番茄NAC轉錄因子SlNAP2的克隆、表達及功能分析

陳 娜 邵 勤

（宜春學院生命科學與資源環(huán)境學院，江西宜春 336000）

番茄（Solanum lycopersium）為茄科茄屬一年生或多年生草本植物，在我國南北各地普遍種植，具有重要的經(jīng)濟和營養(yǎng)價值［1］。番茄青枯病是由青枯菌引起的一種毀滅性的細菌性土傳病害，在我國南方地區(qū)普遍發(fā)生且危害嚴重，每年所造成的番茄減產(chǎn)可達50%～100%，已成為影響番茄品質和產(chǎn)量的重要病害之一［2-3］。因此，加大力度研究番茄對青枯菌脅迫的響應機制，可為抗青枯病番茄品種的培育提供理論基礎。

植物在其生長發(fā)育過程中為了降低各種生物與非生物逆境對其的影響，會進化出一套反應機制來抵御外界脅迫，即通過轉錄因子與外界信號和基因調控相整合的方式產(chǎn)生相應的蛋白和代謝產(chǎn)物來適應脅迫，從而提高植物的抗逆性［4］。NAC轉錄因子是近二十年來發(fā)現(xiàn)的植物特有的一類轉錄因子家族，其名稱由矮牽牛（Petunia hybrida）No Apical Meristem（NAM）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）轉 錄 激 活 因 子（ATAF1、ATAF2）和Cup-shaped cotyledon（CUC1/2）三個基因的首字母縮寫組成［5］。通常NAC蛋白在其N-端含有高度同源且能夠與DNA結合的NAC結構域，該結構域由約150個氨基酸殘基組成，包含5個保守的亞結構域（A、B、C、D、E），其C-端具有轉錄激活功能［6］。早期研究表明，NAC轉錄因子廣泛參與了植物的生長發(fā)育［7］、次生壁形成［8］、激素信號傳導［9］、植株衰老［10］、果實成熟［11］以及各種非生物［12］和生物［13］脅迫響應過程，并且隨著測序技術的迅速發(fā)展，越來越多的NAC轉錄因子被發(fā)掘與鑒定。如Li等［14］研究表明，葡萄（Vitis viniferaL.）VvNAC72通過抑制乙二醛酶ⅠVvGLYI-4的表達負向調控丙酮醛（methylglyoxal，MG）的解毒作用，并最終通過水楊酸介導的防御途徑調節(jié)MG-相關的活性氧（reactive oxygen species，ROS）穩(wěn)態(tài)，增強葡萄對霜霉病的抗性。目前有研究表明，番茄NAC轉錄因子也參與了植物抗病性的響應過程。Huang等［15］發(fā)現(xiàn)番茄SlNAC1在假單胞菌侵染過程中表達強烈上調。Liu等［16］報道番茄NAC基因SlSRN1是灰霉病菌（Botrytiscinerea）和丁香假單胞菌［Pseudomonas syringaepv.Tomato（PstDC3000）］防衛(wèi)響應的正調節(jié)因子。Miao等［17］研究表明，番茄泛素連接酶SINA3（SEVEN IN ABSENTIA3）能夠泛素化一個防衛(wèi)相關的NAC轉錄因子NAC1，促進其降解，并在防衛(wèi)信號轉導中發(fā)揮負向調控作用。黃瑩［18］在番茄中鑒定到4個能夠響應番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）侵染的NAC轉錄因子（SlNAC20、SlNAC24、SlNAC47和SlNAC61），并通過病毒誘導的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）試驗得出，SlNAC61在響應TYLCV侵染時起著正向調控作用。鄭晨飛［19］研究表明，番茄NAC轉錄因子NAC29在細菌性葉斑病抗性中具有重要的作用。Wang等［20］報道，過表達番茄NAC轉錄因子SlNAP1能夠顯著提高植株對葉斑病和青枯病的抗性。以上研究均表明，NAC轉錄因子在植物的抗病性調控中扮演著重要角色。但目前關于NAC轉錄因子調控青枯病抗性的研究較少，其調控番茄青枯病的分子機理仍不清楚。

