fig.5 Differential clinicopathological features and survival of RCC in Cluster1/2 subtypes in TCGA cohort and expression and relationship of m6A prognostic lncRNAs and target genes

2.6 m6A 相關(guān)預(yù)后lncRNAs 的共識(shí)聚類及其22 種免疫細(xì)胞浸潤水平 評(píng)估聚類1 與下調(diào)的m6A 相關(guān)預(yù)后lncRNAs 表達(dá)和聚類2 與上調(diào)的m6A 相關(guān)預(yù)后lncRNA 表達(dá)間的22 種免疫細(xì)胞浸潤水平差異（圖6A）。聚類1 顯示幼稚B 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞M0 浸潤水平更高（圖6A、B），而聚類2 中CD8 T 細(xì)胞和濾泡輔助T 細(xì)胞浸潤水平更高（圖6A、C、D）。隨后進(jìn)行GSEA 以闡明導(dǎo)致兩個(gè)亞組間免疫細(xì)胞浸潤差異的潛在調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)果表明，腫瘤的惡性特征，包括哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)（mTOR）信號(hào)（NES=1.827，標(biāo)準(zhǔn)化P=0.007）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號(hào)（NES=1.672，標(biāo)準(zhǔn)化P=0.019）和Notch 信號(hào)（NES=1.739，標(biāo)準(zhǔn)化P=0.037）在聚類2中活躍（圖6E）。因此，兩個(gè)亞組間免疫細(xì)胞浸潤差異可能與mTOR、VEGF 和Notch 信號(hào)通路的活躍有關(guān)。

圖6 免疫細(xì)胞浸潤和TME分析Fig.6 Analysis of immune cell infiltration and TME

2.7 與腎癌分級(jí)、分期和免疫評(píng)分相關(guān)的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分 評(píng)估臨床特征和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分間的關(guān)系。圖7A為TCGA數(shù)據(jù)集中高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)組中9個(gè)m6A-LPS的表達(dá)水平。其中AC018752.1、COL18A1-AS1 和RPL34-AS1在高危組中的表達(dá)水平通常低于低危組。AC009948.2、LINC00342、AL008718.3、AL162586.1、AL133243.3和AL136295.7在低危組中表達(dá)水平較低。M 分期（P<0.001）、T 分期（P<0.001）、TNM 分期（P<0.001）、分級(jí)（P<0.001）、聚類亞型（P<0.001）和免疫評(píng)分（P<0.001）在高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步探索風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、亞型、分類和免疫評(píng)分間的關(guān)系。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分隨著組織學(xué)分級(jí)和分期的增加而增加（P<0.05，圖7B、C）。聚類1的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分明顯低于聚類2（P<0.001，圖7D）。與低免疫評(píng)分組相比，高免疫評(píng)分組的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分較高（P<0.001，圖7E）。提示腎癌患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與分級(jí)、分期、聚類亞型和免疫評(píng)分顯著相關(guān)。

圖7 TCGA訓(xùn)練集中預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與臨床病理特征和免疫評(píng)分相關(guān)Fig.7 Prognostic risk scores correlated with clinicopatho?logical features and immunoscore in TCGA training cohort

2.8 22 種免疫細(xì)胞的浸潤豐度與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的關(guān)系 分析22 種免疫細(xì)胞的浸潤水平與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分間的關(guān)系，以評(píng)估9 個(gè)m6A-LPS 對(duì)腎癌免疫微環(huán)境的影響。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與漿細(xì)胞、CD4 記憶T 細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞和濾泡輔助性T 細(xì)胞的浸潤水平呈正相關(guān)（P<0.001，圖8A~E）。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和單核細(xì)胞浸潤水平（P<0.001）、靜息肥大細(xì)胞（P<0.001）、CD4 記憶靜息T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞M2 呈負(fù)相關(guān)（P<0.001，圖8F~I）。以上結(jié)果表明m6A-LPS 與腎癌TME有關(guān)。

圖8 22種免疫細(xì)胞類型的浸潤豐度與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分間的關(guān)系Fig.8 Relationship between risk score and infiltration abundances of 22 immune cells

