UHRF1在口腔黏膜鱗癌中的表達(dá)及其對(duì)臨床預(yù)后的價(jià)值研究

段賢捷，翁海燕，沈國(guó)棟，司呈云，安星妃，章禮玉，周 瑜

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)約占口腔頜面部惡性腫瘤的90%左右，具有很強(qiáng)的侵襲性和隱匿性，1990—2017年，我國(guó)口腔鱗癌新發(fā)病例增長(zhǎng)280.0%，病死人數(shù)增長(zhǎng)196.8%[1]。盡管治療水平一直不斷進(jìn)步，多學(xué)科討論模式也在持續(xù)發(fā)展，但OSCC患者的總體生存率并未得到顯著改善[2]。準(zhǔn)確的診斷和預(yù)后標(biāo)志物有助于改善OSCC患者的預(yù)后，然而這方面的研究尚不完善，仍需繼續(xù)篩選出與OSCC相關(guān)的新的生物標(biāo)志物。

泛素樣含PHD和環(huán)指域1(ubiquitin like with PHD and ring finger domains 1，UHRF1)，也被稱為ICBP90，是DNA甲基化和組蛋白修飾之間的重要聯(lián)系[3]。UHRF1的分子結(jié)構(gòu)包含多個(gè)功能域，可以通過(guò)其獨(dú)特的SET和環(huán)指相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)域與組蛋白去乙?；?和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1形成復(fù)合物[4]，并將DNA甲基化模式復(fù)制到新合成的DNA中，以調(diào)節(jié)組蛋白修飾和DNA甲基化[5]。研究已證實(shí)UHRF1在多種惡性腫瘤如肝母細(xì)胞瘤、肺癌、膀胱癌、食管鱗狀細(xì)胞癌等中高表達(dá)，可被用作診斷、治療和預(yù)后效果評(píng)估的生物標(biāo)志物[6-9]。UHRF1的高表達(dá)可以促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、降低腫瘤細(xì)胞的凋亡水平并調(diào)節(jié)各種癌細(xì)胞的遷移、侵襲[10]。

這些研究表明，UHRF1是一個(gè)有價(jià)值的預(yù)后生物標(biāo)志物，但迄今為止，UHRF1在口腔鱗癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中的作用尚不清楚。因此，我們對(duì)UHRF1在口腔鱗癌組織中的表達(dá)水平及其對(duì)預(yù)后的影響進(jìn)行分析，了解UHRF1在口腔鱗癌中的表達(dá)情況及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2008年12月至2016年12月間，于中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔頜面外科接受手術(shù)治療的OSCC病例資料共210例。納入標(biāo)準(zhǔn)包括：①年齡>18周歲；②病理證實(shí)的原發(fā)性口腔黏膜鱗狀細(xì)胞癌；③病理資料完整；④術(shù)后隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：①?gòu)?fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤；②術(shù)前接受過(guò)放射治療；③無(wú)法獲得完整的臨床資料或術(shù)后失訪。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)，共計(jì)111例患者納入研究。本研究符合醫(yī)院倫理委員會(huì)的倫理標(biāo)準(zhǔn)，并已獲得倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批件號(hào)：2022KY倫審第036號(hào))。

1.2 免疫組織熒光染色

所有患者的病理石蠟切片均從醫(yī)院病理科獲得，腫瘤組織的石蠟切片固定在帶電載玻片上，在二甲苯溶液中脫蠟，使用乙醇溶液再水化。抗原修復(fù)及血清封閉后，應(yīng)用UHRF1特異性一級(jí)抗體(1∶200稀釋；abs136449；中國(guó)上海Absin)滴加在標(biāo)本上，4 ℃孵育過(guò)夜，加入相應(yīng)二抗，DAPI復(fù)染細(xì)胞核。使用Ⅸ71熒光顯微鏡(奧林巴斯，日本)對(duì)兩種抗原的定位及定量分析，并采集圖片。腫瘤浸潤(rùn)前沿(Invasive tumor front，ITF)定義為位于腫瘤與宿主組織和器官交界處的3～6層細(xì)胞或散在浸潤(rùn)的細(xì)胞團(tuán)，癌旁正常組織為距離腫瘤邊緣>1 cm的正常組織。

1.3 浸潤(rùn)深度的測(cè)量

所有腫瘤石蠟切片的病理標(biāo)本均由兩名的頭頸病理學(xué)專家單獨(dú)進(jìn)行評(píng)估，并通過(guò)數(shù)字顯微鏡和計(jì)算機(jī)(奧利巴斯生物顯微鏡，BX53F，日本)測(cè)量浸潤(rùn)深度。浸潤(rùn)深度按照國(guó)際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，其定義為：從鄰近正常黏膜基底膜距腫瘤侵襲最前沿的垂直距離。具體測(cè)量是根據(jù)口腔鱗癌患者腫瘤標(biāo)本的HE染色切片，連接距離腫瘤兩側(cè)最近正常黏膜上皮的基底膜做一條直線，將此直線至腫瘤侵襲最深處的垂直距離作為浸潤(rùn)深度。

