Mg-2Zn-0.5Ca合金/礦化膠原復(fù)合物修復(fù)兔下頜骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

王樹峰，陳苗苗，王程越

目前，在臨床上廣泛應(yīng)用的醫(yī)用材料有鈦合金、不銹鋼及聚乳酸等，這些材料有以下缺點(diǎn)：應(yīng)力遮擋、機(jī)械性能差、生物相容性差、降解性差等。醫(yī)用鎂合金有以下優(yōu)點(diǎn)：可降解性、彈性模量與人皮質(zhì)骨接近、較高的機(jī)械強(qiáng)度、良好的骨誘導(dǎo)性等，在骨缺損修復(fù)材料方面，鎂合金有很好的研究?jī)r(jià)值及應(yīng)用潛力[1]。本研究用Mg-2Zn-0.5Ca/礦化膠原復(fù)合物修復(fù)下頜骨缺損，對(duì)其在頜骨內(nèi)的特性進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

40只日本大耳兔(徐州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室)，雌雄不限，體重2 kg左右。Mg-2Zn-0.5Ca合金塊(北京聯(lián)合大學(xué)):長(zhǎng)10 mm、寬7 mm、厚2 mm，羥基磷灰石粉末(北京聯(lián)合大學(xué)，規(guī)格20 nm)，Ⅰ型膠原蛋白(北京奧精醫(yī)學(xué)，規(guī)格100 μL)。電鉆、常規(guī)手術(shù)器械等。本實(shí)驗(yàn)中的動(dòng)物手術(shù)過程嚴(yán)格按照徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理(批準(zhǔn)號(hào)202109A024)委員會(huì)的規(guī)章(2021-017)要求進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 Mg-2Zn-0.5Ca合金/礦化膠原制備 羥基磷灰石粉(材料質(zhì)量占比45%)與Ⅰ型膠原蛋白(0.001 g/mL)加入在0.4 mol/L的鹽酸中并攪拌均勻，然后與去離子水按照1.5 g/mL的比例攪拌均勻2 h，加入氯化鈉(濃度0.9 mol/L)和氫氧化鉀(濃度0.45 mol/L)調(diào)節(jié)pH值至8，最后離心溶液，將Mg-2Zn-0.5Ca合金放入溶液中，冷凍干燥，高溫高壓滅菌，密封常溫保存。

1.2.2 手術(shù)操作 稱重后進(jìn)行全身麻醉，經(jīng)兔耳緣靜脈注射20%烏拉坦(1 000 mg/kg)。在手術(shù)區(qū)剔除兔下頜區(qū)的體毛，碘伏(濃度1%)消毒，無菌條件下局部注射2%利多卡因浸潤(rùn)麻醉，沿下頜骨下緣行25 mm切口，注意保護(hù)兔頜下區(qū)動(dòng)靜脈。剝離分開下頜骨外側(cè)壁、口底肌肉及骨，定位置用鉆滴水降溫下切割成10 mm×7 mm×2 mm頜骨缺損，A組植入Mg-2Zn-0.5Ca合金/礦化膠原復(fù)合物；B組植入礦化膠原；C組植入Mg-2Zn-0.5Ca合金材料；D組不植入材料。進(jìn)行常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，肌注慶大霉素4×104U/只，連續(xù)3 d[2]。鎂合金植入的位置見手術(shù)照片及CT圖的箭頭所指的位置(圖1)。

A：植入Mg-2Zn-0.5Ca合金/礦化膠原復(fù)合物的手術(shù)過程；B：植入Mg-2Zn-0.5Ca合金/礦化膠原復(fù)合物術(shù)后的CT，箭頭所指的方向就是材料植入的位置

1.2.3 大體觀察 在術(shù)后觀察動(dòng)物的進(jìn)食狀況、活動(dòng)狀況、體重有無改變，創(chuàng)口有無紅腫、溢膿出現(xiàn)等。

1.2.4 血清學(xué)觀察 在術(shù)前3 d和術(shù)后第1、4、8、12周A、B、C、D組抽取5 mL兔耳動(dòng)脈血和尿液，檢測(cè)血液和尿液的鎂離子濃度。