前期，宜春學院蔬菜遺傳育種與分子生物學課題組通過轉錄組測序及表達譜分析，篩選到一個表達差異顯著的NAC轉錄因子SlNAP2。本研究以SlNAP2基因為研究對象，以番茄高抗青枯病和高感青枯病株系為材料，分析該轉錄因子的序列結構以及在不同外源激素和青枯菌脅迫下的表達模式，通過VIGS技術進一步對其參與番茄抗青枯病過程進行分析，旨在為后續(xù)深入研究NAC轉錄因子在番茄與青枯病互作中的作用機理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料為兩個番茄自交系株系，高抗青枯病材料Hm 2-2（R），高感青枯病材料BY 1-2（S），由浙南作物育種重點實驗室選育得到。

番茄青枯菌病原、VIGS載體pTRV1和pTRV2菌株均由江西省作物生長和發(fā)育調控重點實驗室保存，載體圖譜如圖1。

圖1 pTRV1和pTRV2載體圖譜Fig.1 The map of pTRV1 and pTRV2 vectors

pMD19-T克隆載體購自寶生物工程（大連）有限公司。大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)細胞DH5α和農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞GV3101均購自廣州圍谷潤儀器有限公司。

1.2 番茄SlNAP2基因的克隆

利用HiPure Total RNA Mini Kit RNA提取試劑盒（Magen，廣州）提取番茄高抗青枯病材料Hm 2-2的總RNA；以HiScript II 1st Stand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）逆轉錄試劑盒（Vazyme，南京）進行逆轉錄，獲得cDNA，以該cDNA為模板擴增SlNAP2基因序列。運用Primer Primer 5軟件設計引物（表1），引物由蘇州泓迅生物科技有限公司合成。PCR體系共20μL：10 mmol·L-1正反向引物各1μL，100～200 ng·μL-1模板cDNA 1 μL，2×Taq Master Mix（Vazyme，南京）10 μL，滅菌ddH2O 7 μL。PCR擴增程序：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)；72℃終延伸10 min。然后將PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，并用Genstar膠回收試劑盒（北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司）將PCR產(chǎn)物進行純化回收，最后將回收產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，用通用引物pMD19-F/R進行檢測，挑取陽性克隆菌落搖菌，將菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，根據(jù)測序結果確定基因的最終序列。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 番茄SlNAP2基因的生物信息學分析

將測序結果正確的SlNAP2基因序列通過NCBI在線軟件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）確定該基因的最大開放閱讀框（open reading frame，ORF），同時將該基因的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列；運用NCBI在線程序（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）對該基因編碼的蛋白結構域進行分析；運用Clustalw2在線工具（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）進行同源性比對；運用MEGA6軟件進行系統(tǒng)進化樹的構建；運用ProtParam在線程序（https：//web.expasy.org/protparam/）預測SlNAP2的蛋白理化性質；適用Expasy-ProtScale在線程序（https：//web.expasy.org/protscale/）預測SlNAP2的親疏水性；二級結構通過SOPMA在線程序（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預測；三級結構通過SWISS-MODEL在線程序（https：//swissmodel.expasy.org/）預測；使用TMHMM Server v.2.0在線程序（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對番茄SlNAP2基因編碼的蛋白跨膜結構進行預測。

1.4 番茄SlNAP2基因表達特性分析

SlNAP2組織特異性基因表達分析：在番茄長至五葉時，分別取番茄抗感青枯病材料Hm 2-2和BY 1-2的根、莖、葉片等不同組織進行液氮速凍，于-80℃條件下保存，用于后續(xù)總RNA提取。

