基于脂肪酸組成特征的沙丁魚油摻偽檢測

曹蓉露 陳小娥，* 宋詩軍 董芮娟 張 芳 馬宇喬 王曉燕

（1浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316022；2舟山新諾佳生物工程有限公司，浙江舟山 316101）

魚油中富含不飽和脂肪酸，隨著對魚油研究的深入以及大眾對自身健康的重視，國內(nèi)外魚油消費市場逐年擴大，由此導(dǎo)致魚油原料供應(yīng)緊張。在利益驅(qū)使下，魚油原料市場摻偽問題日益突出，主要是向高品質(zhì)魚油中添加低價值的魚油，以次充好［1］。魚油加工企業(yè)多采用氣相色譜法測定魚油原料的脂肪酸組成，一般僅關(guān)注多不飽和脂肪酸二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docose hexaenoie acid，DHA）含量是否符合標準，而在原料真實性判定方面缺乏科學(xué)依據(jù)，在質(zhì)量監(jiān)管方面存在較大的困難。因此，需要建立一種準確、高效的魚油摻偽鑒別模型。

化學(xué)計量學(xué)方法是一類分析方法的統(tǒng)稱，包括主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）等。近年來，不少學(xué)者將這種方法用于油類的摻偽鑒別，并已在山茶油［2］、橄欖油［3］、葡萄籽油［4］等食品中成功應(yīng)用，但有關(guān)魚油摻偽方面的研究仍鮮見報道。每種魚都有其特征脂肪酸，摻偽后其特征脂肪酸含量必然會發(fā)生改變。鑒于此，本研究擬采用化學(xué)計量學(xué)方法，結(jié)合多元逐步線性回歸分析建立摻偽模型，達到高效判別原料真實性的目的。

近年來，沙丁魚（Sardine pilchardus）因生長快、繁殖能力強等優(yōu)點而被大量捕獲和消費，成為一種被市場認可的魚油保健品生產(chǎn)原料。沙丁魚體內(nèi)含油量較高，魚油中富含EPA和DHA，具有降低膽固醇、預(yù)防心腦血管疾病的作用［5-6］。沙丁魚油中的棕櫚油酸和肉豆蔻酸含量也較高。棕櫚油酸不僅在降血糖、預(yù)防動脈粥樣硬化方面有突出表現(xiàn)，而且還有抑制脂肪生成的功能［7-9］。肉豆蔻酸具有比其他飽和脂肪酸更高的抗氧化活性，有助于α-亞麻酸轉(zhuǎn)化為DHA；長期攝入肉豆蔻酸能夠增加骨骼肌中的葡萄糖攝取量，從而避免高血糖的發(fā)生［10］。

我國沙丁魚生產(chǎn)企業(yè)的魚油原料多為進口毛油，由于沙丁魚毛油進口成本高、資源短缺，沙丁魚油市場中存在不良廠家用某些價格低廉的魚油摻偽的問題。本研究以沙丁魚油為試驗對象，采用氣相色譜儀測定沙丁魚及幾種可能摻偽海水魚的脂肪酸組成，利用PCA分析和PLS-DA分析找出可能摻偽的魚種以及沙丁魚油的特征脂肪酸，同時結(jié)合多元逐步線性回歸分析建立摻偽鑒別模型，以期為今后鑒別魚油摻偽提供新的思路，為沙丁魚油原料的質(zhì)量控制及后續(xù)開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙丁魚油、鳀魚油各18批，帶魚油、鰹魚油和鮐魚油各15批，均由浙江舟恒海洋生物科技有限公司提供；白姑魚共15批，購于舟山豐茂菜場；甲苯、甲醇、正己烷均為色譜純，默克化工技術(shù)（上海）有限公司；甲醇鈉、無水硫酸鈉均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑上海有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B氣相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；TDZ5-WS低速多管離心機，長沙湘智離心機儀器有限公司；HH-6系列恒溫水浴鍋，金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 油樣制備魚油樣品準備：取沙丁魚油、鳀魚油、帶魚油、鰹魚油和鮐魚油直接進行后續(xù)試驗。白姑魚油為實驗室條件下制備，提取步驟參照宋恭帥等［11］的方法。

沙丁魚油摻偽油樣制備：沙丁魚油中分別摻入質(zhì)量分數(shù)為10%、20%、30%、40%、50%的待混魚油（如100 g的10%摻偽油，即將10 g鳀魚加入到90 g沙丁魚油中混合而成），進行氣相色譜分析，每組5個平行樣。