1.2.5 放射學(xué)檢查 在術(shù)后12周對(duì)植入材料的位置進(jìn)行X線片拍攝，觀察鎂合金材料與周圍骨組織的狀況。

1.2.6 掃描電鏡觀察 在術(shù)后12周取出A組和C組動(dòng)物體內(nèi)植入物，用PBS沖洗，2%戊二醛固定，進(jìn)行乙醇溶液梯度脫水，真空干燥6 h，噴金后進(jìn)行掃描電鏡觀察。

1.2.7 組織學(xué)觀察 在術(shù)后12周，取材料周圍5 mm范圍內(nèi)的骨組織，進(jìn)行4%甲醛固定，15%EDTA脫鈣處理，每隔4 d換1次脫鈣液，共3周。對(duì)標(biāo)本流水沖洗過夜，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，HE染色，進(jìn)行光鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 21進(jìn)行方差分析。P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 術(shù)后大體觀察結(jié)果

術(shù)后30 min，日本大耳兔精神萎靡。術(shù)后前3 d的進(jìn)食較平時(shí)緩慢，術(shù)后第4天進(jìn)食基本達(dá)到術(shù)前水平。在12周內(nèi)，無動(dòng)物死亡，生長(zhǎng)良好。傷口均為一期愈合。

2.2 血及尿中鎂離子濃度的檢測(cè)結(jié)果

術(shù)后第1、4、8、12周A、C組兔血清中鎂離子濃度均高于術(shù)前3 d，P>0.05，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A組與C組進(jìn)行比較，F(xiàn)=2.04，P>0.05，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A組與B組進(jìn)行比較，F(xiàn)=1.96，P>0.05，無顯著性差異；A組與D組進(jìn)行比較，F(xiàn)=2.11，P>0.05，無顯著性差異(表1)。術(shù)后第1、4、8、12周A組動(dòng)物尿中的鎂離子濃度高于術(shù)前3 d，F(xiàn)=2.52，P>0.05，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后第1、4、8、12周C組動(dòng)物尿中的鎂離子濃度高于術(shù)前3 d，F(xiàn)=24.36，P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A組與C組進(jìn)行比較，F(xiàn)=40.18，P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；B組術(shù)前與術(shù)后無顯著性差異，F(xiàn)=2.38，P>0.05；D組術(shù)前與術(shù)后無顯著性差異，F(xiàn)=2.42，P>0.05；A組與B組進(jìn)行比較，F(xiàn)=2.01，P>0.05，無顯著性差異；A組與D組進(jìn)行比較，F(xiàn)=2.42，P>0.05，無顯著性差異(表2)。

表1 4組血清中鎂離子濃度生化檢測(cè)結(jié)果

表2 4組尿中鎂離子濃度生化檢測(cè)結(jié)果

2.3 X線片檢查結(jié)果

A 組和C組材料周邊有不同程度的降解，A組鎂合金材料周邊與骨組織之間無陰影，結(jié)合良好。C組比A材料周圍降解更明顯，材料與骨組織之間有陰影，成骨速度比材料降解速度慢。B組骨組織愈合良好，無明顯陰影；D組有低密度影，骨質(zhì)較疏松，形成的新生的骨組織相對(duì)較少(圖2)。

箭頭所指的方向是材料與骨組織接觸位置

2.4 SEM觀察

B組和D組因沒有植入鎂合金材料，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果只是觀察金屬材料表面的變化，所以只對(duì)植入鎂合金材料的動(dòng)物標(biāo)本做的電鏡掃描。A組近骨組織材料表面變粗糙，有較小的裂隙，降解不明顯，有骨組織附著；C組表面可見明顯的鄆裂和崩解現(xiàn)象，表面沒有明顯的組織附著(圖3)。