3 討論

眾所周知，病理分期是臨床上預(yù)測(cè)腎癌預(yù)后的關(guān)鍵依據(jù)［12］。然而，相同分期的患者預(yù)后不同，表明目前的分期系統(tǒng)在反映腎癌的異質(zhì)性方面不甚準(zhǔn)確［13］。因此，應(yīng)探索潛在的預(yù)測(cè)和治療生物標(biāo)志物。本研究探討了m6A 相關(guān)lncRNAs 對(duì)來自TCGA數(shù)據(jù)集的530 例患者的預(yù)后意義。在TCGA 數(shù)據(jù)集中共有27 個(gè)m6A 相關(guān)lncRNAs 表現(xiàn)出預(yù)后價(jià)值，其中9個(gè)用于建立m6A-LPS預(yù)測(cè)腎癌患者的OS。根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，腎癌患者被分為低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組。高風(fēng)險(xiǎn)組表現(xiàn)出較差的臨床結(jié)果。高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組還與不同的聚類亞型、免疫評(píng)分、等級(jí)和TNM 分期相關(guān)。多變量Cox 回歸分析證實(shí)m6ALPS 為OS 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。此外，本研究中的模型可獨(dú)立于影響患者預(yù)后的其他臨床預(yù)后因素。因此，該模型可應(yīng)用于不同的臨床亞組。

m6A 修飾mRNA 和lncRNAs 使其具有多種功能，調(diào)控mRNA 的剪接、穩(wěn)定、核輸出和翻譯，是真核生物中最豐富的修飾。此外，與m6A 相關(guān)的lncRNAs 研究也引起眾多癌癥領(lǐng)域?qū)＜业年P(guān)注［14］。ALKBH5 通過降低lncRNA 核旁斑點(diǎn)組裝轉(zhuǎn)錄本1的甲基化加速胃癌的轉(zhuǎn)移和侵襲［15］。DKK1 的lncRNA 激活調(diào)節(jié)因子通過與熱休克蛋白家族A（Hsp70）成員1A 和Y-box 結(jié)合蛋白1 形成三元復(fù)合物穩(wěn)定m6A 甲基化，從而促進(jìn)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展［16］。lncRNAs 的m6A 修飾可介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄抑制、改變結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)lncRNAs 的穩(wěn)定性影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［17-19］。lncRNAs 和m6A 是腎癌發(fā)生的重要調(diào)節(jié)因子［9］。目前已初步了解lncRNA 和m6A 在腎癌中的功能，然而，lncRNA 和m6A 在腎癌進(jìn)展中的病理作用機(jī)制尚不明確，其預(yù)后生物標(biāo)志物的研究甚少。本研究基于m6A 相關(guān)的lncRNA 構(gòu)建了腎癌的獨(dú)立預(yù)后模型。

本研究展示了腎癌中m6A 相關(guān)lncRNAs 的表達(dá)情況、預(yù)后價(jià)值和差異的免疫浸潤豐度。篩選了9 個(gè)m6A 相關(guān)lncRNAs 構(gòu)建模型以預(yù)測(cè)腎癌患者的OS。其中RPL34-AS1 是結(jié)直腸癌和胃癌的抑癌基因［20］。RPL34-AS1 在食管癌中通過下調(diào)RPL34 表達(dá)、在乳頭狀甲狀腺癌中通過競(jìng)爭性結(jié)合miR-3663-3p/RGS4、在宮頸癌中通過MDM2-p53 途徑抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［21-23］。本研究結(jié)果也提示RPL34-AS1 是腎癌的抑癌基因。COL18A1-AS1在腎透明細(xì)胞癌中是抑癌基因，并可能作為癌癥診斷和治療的預(yù)后生物標(biāo)志物［24-25］。膽管癌患者中COL18A1-AS1 高表達(dá)可提高存活率［26］。這些報(bào)道為本研究結(jié)果提供支持，即COL18A1-AS1可能為腎癌的抑癌基因，有望成為其診斷和治療的預(yù)后生物標(biāo)志物。AL162586.1是一種關(guān)鍵的免疫相關(guān)lncRNA，其表達(dá)與N 期呈正相關(guān)，可能通過剪接途徑影響前列腺癌患者預(yù)后［27］。本研究結(jié)果也認(rèn)為AL162586.1可能為腎癌患者的致癌基因。此外，其他lncRNAs是首次被發(fā)現(xiàn)。這些lncRNAs可能是預(yù)測(cè)腎癌患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。因此，本研究結(jié)果可能有助于識(shí)別與m6A 相關(guān)的lncRNAs，為深入了解其在腎癌中發(fā)生、發(fā)展的潛在作用提供見解。