1.3.2 脂肪酸分析脂肪酸甲酯化：取25 mg魚油樣品于具塞玻璃試管中，先加入1 mL甲苯和2 mL 0.5 mol·L-1甲醇鈉溶液，再往具塞玻璃試管中充氮氣并蓋好蓋子，充分振搖后，置于50℃水浴中反應(yīng)1 h。待冷卻至室溫后，加入1 mL飽和食鹽水和2 mL正己烷，充分振蕩，1 500 r·min-1離心10 min。取離心后的上層液于裝有2 mL蒸餾水的干凈試管中，振搖，靜置。最后，取靜置后的上層液于盛有無水硫酸鈉的試管中，搖勻后裝入具塞試管［12］。

氣相色譜條件：安捷倫Hp-innowax 60 m色譜柱（60 m×0.32 mm×0.50μm）；進樣口和檢測器溫度均保持在270℃；載氣為高純氮氣，進樣量1 μL，流速1 mL·min-1，分流比1∶10。升溫程序：起始溫度180℃，保持2 min；以10℃·min-1的速度升溫至210℃，保持3 min；然后以10℃·min-1的速度升溫至230℃，保持12 min；最后以10℃·min-1的速度升溫至250℃，保持18 min。

1.3.3 脂肪酸相對含量計算采用面積歸一化法計算樣品的脂肪酸相對百分含量［13］，每組5個平行樣。試樣中某個脂肪酸的相對含量（）按下式計算：

式中，Ai為測定液中各脂肪酸甲酯的峰面積；Fi為各脂肪酸甲酯組分轉(zhuǎn)換成脂肪酸的系數(shù)。

1.4 化學(xué)計量學(xué)分析

對6種魚油樣品的脂肪酸數(shù)據(jù)進行PCA分析，PCA分析提取前2個主成分，當總貢獻率（principal component，PC）達到80%以上［14］，即表示主成分包含所測樣品的大部分信息。

對摻偽魚油進行PLS-DA分析，將分類Y矩陣的變量隨機排列200次得置換檢驗圖，當模型解釋率參數(shù)（R2）與Y軸的截距小于0.3，模型預(yù)測能力參數(shù)Q2與Y軸的截距小于0.05時，說明PLS-DA分析具有較好的判別準確性［15-16］。VIP代表每個樣品在PLS-DA分析中樣本的貢獻度，一般認為VIP值大于1的變量為顯著變量［17］。

1.5 摻偽數(shù)學(xué)模型建立及驗證

本研究的沙丁魚油摻偽鑒別模型在SPSS 25軟件中構(gòu)建，建立以沙丁魚油特征脂肪酸含量為自變量（X），摻偽百分含量為因變量（Y）的多元逐步線性回歸模型。本研究中的摻偽百分含量為：

式中，a1，a2…an為待定系數(shù)；a0，b為常數(shù)。

建立模型后，取沙丁魚油和鳀魚油各3批樣品進行模型準確性驗證。將質(zhì)量分數(shù)為10%、20%、30%、40%、50%的鳀魚油摻入沙丁魚油中，每種質(zhì)量分數(shù)為一組，另取沙丁魚油樣品為一組，共6組進行驗證。每組5個平行樣，最終結(jié)果取各組平均值。

1.6 數(shù)據(jù)處理

脂肪酸數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差的形式表示，在SPSS 25軟件中，采用Duncan新復(fù)極差法對脂肪酸數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，P<0.05則認為差異存在統(tǒng)計學(xué)意義；采用Origin 2021軟件對6種魚油樣品的脂肪酸數(shù)據(jù)進行PCA分析；采用SIMCA 14.1軟件對摻偽魚油進行PLS-DA分析，并運用SPSS 25軟件建立摻偽數(shù)學(xué)模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種魚油脂肪酸組成分析

由表1可知，沙丁魚油中飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）含量為39.40%，其中棕櫚酸（C16∶0）的含量最高，為20.88%。不飽和脂肪酸含量為60.60%，包括3種多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）和4種單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA），含量分別為32.15%和28.45%，其中EPA（C20∶5）含量為18.55%，DHA（C22∶6）含量為11.73%，EPA含量大于DHA，這與張蒙娜等［18］的研究結(jié)果一致。

