人工合成抗菌肽在齲病防治中的研究進展

袁文錦，韓佳岐，楊 婕，董 寧，姜 秋

齲病是世界范圍內(nèi)主要的公共衛(wèi)生問題之一，具有發(fā)病率高、分布廣泛等特點[1]。但常用的齲病防治藥物如氯己定和氟化物，可能會引起細菌耐藥性、牙齒變色等不良反應[2]。近年來，抗菌肽因其抗菌譜廣、抗菌活性高、作用機制特殊而被認為是傳統(tǒng)抗菌藥物的替代品[3]。然而，大多數(shù)天然抗菌肽由于序列長度較長導致結構不穩(wěn)定，在復雜的口腔環(huán)境其抗菌活性會進一步降低[4]。因此，研究人員以天然抗菌肽為模板設計出了具有更高抗菌活性和穩(wěn)定性的人工合成抗菌肽[5]，為齲病防治提供了更多的選擇。

1 人工合成抗菌肽的抗菌作用及機制

致齲菌通過產(chǎn)酸打破牙齒表面礦化平衡，從而誘導牙體硬組織脫礦，最終導致齲病的發(fā)生[6]。致齲菌包括多種細菌，其中變異鏈球菌因其產(chǎn)酸能力、耐酸性和促進細菌定植于牙齒表面的能力較強，而被認為是主要致齲菌[7]。已知的能夠抑制變異鏈球菌的天然抗菌肽有環(huán)狀細菌素、富組蛋白5(Histatin5，H5)、乳鐵蛋白、GHa、LL-37和石榴提取物等，研究人員根據(jù)抗菌肽的作用機制設計并合成了一系列性能得到優(yōu)化的人工合成抗菌肽。

1.1 以天然抗菌肽為模板設計的人工合成抗菌肽

LN-7、LR-10、AT-7和KR-1都是以天然抗菌肽為模板根據(jù)兩親性和陽離子性設計合成的新型抗菌肽，其中LN-7、LR-10和AT-7以環(huán)狀細菌素reuricin 6或gassericin A為模板[7-9]，KR-1以富組蛋白5為模板[10]。新型抗菌肽的陽離子性和疏水性都有所增強，研究表明抗菌肽的疏水性與抗菌活性呈正相關[8]，所以新型抗菌肽對變異鏈球菌具有更強的抑制作用。此外，KR-1還能夠抑制其他致齲菌，如遠緣鏈球菌(S.sobrinus)和戈登鏈球菌(S.gordonii)[10]。

GHaR衍生肽是以GRaR為模板設計合成的新型抗菌肽。GHaR具有顯著的抗菌活性，但溶血作用較強，因此通過氨基酸替換降低表面疏水性得到了GHaR6R、GHaR8R和GHaR9R[11]，研究表明，通過降低多肽表面疏水性，能夠降低其溶血毒性[12]。除GHaR9R外，其他類似物均表現(xiàn)出良好的抗菌活性和抗生物膜活性，但由于GHaR7R表現(xiàn)出較強的溶血性和細胞毒性[11]，所以GHaR6R、GHaR8R和GHaR9W有望成為齲病防治的新藥物。

LF-1是以乳鐵蛋白為模板設計合成的抗菌肽，研究表明乳鐵蛋白N-端的螺旋帽殘基(GKLI)能夠穩(wěn)定α-螺旋結構，從而在抗菌活性中起關鍵作用[13]。通過在LF-1的N端添加螺旋帽序列，獲得LF-2[14]。LF-1和LF-2均對變異鏈球菌有很強的抗菌活性，但由于螺旋帽序列使LF-2的二級結構更穩(wěn)定，使其對多種細菌均具有較強的抑制作用[14]。

IG-13-1、IG-13-2和[W7]KR12-KAEK都是以抗菌肽LL-37為模板合成的新型抗菌肽。通過縮短LL-37的長度、改變其電荷和疏水性合成了具有更強抗菌活性的IG-13-1和IG-13-2[15]。截取抗菌肽LL-37中第18～29個氨基酸得到KR-12[16]，由于抗菌肽的長度需要與脂質雙層厚度相匹配才能夠形成穩(wěn)定的孔狀結構[17]，因此在KR-12的C末端添加賴氨酸-丙氨酸-谷氨酸-賴氨酸(KAEK)序列，合成了具有更強抗菌作用的新型抗菌肽[W7]KR12-KAEK[17]。

PUG-1是以石榴提取物為模板設計合成的抗菌肽[18]，DPS-PI是通過將二磷酸絲氨酸結合到PI上得到的新型抗菌肽[19]。PUG-1和DPS-PI對變異鏈球菌均具有較強的抑制作用。

1.2 特異性靶向抗菌肽

特異性靶向抗菌肽是一種新型抗菌肽，由抗菌區(qū)域、靶向定位區(qū)域和連接體組成[20]。最小抑菌濃度(minimal inhibit concentration，MIC)、最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)結果顯示新型特異性靶向抗菌肽C8gpm11對變異鏈球菌的殺菌效果最好，敏感度最強[21]。