1.4 染色結(jié)果判定及分組依據(jù)

染色結(jié)果均由兩位頭頸病理學(xué)專家單獨(dú)觀察，通過(guò)免疫反應(yīng)強(qiáng)度分布指數(shù)(immunoreactivity intensity distribution index, IRIDI)進(jìn)行定量分析。IRIDI是染色強(qiáng)度的評(píng)分與陽(yáng)性細(xì)胞分布的評(píng)分的乘積[11]。染色強(qiáng)度得分如下，不染色：0分；染色：1分；中等染色：2分；強(qiáng)染色：3分。陽(yáng)性細(xì)胞分布得分如下：陽(yáng)性細(xì)胞<5%，0分；6%～25%陽(yáng)性細(xì)胞，1分；26%～50%陽(yáng)性細(xì)胞，2分；51%～75%陽(yáng)性細(xì)胞，3分；陽(yáng)性細(xì)胞超過(guò)75%，4分。對(duì)于每個(gè)樣本，最終得分是5個(gè)隨機(jī)視野的IRIDI平均值。根據(jù)IRIDI，我們按患者UHRF1表達(dá)水平分為低表達(dá)組(得分≤4)和高表達(dá)組(得分>4)。

1.5 預(yù)后指標(biāo)

病理淋巴結(jié)陽(yáng)性是術(shù)中行選擇性頸淋巴結(jié)清掃，術(shù)后病理顯示清掃的頸淋巴結(jié)有癌細(xì)胞累及；術(shù)后局部復(fù)發(fā)和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)準(zhǔn)為手術(shù)后至少3個(gè)月以上發(fā)生的由組織病理學(xué)證實(shí)的局部腫瘤再生或頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[12]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS(26.0，IBM)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用方差分析，組間比較使用LSD法分析，分類資料采用卡方檢驗(yàn)，精準(zhǔn)檢驗(yàn)使用Fisher確切概率法。運(yùn)用Kaplan-Meier法分析口腔鱗癌組織中UHRF1表達(dá)水平對(duì)患者生存時(shí)間的影響，組間差異采用Log-rank方法比較。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)影響口腔鱗癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素進(jìn)行分析，計(jì)算危險(xiǎn)比(hazard ratios，HR)。若P<0.05則認(rèn)為結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 UHRF1在口腔鱗癌中的表達(dá)

UHRF1在口腔鱗癌組織中表達(dá)如圖1所示，在111例口腔鱗癌患者的組織切片中，UHRF1在腫瘤組織中明顯高表達(dá)。使用方差分析比較了腫瘤組織與癌旁正常組織、以及腫瘤組織與腫瘤侵襲前沿的UHRF1表達(dá)水平的差異，結(jié)果顯示，腫瘤組織的UHRF1表達(dá)水平較癌旁正常組織(P<0.001)或腫瘤侵襲前沿(P<0.001)均顯著增高(圖1)。

口腔鱗癌患者癌旁正常組織(A)、腫瘤侵襲前沿(B)及腫瘤組織(C)HE染色切片；口腔鱗癌患者癌旁正常組織(D)、侵襲前沿(E)及腫瘤組織(F)UHRF1蛋白免疫熒光染色切片；G：患者腫瘤組織、侵襲前沿及正常組織UHRF1表達(dá)差異。****為P<0.0001

2.2 UHRF1表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系

我們根據(jù)染色結(jié)果，將患者分為UHRF1高表達(dá)組和低表達(dá)組，其中高表達(dá)組66例，占59.5%；低表達(dá)組45例，占40.5%?；颊叩呐R床病理特征及其與UHRF1表達(dá)的關(guān)系如表1所示，與UHRF1表達(dá)水平相關(guān)的臨床病理特征包括：患者的性別(P=0.014)、腫瘤大小(P=0.024)及浸潤(rùn)深度(P<0.001)。

表1 UHRF1表達(dá)水平與患者基本臨床病理特征的關(guān)系

2.3 UHRF1表達(dá)水平對(duì)患者術(shù)后局部復(fù)發(fā)的影響

入組患者中出現(xiàn)腫瘤術(shù)后局部復(fù)發(fā)的共有40人，占36.0%。UHRF1高表達(dá)組患者術(shù)后腫瘤局部復(fù)發(fā)有33人，復(fù)發(fā)率為50.0%，低表達(dá)組復(fù)發(fā)7人，復(fù)發(fā)率為15.6%。使用Fisher確切概率法比較兩組患者術(shù)后局部復(fù)發(fā)的差異，結(jié)果如圖2所示，UHRF1高表達(dá)的患者其術(shù)后復(fù)發(fā)率明顯高于低表達(dá)組(P<0.001)。