從表1還可以看出，沙丁魚油的脂肪酸組成中棕櫚酸（C16∶0）、油酸（C18∶1）和EPA所占比例超過50%，占比越高越具有代表性，說明這3種脂肪酸有可能是沙丁魚油的特征脂肪酸。值得一提的是，油酸不僅對黃曲霉毒素引發(fā)的肝細胞損傷具有保護作用［19］，而且還能減輕鎘誘導(dǎo)的氧化損傷，從而減緩人體鎘中毒的反應(yīng)［20］。通過與另外5種魚油進行比較發(fā)現(xiàn)，沙丁魚油脂肪酸組成中肉豆蔻酸（C14∶0）、棕櫚油酸（C16∶1）和EPA含量整體顯著高于其他5種魚油，也可能是沙丁魚油的特征脂肪酸。因此，可以考慮將棕櫚酸、油酸、肉豆蔻酸、棕櫚油酸和EPA作為特征脂肪酸。

表1 6種魚油脂肪酸組成Table 1 Fatty acid composition of six fish oils

2.2 6種魚油脂肪酸比值分析

為了比較不同魚油脂肪酸組成的差異，對EPA/C18∶1、（C14∶0+C16∶1）/C18∶1和C16∶1/C16∶0的脂肪酸比值進行比較分析（圖1）。結(jié)果表明，3組脂肪酸比值存在不同程度的差異。EPA/C18∶1的比值位于0.41～1.18之間，鳀魚、鮐魚、鰹魚和沙丁魚的比值較為接近；鰹魚、白姑魚（C14∶0+C16∶1）/C18∶1的比值位于0.25～0.26之間，而鮐魚、帶魚、鳀魚（C14∶0+C16∶1）/C18∶1的比值位于0.75～1.21之間，與沙丁魚的比值（1.23）相近；C16∶1/C16∶0的比值從大到小依次為沙丁魚>鳀魚>鮐魚>帶魚>白姑魚>鰹魚。綜上，鳀魚、鮐魚和沙丁魚的脂肪酸比值最為接近，說明其可能具有相似的脂肪酸特征，可對其進行進一步比較。

圖1 6種魚油脂肪酸比值分析Fig.1 Fatty acid ratio analysis of six fish oils

2.3 6種魚油主成分分析（PCA）

通過PCA分析可對數(shù)據(jù)進行降維處理，將多個變量轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個綜合變量。以主成分作為新坐標，通過SIMCA-P11.5軟件對數(shù)據(jù)進行投影分析，達到高維數(shù)據(jù)的低維直觀可視化［21］。

為了驗證上述結(jié)果，將表1中6種魚油的脂肪酸組成作為數(shù)據(jù)集，進行PCA分析（圖2）。第一主成分貢獻率為63.7%，第二主成分貢獻率為26.1%，總貢獻率為89.8%，具有良好的代表性［14］。從圖2還可以看出，沙丁魚油與鳀魚油較為接近，與其他幾種魚可以明顯區(qū)分，表明沙丁魚油脂肪酸與鳀魚油脂肪酸主成分特征相近，證明鳀魚油具備摻偽沙丁魚油的條件。因此選擇鳀魚魚油進行后續(xù)試驗。

圖2 6種魚油脂肪酸PCA得分圖Fig.2 PCA score chart of six fish oil fatty acids

2.4 摻偽魚油偏最小二乘判別分析（PLS-DA）

PLS-DA分析可以預(yù)設(shè)分類，并量化特征化合物造成組分差異的程度［21］。為找出摻偽油的脂肪酸組成特征，本研究將沙丁魚油和不同質(zhì)量分數(shù)梯度的鳀魚油脂肪酸組成作為數(shù)據(jù)集，進行PLS-DA分析（圖3）。結(jié)果表明，50%鳀魚油摻偽（26～30）與沙丁魚油（1～5）存在明顯區(qū)別，而10%鳀魚油摻偽（6～10）與沙丁魚油距離較近，說明沙丁魚油在少量摻偽時差異較小，不易區(qū)分。PLS-DA分析共提取5個主成分，主成分總貢獻率為85.65%。由表2可知，R2X為0.947，R2Y為0.696，Q2為0.515，均大于0.5，說明所建模型具有較強的解釋率和預(yù)測力［22］。

圖3 摻偽油脂肪酸PLS-DA得分圖Fig.3 PLS-DA score chart of adulterated oil fatty acids

表2 摻偽油脂肪酸PLS-DA擬合結(jié)果Table 2 PLS-DA fitting results of adulterated fatty acids