1.3 根據(jù)抗菌機制設計的人工合成抗菌肽

GH12和G(IIKK)3I-NH2(簡稱G3)都是根據(jù)兩親性和陽離子性α-螺旋結構設計出的抗菌肽，均對變異鏈球菌有較強的抑制作用。此外，在大鼠齲病模型中GH12還能夠減少其他致齲菌的數(shù)量，如羅氏菌屬(Rothia)[22]，羅氏菌屬通常與齲病有關，并有助于其他致齲菌的黏附[23]。由于GH12富含組氨酸，而組氨酸在酸性環(huán)境中會變?yōu)殛栯x子[24]，因此在pH值為5.5時，GH12與細胞膜上陰離子的相互作用增強，從而達到更好的抗菌效果[25]。

C10-KKWW是以ptxA為靶點設計合成的抗菌肽，變異鏈球菌通過磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶(PTS)系統(tǒng)識別碳水化合物并將其轉移到細胞內(nèi)從而獲得能量[26]，ptxA是PTS系統(tǒng)中重要的組成部分。對比C10-KKWW對野生型變異鏈球菌(WT)、ptxA缺失突變株(ΔptxA)和補充型ptxA突變株(CptxA)的抗菌活性，C10-KKWW對ΔptxA的抗菌活性和生物膜去除能力較弱，表明C10-KKWW以ptxA為靶點抑制變異鏈球菌[27]。

1.4 抗菌機制

1.4.1 破壞細胞膜完整性 抗菌肽中帶有正電荷的氨基酸會通過靜電作用結合到帶負電荷的細菌細胞膜上，然后通過在脂質雙層中插入疏水部分破壞細胞膜導致細菌因內(nèi)容物泄漏而死亡[8,11,28]。電鏡結果顯示使用抗菌肽會導致變異鏈球菌細胞膜完整性被破壞，表面呈現(xiàn)微孔樣改變[17,21]。

1.4.2 減少致齲毒力因子合成 抗菌肽能夠通過減少致齲菌毒力因子的合成來抑制齲病發(fā)生[29]。GH12能夠在體外抑制乳酸脫氫酶(LDH)形成[30]，LDH是糖酵解過程中最重要的酶之一，缺乏LDH意味著變異鏈球菌通過糖酵解產(chǎn)酸的能力降低，最終導致致齲性降低。

2 人工合成抗菌肽的抗生物膜作用

牙菌斑生物膜是齲病發(fā)生的始動因子[31]，與高齲病風險有關[32]。變異鏈球菌生物膜是齲病研究中最常用的微生物模型[33]。清除菌斑生物膜是治療齲齒的有效方法，然而成熟的菌斑生物膜由于其嚴密的三維網(wǎng)絡結構、細胞外多糖(EPS)的保護、對環(huán)境變化的適應能力等原因難以去除[34]。生物膜的形成有幾個階段，包括細菌黏附、成熟階段和擴散階段[35]?？咕脑诟鱾€階段都能發(fā)揮作用，使抗菌肽成為一種極具潛力的防齲藥物。

2.1 具有抗生物膜作用的人工合成抗菌肽

研究表明，KR-1、GHaR衍生肽、IG-13-1、IG-13-2、[W7]KR12-KAEK、DPS-PI和G3等人工合成抗菌肽能夠明顯減少生物膜的形成，研究結果顯示經(jīng)上述抗菌肽處理后的生物膜疏松多孔，使后續(xù)的機械清除變得更加高效。

LR-10和PUG-1不僅能夠抑制變異鏈球菌生物膜的形成，還能夠快速穿透細胞外基質，進入生物膜內(nèi)殺死變異鏈球菌[8,18]。

動物實驗結果表明LF-1和LF-2均能顯著降低平滑面齲和窩溝齲的發(fā)生率。兩種多肽在體內(nèi)的防齲效果可以與常規(guī)防齲藥物氟化鈉和氯己定相媲美[14]。

GH12對變異鏈球菌生物膜、人牙菌斑來源的多菌種生物膜的乳酸生成、水不溶性EPS的合成和酸化能力有明顯抑制作用，并且能夠破壞生物膜的支架結構[22,36-37]。在pH為5.5時，GH12對生物膜的抑制作用更加明顯[25]。此外，GH12 還能夠選擇性抑制多菌種生物膜中主要致齲菌變異鏈球菌的機會性過度生長，從而使牙菌斑生物膜組成趨向于健康狀態(tài)，有利于預防齲齒的發(fā)生[37-38]。