SlNAP2在不同處理下的基因表達分析：待番茄抗感青枯病材料Hm 2-2和BY 1-2長至五葉時接種青枯菌病原（1×108CFU·mL-1），同時進行0.2 mmol·L-1水楊酸（salicylic acid，SA）和1.5 mmol·L-1茉 莉 酸 甲 酯（methyl jasmonate，MeJA）激素噴施處理，以清水噴施為對照。接種青枯菌和噴施激素處理后0、3、6、9 h取樣。所有樣品進行液氮速凍，于-80℃條件下保存，用于后續(xù)總RNA提取。

利用HiPure Total RNA Mini Kit RNA提取試劑盒（Magen，廣州）進行總RNA提??；以HiScript II 1st Stand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）逆轉錄試劑盒（Vazyme，南京）進行逆轉錄，獲得cDNA。以番茄Actin（Solyc03g078400）作為內(nèi)參基因，以StepOne Real-Time PCR儀（Applied Biosystems，Thermo Fisher，美國）進行qRT-PCR，檢測SlNAP2基因在不同組織及不同處理中的相對表達量。PCR反應體系20 μL：2×RealStar Green Fast Mixture（with ROX）10μL，上下游引物qSlNAP2F/R（10 mmol·L-1）各0.4μL，cDNA 0.5μL，無RNase水補至20 μL。PCR反應程序：95℃預變性2 min；95℃變性15 s，60℃退火/延伸20 s，40個循環(huán)；溶解曲線由儀器自動設置。每個樣品設置3個生物學重復。采用2-ΔΔCt法計算SlNAP2基因相對表達量［21］。

1.5 利用VIGS技術分析番茄SlNAP2基因功能

在已獲得的SlNAP2基因cDNA序列中，選取ORF非保守區(qū)的約120 bp片段，設計引物VSlNAP2-F/R進行PCR擴增，PCR反應體系和程序同1.2。將VIGS載體pTRV2質粒和PCR擴增的回收產(chǎn)物分別用EcoRI和SmaI進行酶切37℃2 h，酶切后將所得產(chǎn)物進行酶失活70℃15 min，然后用T4連接酶［寶生物工程（大連）有限公司］將載體和PCR回收產(chǎn)物進行連接。連接體系10 μL：pTRV2載體2 μL，PCR回收產(chǎn)物5 μL，350 U·μL-1T4 DNA Ligase 0.5 μL，10×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL，ddH2O 0.5 μL、16℃連接過夜，將連接產(chǎn)物采用熱激法轉化大腸桿菌細胞DH5α，構建TRV∷SlNAP2重組載體。將pTRV2空載體（TRV∷Empty）及重組載體（TRV∷SlNAP2）分別轉化農(nóng)桿菌細胞GV3101，將pTRV-1菌株分別與TRV∷SlNAP2及TRV∷Empty菌株1∶1（V/V）進行混合，注射至番茄抗病材料Hm2-2的葉片中，注射清水為對照CK。2 d后采用斷根灌根法接種青枯菌，5～7 d后觀察對照植株與沉默植株的表型，拍照和采樣，具體步驟參照陳娜［22］的方法。提取總RNA，通過qRT-PCR測定目的基因SlNAP2的表達量，反應體系和反應程序同1.4。

2 結果與分析

2.1 番茄SlNAP2基因的cDNA序列克隆

以番茄抗青枯病Hm2-2為試驗材料，提取總RNA，并反轉錄成cDNA，以cDNA為模板擴增SlNAP2序列，得到1 200 bp左右的擴增產(chǎn)物（圖2-A）。切膠回收，將純化后的片段連接至pMD19-T載體上（圖2-B），挑取陽性克隆搖菌，將菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結果得出SlNAP2的全長為1 227 bp，大小與圖2-A相符。