為了驗證PLS-DA分析是否存在過度擬合現(xiàn)象，將分類Y矩陣的變量隨機排列200次做置換檢驗，結(jié)果見圖4。R2擬合直線在Y坐標軸的截距為0.148，小于0.3，Q2擬合直線在Y坐標軸的截距為-0.427，小于0.05，說明PLS-DA分析結(jié)果可靠［16］，不存在過度擬合現(xiàn)象，能夠?qū)絺紊扯◆~油進行判別分析。

圖4 PLS-DA的200次置換檢驗圖Fig.4 200 permutation test chart of PLS-DA

變量投影重要性（variable important in projection，VIP）可以用于評價各個變量對分類的貢獻程度，當VIP值大于1，即認為其在判別過程中有重要作用［23］。圖5為摻偽油脂肪酸PLS-DA分析的VIP得分圖，結(jié)果表明，EPA、DHA、棕櫚酸、棕櫚油酸、二十二碳烯酸和油酸這6種脂肪酸VIP值均大于1，可作為摻偽油的特征脂肪酸。

圖5 摻偽油脂肪酸PLS-DA分析的VIP得分圖Fig.5 VIP score diagram for PLS-DA model of adulterated oil fatty acid

2.5 基于多元逐步線性回歸分析的沙丁魚油摻偽鑒定

2.5.1 沙丁魚油摻偽鑒別模型建立多元逐步線性回歸分析是將變量逐個引入的分析方法，將變量逐個引入的同時去除不顯著的變量，得到模型的最優(yōu)解［24］。表3為沙丁魚油摻偽鑒別模型，此模型以沙丁魚油特征脂肪酸含量為自變量，以摻偽百分含量為因變量，將6個特征脂肪酸作為變量逐步引入，經(jīng)軟件計算最終得到5個鑒別模型。其中模型1的R2為0.775，小于0.9，表明模型1預(yù)測準確性較低，故不作為后續(xù)預(yù)測的摻偽模型。其余模型R2均大于0.9，P<0.000 1，說明模型2～5較可靠，具有現(xiàn)實意義。

表3 沙丁魚油摻偽鑒別模型Table 3 Identification model of sardine oil adulteration

2.5.2 沙丁魚油摻偽鑒別模型的可行性驗證對模型2～模型5進行絕對誤差分析，所得結(jié)果見表4。模型2到模型5的誤差范圍分別為0.88%～4.47%、-0.27%～3.94%、0.37%～2.43%、-0.79%～1.68%，4個模型的平均誤差分別為2.20%、1.38%、1.19%、0.83%，平均誤差均小于5%，說明此模型在鑒定沙丁魚油摻偽方面具有可行性，可以用于今后沙丁魚油摻偽的檢測。

表4 沙丁魚油摻偽模型預(yù)測值與實際值的誤差Table 4 The error between predicted value and actual value of sardine oil adulteration model /%

3 討論

針對魚油原料市場存在的摻偽現(xiàn)象，國內(nèi)外學(xué)者進行了大量研究，目前的摻偽鑒別方法主要是利用氣相色譜法對魚油脂肪酸的特征進行分析比較。如王瓊芬等［25］采用氣相色譜法測定鱈魚肝油脂肪酸組成，發(fā)現(xiàn)DHA/EPA和鯨蠟烯酸的含量在摻入一定量的魚油后會發(fā)生改變，由此初步建立了鱈魚肝油的摻偽識別模型，但由于樣本量不夠大，這種方法并不能保證所測脂肪酸比值的唯一性，所得摻偽模型存在準確性不高的問題；孫亞娟等［26］通過不同杏仁油的揮發(fā)性成分來建立杏仁油的指紋圖譜，并在此基礎(chǔ)上建立菜籽油-摻偽杏仁油的鑒別模型，雖然運用指紋圖譜建立摻偽模型能提高鑒別準確性，但其工作量較大、性價比低，不利于推廣應(yīng)用；應(yīng)美蓉等［27］分析山茶油及其摻偽油的特征脂肪酸后，將特征脂肪酸代入回歸方程，建立了山茶油的摻偽預(yù)測模型，研究證實利用特征脂肪酸和回歸方程建立摻偽模型，具有一定的合理性、可操作性。因此，本研究在此基礎(chǔ)上進行優(yōu)化，利用脂肪酸比值和化學(xué)計量學(xué)方法，分析魚油脂肪酸特征，再采用多元逐步線性回歸分析建立摻偽魚油模型。