A組，箭頭所指的方向材料表面變粗糙和骨組織附著；C組，箭頭所指方向材料表面有明顯的皸裂

2.5 組織學(xué)觀察

術(shù)后12周，A組材料周圍可見成骨細(xì)胞，有明顯骨小梁結(jié)構(gòu)；C組可見有軟骨樣組織，沒有發(fā)現(xiàn)明顯骨小梁結(jié)構(gòu)；B組可見有明顯的成骨細(xì)胞和骨小梁結(jié)構(gòu);D組有空白區(qū)，見有少量的骨組織及纖維組織，骨組織疏松(圖4)。

A、B組箭頭所指方向是明顯的骨小梁結(jié)構(gòu)；C組箭頭所指的方向是軟骨樣的組織；D組材料所指的方向疏松的骨組織

3 討 論

鎂是人體新陳代謝的必需物質(zhì)，是人體儲(chǔ)量第4的陽離子，在骨組織中質(zhì)量約占50%，有調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖與分化、參與體內(nèi)多種組織的新陳代謝等作用[3]。鎂的密度及彈性模量接近天然骨(1.8～2.1 g/cm3，20～27 GPa),減少了應(yīng)力屏障，從而降低植入物不穩(wěn)定的可能性[4]。研究發(fā)現(xiàn)，鎂基合金材料在降解的過程中最終以鎂離子的形式激發(fā)相關(guān)的成骨通路[5-6]。鎂合金在體內(nèi)會(huì)降解產(chǎn)生一定濃度的Mg2+，能促進(jìn)鈣鹽的沉積[5]。鎂離子及其周圍環(huán)境可以增加骨形態(tài)發(fā)生蛋白，進(jìn)而局部促進(jìn)新骨的形成[7]。

鋅和鈣是人體內(nèi)的微量和富含元素。鋅是活潑元素，合金中鋅含量增加，在降解過程中可在合金表面形成保護(hù)層，提高了力學(xué)性能，降低腐蝕速率[8]。鋅在許多酶中有著重要作用，參與多種細(xì)胞內(nèi)代謝活動(dòng)和功能，還可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化[9-10]。鈣可促進(jìn)骨的生長(zhǎng)，鈣的增加有助于晶界強(qiáng)化，提高了鎂基合金的耐腐蝕性,有利于細(xì)胞的活力及增殖[11]。

礦化膠原是一種有機(jī)-無機(jī)復(fù)合材料，其主要成分為納米羥基磷灰石和膠原[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，具有多孔結(jié)構(gòu)的礦化膠原在組織結(jié)構(gòu)上與天然骨相似，有助于細(xì)胞的生長(zhǎng)和形成新生骨[13]。但是機(jī)械強(qiáng)度較差，在體內(nèi)與人體組織相結(jié)合的過程中難以維持足夠的成骨空間，從而不能形成良好的成骨效果[14]。單純鎂合金具有一定的生物相容性、成骨能力及機(jī)械性能，但仍存在降解速度過快等缺點(diǎn),對(duì)不同類型鎂基材料復(fù)合并進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能修飾研究有很大的潛力，可以作為修復(fù)材料的研究方向[15]。本實(shí)驗(yàn)通過組織學(xué)的結(jié)果顯示，Mg-2Zn-0.5Ca合金/礦化膠原組降解的材料邊緣有成骨細(xì)胞和骨小梁結(jié)構(gòu)，在一定程度上可以說明Mg-2Zn-0.5Ca/礦化膠原復(fù)合物在降解的過程中有新骨的形成。但是，Mg-2Zn-0.5Ca合金降解的材料邊緣有軟骨樣組織，無明顯骨小梁結(jié)構(gòu)形成。X線片顯示，Mg-2Zn-0.5Ca合金/礦化膠原與骨組織結(jié)合緊密，沒有明顯的陰影，而單純的Mg-2Zn-0.5Ca合金與骨組織之間有明顯的陰影。單純的Mg-2Zn-0.5Ca合金降解速率過快，可能阻礙了成骨細(xì)胞和骨小梁結(jié)構(gòu)的形成。從本實(shí)驗(yàn)的尿中鎂離子濃度結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，單純的Mg-2Zn-0.5Ca合金組的鎂離子濃度明顯升高，有顯著性差異，高于Mg-2Zn-0.5Ca合金/礦化膠原組，說明單純的Mg-2Zn-0.5Ca合金的降解速度較快。在以前的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)單純的鎂合金降解與新骨生成速率不匹配，鎂合金的一側(cè)降解速度較快而沒有形成足夠的新骨[16]。Brown等[17]利用純鎂顆粒和聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)通過制備成多孔鎂/PLGA復(fù)合物支架，其可降低PLGA導(dǎo)致的炎癥，并且增加了新骨的形成。本實(shí)驗(yàn)與以前實(shí)驗(yàn)證明，Mg-2Zn-0.5Ca合金/礦化膠原具有良好的生物相容性[18]。單純的Mg-2Zn-0.5Ca合金降解速率及鎂鈣鋅成分對(duì)新的骨組織影響多大，有待需要進(jìn)一步加深研究。