進(jìn)一步分析樣本中不同免疫細(xì)胞的浸潤水平以確定免疫細(xì)胞浸潤和TME 在腎癌中的作用。與聚類2 相比，聚類1 中的患者具有更長的OS。B 細(xì)胞、幼稚細(xì)胞和巨噬細(xì)胞M0的浸潤水平在聚類1中更高，而聚類2中CD8 T細(xì)胞和濾泡輔助T細(xì)胞的浸潤水平更高。GSEA 結(jié)果表明，腫瘤的惡性功能特征包括mTOR、VEGF 和Notch 信號(hào)通路，在聚類2 中顯著富集。ZHOU 等［28］觀察到METTL14 表達(dá)下調(diào)可上調(diào)AKT 和mTOR 表達(dá)水平，與腎癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。越來越多的證據(jù)表明，腫瘤中VEGF 水平升高可能導(dǎo)致適應(yīng)性和先天免疫反應(yīng)的抑制，血清或腫瘤的升高與腎癌患者預(yù)后不良有關(guān)［29］。mTOR 和VEGF 在致癌過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括細(xì)胞存活、增殖和預(yù)后［30］。Notch 信號(hào)通路影響TME 并調(diào)節(jié)癌癥生物學(xué)過程，包括癌癥的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展［31］。Notch3 調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程和缺氧誘導(dǎo)因子2α，后者參與腎癌的增殖［32］。這些研究支持本文結(jié)果，即具有更短OS 的聚類2 顯著富集mTOR、VEGF和Notch 信號(hào)通路，表明mTOR、VEGF 和Notch 信號(hào)通路的mRNA可作為m6A甲基化修飾的靶標(biāo)。因此推測(cè)m6A 和mTOR、VEGF 和Notch 信號(hào)通路的甲基化共同參與了腎癌兩個(gè)亞組間TME 的差異調(diào)節(jié)。隨后進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與免疫細(xì)胞的相關(guān)分析，以評(píng)估其間關(guān)系。CD4 記憶T 細(xì)胞、CD8 T 細(xì)胞、Treg 和濾泡輔助T細(xì)胞與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分呈正相關(guān)。TME中浸潤的活化CD4 記憶T 細(xì)胞、CD8 T 細(xì)胞、Treg 和濾泡輔助性T細(xì)胞的減少可能不利于腎癌患者的預(yù)后。本推論與何天基等［33］的結(jié)論大致相同，即大量CD4+T 細(xì)胞和瘤內(nèi)CD8+T 細(xì)胞與短生存期和高腫瘤分級(jí)相關(guān)。TME 中Tregs 的誘導(dǎo)可促進(jìn)腫瘤生長，且TM 中Tregs 的分化與癌癥亞型患者總體生存率低有關(guān)。Tregs可抑制抗原呈遞細(xì)胞的成熟、細(xì)胞因子的分泌以及細(xì)胞毒性顆粒酶和穿孔素的產(chǎn)生，還可促進(jìn)血管生成、腫瘤生長、增殖和腫瘤向轉(zhuǎn)移性疾病的轉(zhuǎn)變［34-35］。以上研究結(jié)論同樣支持本研究結(jié)果，因此，通過敲除或阻斷Tregs、活化的CD4 記憶T 細(xì)胞和CD8 T細(xì)胞的相關(guān)信號(hào)通路或基因可能改善TME的抗腫瘤活性和免疫抑制。

總之，本研究建立了一個(gè)m6A 相關(guān)的lncRNA模型，為預(yù)測(cè)腎癌患者預(yù)后提供了生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，并為未來對(duì)lncRNA 的m6A修飾機(jī)制的研究提供見解。然而，本研究也存在一些缺陷和局限性，m6A 相關(guān)lncRNA 的生物學(xué)機(jī)制尚未完全闡明。因此，課題組將在后續(xù)工作中收集臨床數(shù)據(jù)并擴(kuò)大樣本量，通過外部試驗(yàn)驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性。