***：P<0.001

2.4 UHRF1表達(dá)水平對(duì)患者頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響

本研究中，出現(xiàn)術(shù)后頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者共20例，占18.0%，其中UHRF1高表達(dá)組中，頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者有16例，占24.2%；低表達(dá)組術(shù)后頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移4例，占8.9%。使用Fisher確切概率法比較兩組患者頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的差異，結(jié)果如圖3所示，高表達(dá)組的頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯高于低表達(dá)組(P=0.046)。

*：P<0.05

2.5 UHRF1表達(dá)水平對(duì)患者病理淋巴結(jié)陽(yáng)性的影響

入組患者術(shù)中接受選擇性頸淋巴結(jié)清掃的有83人，19人病理淋巴結(jié)陽(yáng)性，占22.9%。其中，UHRF1高表達(dá)組中18人病理淋巴結(jié)陽(yáng)性，占所有病理淋巴結(jié)陽(yáng)性患者的94.7%。使用Fisher確切概率法比較兩組患者病理淋巴結(jié)陽(yáng)性的差異，結(jié)果顯示，在UHRF1高表達(dá)組與低表達(dá)組患者之間，病理淋巴結(jié)陽(yáng)性率存在顯著差異(36.0%vs.3.0%，P<0.001，圖4)。

***：P<0.001

2.6 UHRF1表達(dá)水平對(duì)患者生存率的影響

UHRF1表達(dá)水平對(duì)患者生存率的影響如圖5所示，使用Log rank比較兩組間生存率的差異，結(jié)果顯示，UHRF1高表達(dá)組與低表達(dá)組之間，患者的5年總體生存率(33.3%vs.73.3%，P<0.001)、疾病特異性生存率(37.3%vs.76.7%，P<0.001)和無(wú)疾病生存率(28.8%vs.71.1%，P<0.001)均存在明顯差異。

UHRF1低表達(dá)組與高表達(dá)組患者總體生存率(A)、疾病特異性生存率(B)及無(wú)疾病生存率(C)之間的差異(P<0.001)

2.7 Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型

在單變量分析中，浸潤(rùn)深度的大小(P=0.001)、UHRF1表達(dá)(P<0.001)、隱匿性淋巴結(jié)陽(yáng)性(P=0.005)、術(shù)后局部復(fù)發(fā)(P<0.001)及術(shù)后頸淋巴轉(zhuǎn)移(P<0.001)均與患者的生存率有關(guān)(表2)。通過(guò)單變量分析，我們篩選出與患者生存率相關(guān)的危險(xiǎn)因素進(jìn)行多變量分析，結(jié)果顯示，腫瘤組織的UHRF1表達(dá)水平(P=0.002)、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001)及術(shù)后局部復(fù)發(fā)(P<0.001)是影響患者生存率的重要危險(xiǎn)因素(表3)。

表2 患者單變量Cox回歸分析

表3 患者多變量Cox回歸分析

3 討 論

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的重要組成部分，其發(fā)病率占全身惡性腫瘤的3%～5%[13]。盡管治療技術(shù)和理念在不斷進(jìn)步，但口腔鱗癌的總體生存率并沒有顯著改善。術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者手術(shù)失敗的主要原因，一旦出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，患者的生存率則明顯下降[14]。因此，如何控制術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。

影響口腔癌患者預(yù)后的主要因素包括腫瘤的發(fā)生部位、大小、病理分級(jí)、浸潤(rùn)深度(depth of Invasion，DOI)、淋巴結(jié)外擴(kuò)展(extranodal extension，ENE)、神經(jīng)周侵犯(perineural invasion，PNI)、脈管栓塞、切緣陽(yáng)性等[15]。但在臨床上發(fā)現(xiàn)，即使一些預(yù)后指標(biāo)良好的口腔癌患者，術(shù)后復(fù)發(fā)及頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率也很高。因此，影響口腔鱗癌預(yù)后的指標(biāo)可能遠(yuǎn)不止以上這些。隨著對(duì)口腔鱗癌生物學(xué)分子機(jī)制的探索，許多影響腫瘤侵襲與增殖的相關(guān)分子也被用于指導(dǎo)患者的治療及預(yù)后，如DLX6、CLDN17等[16-17]。而大量的研究顯示，UHRF1在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，并與腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲、增殖等惡性行為密切相關(guān)[6-9]，但是UHRF1在OSCC中的表達(dá)及功能研究甚少。