2.2 抗生物膜機制

細菌在牙面上的黏附被認為是生物膜形成的關鍵步驟。抗菌肽通過附著在底物表面，作為屏障阻止細菌和底物之間的相互作用。牙齒經(jīng)DPS-PI處理后，二磷酸絲氨酸與羥基磷灰石結合，唾液黏蛋白和變異鏈球菌很難替換二磷酸絲氨酸黏附到牙齒表面。掃描電子顯微鏡結果顯示經(jīng)DPS-PI處理后的釉質表面變異鏈球菌分布稀疏，兔切牙表面形成的牙菌斑生物膜也明顯減少[19]?？咕倪€能夠與細菌結合，阻止細菌黏附到底物表面[3]。細菌表面疏水性因為和黏附在疏水表面的能力呈正相關，所以被認為是評價細菌黏附性的一個重要參數(shù)[39]，G3能夠通過降低細菌表面疏水性抑制細菌黏附。同時，G3能夠和胞外DNA(eDNA)相互作用，破壞成熟生物膜的3D結構，從而使其分散[3]。eDNA是變異鏈球菌生物膜細胞外基質的主要成分，作為剛性支架支撐其他細胞外基質最終形成成熟的生物膜[40]。熒光探針結果顯示G3通過和細菌快速結合，導致細菌表面的負電荷在與帶正電荷的G3結合時迅速減少[3]，由于細菌之間的靜電斥力減少，細菌傾向于聚集在一起，減少在牙齒表面的黏附。

此外，抗菌肽能夠通過減少與黏附相關的毒力因子的表達抑制生物膜形成。葡糖基轉移酶(GTF)是變異鏈球菌的關鍵毒力因子之一，GTF可以催化細胞外多糖的合成[41]。細胞外多糖，特別是水不溶性葡聚糖對生物膜的形成和結構完整性非常重要，并為變異鏈球菌黏附提供結合位點[41]。G3、PUG-1和GH12均可以抑制編碼水不溶性葡聚糖的基因gtfB的轉錄，減少水不溶性葡聚糖的產(chǎn)量[3,18,30]。

3 促進再礦化作用

致齲菌通過糖酵解產(chǎn)酸，局部酸化會破壞牙齒表面礦化平衡，誘導牙體硬組織脫礦[6]。減少牙體硬組織脫礦，同時誘導再礦化可以減少齲病的發(fā)生[42]。所以具有再礦化作用的抗菌肽對齲病防治意義重大。

3.1 具有再礦化作用的人工合成抗菌肽

研究表明通過將兩個或多個肽連接在一起可能會從各個組分中獲得不同的功能[43]。P-113-DPS和Sp-H5就是根據(jù)這種機制合成的具有抗菌作用和再礦化作用的多肽[44-45]。其中發(fā)揮抗菌作用的結構均取自于富組蛋白5[46]。Sp-H5選擇整個H5作為抗菌基團，而P-113-DPS選擇H5的最小片段P-113作為抗菌基團，P-113的正電荷能與陰離子脂磷壁酸和變異鏈球菌的肽聚糖相互作用，因此具有較高的抑菌活性[47-48]。磷酸絲氨酸(Sp)可以與羥基磷灰石結合，吸引游離鈣離子(Ca2+)作為核啟動礦化[44]。將Sp部分連接到H5的N端，構建出新型抗菌肽Sp-H5。在P-113的C-末端連接二磷酸絲氨酸得到P-113-DPS。

ICP-OES檢測結果顯示，有Sp-H5或P-113-DPS涂層的釉質切片鈣、磷流失明顯減少[44-45]。牙釉質表面暴露于再礦化溶液中，Sp-H5組的鈣、磷含量顯著增加，且礦化速度更快[44]。P-113-DPS組牙釉質表面有很厚的再生結晶層，再生層的晶體宏觀結構為針狀突起，微結構為六棱柱狀突起，兩者形態(tài)與天然牙釉質相似[45]。同時Sp-H5和P-113-DPS還有抑制變異鏈球菌及其生物膜的作用[44-45]。

含有鄰苯三酚基團的沒食子酸(GA)有誘導和加速礦化的作用[49]，可以與鈣離子結合加速羥基磷灰石的再生[50]。將KR12與GA連接在一起得到了新型抗菌肽GA-KR12。傅里葉紅外光譜分析結果表明GA-KR12可以減少牙本質脫礦和膠原降解。同時，GA-KR12能夠促進釉質齲和人工牙本質齲的再礦化[28,42]。此外，GA-KR12能抑制浮游狀態(tài)下的致齲菌包括變異鏈球菌、遠緣鏈球菌、嗜酸乳桿菌的生長。

TD7在釉原蛋白-羥基磷灰石相互作用和釉質晶體定向生長中起著控制作用，它可以啟動羥基磷灰石成核[51]。通過將TD7連接到GH12的N端得到了TDH19[52]。根據(jù)兩親性和正電荷原則替換TDH19中的氨基酸得到TVH19。由于含有TD7，TVH19表現(xiàn)出良好的體外再礦化活性，初期齲損經(jīng)TVH19處理后表面顯微硬度恢復率(SMHR%)較高，病變深度較淺，礦物質含量較高，再礦化作用與氟化鈉之間無顯著性差異[53]。此外，TVH19還具有抑制變異鏈球菌及其生物膜的作用[53]。

3.2 再礦化機制

4 展 望

研究人員在設計人工合成抗菌肽時應以功能為基礎，具有靶向功能或再礦化功能的人工合成抗菌肽將成為未來抗菌肽設計的主要方向。在融合抗菌序列與功能序列時會影響抗菌肽的穩(wěn)定性及生物安全性，如何篩選或設計出長度更短的抗菌序列和功能序列，以及在融合時保證其生物安全性將成為亟待解決的問題。