近年來，主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）、偏最小二乘法（PLS）和線性判別（linear discrimination analysis，LDA）等化學(xué)計量學(xué)方法在食品領(lǐng)域逐漸興起，主要用于鑒別食品摻偽或產(chǎn)地溯源。PCA分析可以通過降維達到數(shù)據(jù)的可視化，幫助研究者進行數(shù)據(jù)分析和理解。對于PCA分析后無法再區(qū)分的樣品，可以聯(lián)用LDA分析來達到產(chǎn)地溯源的目的。如袁玉偉等［28］運用PCA-LDA分析方法鑒別不同產(chǎn)地的茶葉，通過PCA分析有效提取出數(shù)據(jù)中的信息，從而達到LDA分析的樣本標準，將PCA分析無法處理的樣本進行區(qū)分，建立產(chǎn)地鑒別模型，模型準確率最高達99%，可信度較高；胡桂仙等［29］根據(jù)穩(wěn)定同位素與多元素的特征來進行PCA-LDA分析，利用PCA分析對楊梅產(chǎn)地進行初步分類，在此基礎(chǔ)上，根據(jù)樣本類內(nèi)方差最小且類間方差最大的原則，采用LDA分析進一步細分建模，從而達到楊梅產(chǎn)地溯源的目的。雖然PCA-LDA分析能夠較好地實現(xiàn)產(chǎn)地鑒別的目的，但此方法更適合樣本量大、組成成分多的客體。PLS-DA分析屬于無監(jiān)督模式的分析，更能關(guān)注不同變量之間的差異，篩選出特征化合物。而PLS分析可以處理大樣本中的多重共線性問題，彌補PLS-DA分析的不足。Shi等［2］采用PCA分析對純植物油進行分類，找出脂肪酸組成接近山茶油的植物油并將其作為研究對象，利用PLS-DA分析區(qū)分不同品種的摻偽油，最后通過PLS分析預(yù)測山茶油中其他植物油的摻偽百分比，完成對山茶油的定量摻偽鑒別。可見利用PCA分析結(jié)合PLS-DA分析預(yù)測樣品摻偽油具有一定的可行性，故本研究選取PCA和PLS-DA分析兩種化學(xué)計量學(xué)方法，通過PCA分析初步判斷出可能的摻偽油，進一步利用PLS-DA分析得到摻偽油的特征脂肪酸，所得結(jié)果準確可靠。

多元逐步線性回歸分析在向前引入每一個新自變量之后，都要重新對已代入的自變量進行計算，以驗證其是否有繼續(xù)留在方程中的價值，以此為依據(jù)交替引入和剔除自變量，直到?jīng)]有新的變量可以引入或剔除為止［30］。黃麗等［31］通過多元逐步線性回歸分析建立了水牛乳摻水的定量模型，能快速、有效地監(jiān)控水牛乳摻水情況；鄒光宇等［32］在電子鼻檢測的基礎(chǔ)上，利用多元逐步線性回歸分析等方法建立茶葉樣品中茶多酚、咖啡堿含量的預(yù)測模型，達到了快速鑒別茶葉品質(zhì)的目的。不同海區(qū)的沙丁魚脂肪酸含量會受生長環(huán)境、溫度、食物鏈等影響而發(fā)生變化，但其本身的特征脂肪酸組成是穩(wěn)定的。因此，本研究采用多元逐步線性回歸分析建立沙丁魚油摻偽鑒別模型。選取R2大于0.9的模型進行驗證，結(jié)果表明各模型平均誤差均小于5%，說明其具有鑒別沙丁魚油摻偽的應(yīng)用價值。

4 結(jié)論

本研究運用化學(xué)計量學(xué)方法及多元逐步線性回歸分析建立了沙丁魚油摻偽鑒別模型。脂肪酸組成分析和PCA分析結(jié)果表明，鳀魚油與沙丁魚油脂肪酸組成最為相似，可作為沙丁魚的摻偽油；PLS-DA分析選取出的VIP值大于1的脂肪酸因子為EPA、DHA、棕櫚酸、棕櫚油酸、二十二碳烯酸和油酸，可以作為摻偽油的特征脂肪酸；本研究以特征脂肪酸含量為自變量，以摻偽百分含量為因變量，運用多元逐步線性回歸分析建立的摻偽鑒別模型可有效鑒別沙丁魚油摻偽。