本研究通過(guò)免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)UHRF1在OSCC腫瘤組織中明顯高表達(dá)(P<0.001)，UHRF1表達(dá)水平與患者的性別、腫瘤大小及浸潤(rùn)深度有關(guān)(P<0.05)。另外，浸潤(rùn)深度已被納入第八版TNM分期系統(tǒng)，對(duì)口腔癌患者的頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后局部復(fù)發(fā)及生存率有很好的預(yù)測(cè)作用，是影響患者預(yù)后的重要危險(xiǎn)因素[18]。而本研究數(shù)據(jù)表明，UHRF1高表達(dá)的患者，其浸潤(rùn)深度也較高(P<0.001)。其次，數(shù)據(jù)顯示，患者的性別也與UHRF1表達(dá)水平有關(guān)，男性患者的UHRF1表達(dá)水平明顯高于女性患者(P=0.014)，這可能與男性患者吸煙量多于女性有關(guān)。據(jù)報(bào)道，安徽省30歲以上的男性吸煙人數(shù)比例高達(dá)57.6%，而女性僅為5.8%[19]。在Unoki等[7]的研究中也發(fā)現(xiàn)，UHRF1在男性患者中的表達(dá)水平顯著高于女性患者，且與患者的吸煙有關(guān)，這與本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)一致。

腫瘤的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)是導(dǎo)致口腔鱗癌患者預(yù)后不良的主要因素[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，UHRF1的表達(dá)水平與患者的術(shù)后局部復(fù)發(fā)(P<0.001)及頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P=0.046)。UHRF1高表達(dá)的口腔癌患者通常存在著較高的術(shù)后局部復(fù)發(fā)率及頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，因此對(duì)于UHRF1高表達(dá)的患者，應(yīng)給予更為積極的治療方式，包括同期頸淋巴結(jié)清掃或增加術(shù)后輔助治療，提高患者的生存率。

為提高患者生存率，如何在早期識(shí)別出頸部轉(zhuǎn)移及何時(shí)選擇頸淋巴清掃術(shù)尤為重要，因?yàn)榧词故窃缙贠SCC中仍約有20%的頸部隱匿性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)法發(fā)現(xiàn)[20]。對(duì)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)較大的OSCC患者，可以在術(shù)中選擇頸淋巴結(jié)清掃，提高患者術(shù)后的生存率。本研究入組患者共有83例術(shù)中行頸淋巴結(jié)清掃，術(shù)后19例病理示淋巴結(jié)陽(yáng)性，其中18例的UHRF1高表達(dá)。數(shù)據(jù)顯示UHRF1表達(dá)水平與病理淋巴結(jié)陽(yáng)性有顯著關(guān)系(P<0.001)，UHRF1高表達(dá)的口腔鱗癌患者，其病理淋巴結(jié)陽(yáng)性率也較高。通過(guò)分析OSCC患者中UHRF1表達(dá)水平與生存率之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示，UHRF1高表達(dá)的OSCC患者的5年總體生存率、疾病特異性生存率和無(wú)疾病生存率均顯著低于低表達(dá)組的患者(P<0.001)。在單變量分析中，UHRF1表達(dá)水平、浸潤(rùn)深度、病理淋巴結(jié)陽(yáng)性、術(shù)后局部復(fù)發(fā)及術(shù)后頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移影響患者生存率的暴露因素(P<0.05，表2)。而多變量分析結(jié)果顯示，UHRF1表達(dá)水平(HR：2.93，95%CI：1.48～5.81，P=0.002)、術(shù)后頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR：2.75，95%CI：1.56～4.83，P<0.001)及術(shù)后局部復(fù)發(fā)(HR：3.20，95%CI：1.81～5.68，P<0.001)是影響患者生存率的危險(xiǎn)因素，UHRF1作為影響OSCC患者生存率的重要危險(xiǎn)因素，其高表達(dá)組死亡風(fēng)險(xiǎn)是低表達(dá)組的2.93倍。

目前，UHRF1在腫瘤中的作用尚存在爭(zhēng)議。盡管大量的研究表明，高表達(dá)的UHRF1與患者的不良預(yù)后有關(guān)[6-9]，但在肝癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，UHRF1缺陷型的癌細(xì)胞，可以誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，從而增加細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力[21]。而我們的研究結(jié)果顯示，UHRF1在口腔鱗癌腫瘤組織中表達(dá)水平明顯高于侵襲前沿及癌旁正常組織(P<0.001)。在口腔鱗癌患者中，UHRF1的高表達(dá)的意味著更高的腫瘤局部復(fù)發(fā)率及頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率(P<0.05)，這些患者的生存率也明顯降低(P<0.001)，UHRF1可以作為口腔鱗癌重要的預(yù)后指標(biāo)。但UHRF1引起口腔鱗癌發(fā)生、發(fā)展、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的機(jī)制還需進(jìn)一步探索。