圖2 番茄SlNAP2基因Fig.2 Tomato SlNAP2 gene

2.2 番茄SlNAP2基因的序列分析

進一步分析番茄SlNAP2基因序列，其ORF為828 bp（圖3），起于175位，止于1 003位，共編碼了275個氨基酸。在SlNAP2的N-端存在1個典型的NAC轉錄因子的結構域（11～135 aa）（圖4）。

圖3 SlNAP2 cDNA及預測的開放閱讀框Fig.3 Sequences of SlNAP2 cDNA and predicted ORF

圖4 SlNAP2的保守區(qū)Fig.4 Conservative domain of SlNAP2

2.3 番茄SlNAP2基因編碼的蛋白同源性比對和系統(tǒng)進化分析

通過番茄SlNAP2編碼的蛋白與其他物種的同源蛋白序列比對可知，番茄SlNAP2編碼的蛋白與其他物種的蛋白相似度較高，并且SlNAP2與其他NAC轉錄因子一樣，N-端的氨基酸序列保守性很強，可進一步劃分為A、B、C、D、E 5個保守的亞結構域，C-端高度特異（圖5）。運用MEGA6.0軟件對番茄和其他10種植物的氨基酸序列進行聚類分析，并制作進化樹，結果表明，番茄SlNAP2基因編碼的蛋白與潘那利番茄SpNAP2基因編碼的蛋白同源性最高，其次為馬鈴薯，與毛果楊、橡膠樹等植物的蛋白同源性較低（圖6）。

圖5 番茄SlNAP2蛋白與其他物種同源蛋白多重序列比對Fig.5 Multiple alignment of homologous protein for the SlNAP2 in tomato and other species

圖6 SlNAP2同源蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of SlNAP2 homologous protein

2.4 番茄SlNAP2基因編碼的蛋白的生物信息學分析

番茄SlNAP2蛋白的理化性質用ProtParam在線程序進行分析，結果如表2所示。SlNAP2蛋白的相對分子質量為31 877.23 Da，理論等電點pI為8.56，總負電荷殘基數(shù)（Asp+Glu）為31，總正電荷殘基數(shù)（Arg+Lys）為34，其蛋白的分子式為C1423H2187N383O421S15，脂肪系數(shù)為62.69，不穩(wěn)定指數(shù)為24.52，是一種穩(wěn)定蛋白。平均親水指數(shù)為-0.730，同時運用Expasy-ProtScale在線程序分析得出SlNAP2表現(xiàn)出親水性（圖7）。綜上，該蛋白為堿性穩(wěn)定親水性蛋白。

表2 SlNAP2蛋白的基本理化性質Table 2 Basic physical and chemical parameters of SlNAP2 protein

圖7 SlNAP2蛋白親疏水性分析Fig.7 Hydrophilic analysis of SlNAP2 protein

2.5 番茄SlNAP2基因編碼蛋白的二級結構及跨膜性預測

通過SOPMA在線程序對SlNAP2蛋白進行二級結構預測，得出α-螺旋（alpha helix）比例為21.82%，延伸鏈結構（extended strand）的比例為13.09%，β-折疊（beta turn）的比例為3.27%，無規(guī)則卷曲（random coil）比例為61.82%（圖8-A）。以上結果表明該蛋白質的二級結構主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲所構成，延伸鏈結構和β-折疊所占的比例較低。

為進一步了解番茄SlNAP2蛋白的結構，利用SWISS-MODEL對番茄SlNAP2蛋白進行三維結構的建模分析，結果如圖8-B所示。SlNAP2蛋白的主要結構是螺旋和無規(guī)則卷曲，與二級結構預測的結果一致。

圖8 SlNAP2編碼的蛋白的二級結構和三級結構預測Fig.8 Secondary and tertiary structure prediction of protein encoded by SlNAP2 gene

使用TMHMM Server v.2.0在線程序對番茄SlNAP2蛋白的跨膜結構域進行分析，結果表明該蛋白不存在跨膜結構（圖9）。

圖9 SlNAP2基因編碼蛋白的跨膜結構分析Fig.9 Transmembrane structure analysis of protein encoded by SlNAP2 gene