在鎂基合金材料降解的過程中產(chǎn)生的Mg2+如果無法正常代謝，血清中鎂離子濃度會(huì)增大(超過1.05 mmol/L)，會(huì)導(dǎo)致肌肉癱瘓和呼吸困難等癥狀[19]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)術(shù)前及術(shù)后1周到12周的兔血清學(xué)檢查，結(jié)果顯示A組的血清鎂離子濃度均小于0.90 mmol/L。血清學(xué)檢查結(jié)果表明，Mg-2Zn-0.5Ca合金/礦化膠原復(fù)合物作為植入材料，兔體內(nèi)血清鎂離子濃度不會(huì)升高。尿中生化檢測(cè)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)鎂離子能夠通過腎臟途徑正常排泄。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明鎂合金降解產(chǎn)生的大部分Mg2+經(jīng)過腎臟排出體外，在血液中殘留很少，從而不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生副作用。

Mg-2Zn-0.5Ca/礦化膠原復(fù)合物既有鎂合金的高強(qiáng)度又有降解可控的性能，同時(shí)鎂合金降解產(chǎn)物呈堿性，能中和局部酸性變化，是理想的植入材料。鎂基合金是一種可降解的金屬材料，植入體內(nèi)不會(huì)引起急性及明顯的炎癥反應(yīng)，并且能滿足所需的機(jī)械強(qiáng)度[20]。通過本實(shí)驗(yàn)的掃描電鏡結(jié)果顯示，Mg-2Zn-0.5Ca合金/礦化膠原復(fù)合物表面變粗糙并有骨組織附著，未見明顯的層狀崩解現(xiàn)象。有文獻(xiàn)表明，材料粗糙的表面促進(jìn)了材料與細(xì)胞的相互作用，助于促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)[21]。而單純Mg-2Zn-0.5Ca出現(xiàn)明顯的鄆裂和崩解現(xiàn)象且材料表面相對(duì)光滑，沒有組織附著。從這也可以看出降解的Mg-2Zn-0.5Ca合金/礦化膠原復(fù)合物有利于組織的附著，相反降解的Mg-2Zn-0.5Ca合金抑制了組織的附著。作為植入體內(nèi)的材料不僅要有良好的機(jī)械性能和合適的降解速率，還要有促進(jìn)新骨形成的能力。由于人體內(nèi)的骨組織是復(fù)雜的，因而最有研究?jī)r(jià)值的植骨材料幾乎都是由兩種或兩種以上成分整合而成，從而彌補(bǔ)單一材料各自的缺點(diǎn)[22]。從國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究中發(fā)現(xiàn)鎂鋅鈣合金的優(yōu)點(diǎn)較多，所以實(shí)驗(yàn)所用的材料是Mg-2Zn-0.5Ca合金/礦化膠原復(fù)合物。在本實(shí)驗(yàn)對(duì)Mg-2Zn-0.5Ca合金/礦化膠原復(fù)合物進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在一定程度上減緩了鎂合金的降解速度，促進(jìn)了骨缺損周圍新的骨組織形成。

4 結(jié) 論

Mg-2Zn-0.5Ca合金/礦化膠原復(fù)合物不會(huì)造成血清中鎂含量增高，在一定程度上可以降低降解速率，并且具有良好的成骨性能。