2.6 SlNAP2基因表達分析

2.6.1SlNAP2基因的組織特異性分析對SlNAP2在番茄不同組織中的表達進行qRT-PCR檢測，結果顯示，在番茄抗病材料（R）和感病材料（S）中，SlNAP2均在莖中的表達量最高，葉中次之，根中最低，并且SlNAP2在抗病材料（R）中的表達量高于在感病材料（S）中的表達量（圖10-A）。表明SlNAP2在番茄中的表達具有組織特異性。

2.6.2SlNAP2基因對番茄青枯病脅迫及SA和MeJA處理的響應在番茄五葉時接種青枯菌，于不同時間點收集葉片樣品進行qRT-PCR檢測分析，結果如圖10-B顯示。接種青枯菌后，SlNAP2基因表達量不斷增加，表明青枯菌能夠誘導SlNAP2基因的表達，并且與番茄青枯菌侵染程度呈正相關。分別以0.2 mmol·L-1SA和1.5 mmol·L-1MeJA處理番茄植株，檢測SlNAP2對外源激素的響應，結果顯示，SA處理后，SlNAP2基因的表達量呈先降后升的趨勢（圖10-C）；MeJA處理后，SlNAP2基因的表達量呈下降的趨勢（圖10-D）。推測SlNAP2可能通過SA、MeJA通路參與番茄對青枯菌的脅迫響應。

圖10 番茄SlNAP2基因表達分析Fig.10 Expression analysis of tomato SlNAP2 gene

2.7 SlNAP2基因對番茄青枯病的抗性調控

分別提取接種CK、TRV∷Empty和TRV∷SlNAP2后7 d的番茄葉片RNA進行qRT-PCR檢測。結果顯示，與接種清水和空載體TRV∷Empty的植株相比，在TRV介導SlNAP2沉默的抗病植株中，SlNAP2基因表達量顯著低于CK和TRV∷Empty植株（圖11-A），表明TRV∷SlNAP2接種抗病植株后能有效沉默SlNAP2基因。對番茄植株的葉片進行表型觀察，接種清水和TRV∷Empty植株的葉片沒有明顯的變化，而接種TRV∷SlNAP2的植株葉片表現(xiàn)出明顯的萎蔫癥狀（圖11-B），表明沉默SlNAP2基因降低了番茄植株對青枯病的抗性。

圖11 SlNAP2基因對番茄青枯病的抗性調控分析Fig.11 Analysis of SlNAP2 gene regulation of tomato resistance to bacterial wilt

3 討論

NAC轉錄因子是植物特有的轉錄因子，也是植物中數(shù)量最大的轉錄因子家族之一。NAC轉錄因子不僅廣泛參與植物生長發(fā)育的調控過程，而且在逆境脅迫響應過程中扮演著重要的角色，因此研究NAC轉錄因子的結構與功能具有重要意義。近年來，隨著全球基因組測序工作的展開，很多物種的全基因組測序已經(jīng)完成。到目前為止，發(fā)現(xiàn)甘藍NAC基因家族包含188個基因［23］，蘋果為180個基因［24］，水稻為151個基因［25］，擬南芥為117個基因［26］，毛果楊為120個基因［27］，番茄為104個基因［28］，葡萄為74個基因［29］。本研究鑒定了番茄NAC轉錄因子SlNAP2，并對其進行了生物信息學分析。序列分析結果表明，SlNAP2蛋白和其他NAC蛋白一樣，其N-端含有NAM結構域，該結構域是NAC轉錄因子特有的，進一步可分為5個亞結構域，與大部分前人研究結果一致［30-31］。通過對SlNAP2編碼的蛋白分析結果可知，該蛋白為親水蛋白，與榮玉萍等［32］研究結果一致。蛋白質的二級結構預測可知，該蛋白以無規(guī)則卷曲為主，與譚秦亮等［33］對菠蘿NAC轉錄因子的研究結果基本一致。

前人研究證實植物抵抗生物脅迫的防衛(wèi)響應與外源激素信號分子有密切的聯(lián)系，如植物激素MeJA和SA是重要的植物抗性分子，在調節(jié)植物對生物脅迫的反應中扮演著重要角色［34］，而NAC轉錄因子作為調節(jié)植物應激響應的關鍵因子和植物病原菌防衛(wèi)響應的重要因子而得到廣泛關注。有研究證實，NAC轉錄因子能夠通過植物激素參與植株的生物脅迫響應過程，如水稻NAC轉錄因子ONAC122和ONAC131在稻瘟菌（Magnaporthe grisea）侵染后誘導表達，同時ONAC122和ONAC131能夠被外源激素SA和MeJA所誘導，沉默該基因提高了植株對稻瘟菌的易感性，研究結果表明ONAC122和ONAC131在水稻抗病反應中發(fā)揮重要作用［35］。Chen等［36］研究表明，茄子SmNAC通過抑制ICS1（SA合成基因）的表達來抑制SA的積累，從而降低植株對青枯病的抗性。馬鈴薯StNACb4能夠被青枯菌、SA和MeJA所誘導，沉默NbNACb4基因可增強煙草對青枯菌的敏感性，相反過表達StNACb4基因則增強了煙草對青枯菌的耐受性，表明StNACb4在馬鈴薯抗青枯病脅迫中發(fā)揮關鍵作用［37］。本研究通過探究青枯菌和SA、MeJA激素脅迫下SlNAP2在番茄抗感材料中的表達量發(fā)現(xiàn)，該基因對青枯菌、茉莉酸甲酯和水楊酸脅迫處理均有不同程度的響應，表明SlNAP2確實參與響應青枯菌生物脅迫和激素脅迫。其中SA誘導的SlNAP2的表達趨勢與青枯菌誘導的變化趨勢相似，推測SlNAP2可能通過SA信號轉導途徑參與番茄對青枯菌的脅迫響應。

前人研究證實NAC轉錄因子參與了番茄生物脅迫的響應過程，如在煙草中過表達番茄SlNAC35能夠增強植株對細菌性病原菌的抗性［38］；番茄轉錄因子NAC29在細菌性葉斑病抗性中具有重要作用［19］；番茄NAC轉錄因子NAC089是內(nèi)質網(wǎng)應激介導的免疫（endoplasmic reticulum stress-mediated immunity，ERSI）和植物對病原體抗性所必需的［39］。本研究發(fā)現(xiàn)，在番茄中利用VIGS技術沉默SlNAP2之后接種青枯菌病原，番茄抗病材料的葉片表現(xiàn)出萎蔫癥狀，說明SlNAP2在番茄對青枯病的抗性中發(fā)揮著正調控作用。本研究結果證實了NAC轉錄因子在番茄生物脅迫響應過程中的作用，但其調控番茄青枯病的分子機理仍未清楚，今后可進一步進行SlNAP2與信號轉導途徑中相關基因的互作分析，并可開展SlNAP2與青枯菌病原無毒或致病基因相關蛋白互作研究，從而明確番茄SlNAP2轉錄因子如何調控青枯病，對SlNAP2的調控機理進行深入的分析。這對培育持久、廣譜抗性的番茄品種具有重要的理論和實踐意義。

4 結論

本研究從番茄中克隆得到一個NAC轉錄因子SlNAP2，全長1 227 bp，編碼275個氨基酸，為堿性穩(wěn)定親水性蛋白，且與潘那利番茄SpNAP2親緣關系最近。qRT-PCR分析結果表明，SlNAP2基因的表達具有組織特異性，同時番茄SlNAP2基因可受到青枯菌、水楊酸和茉莉酸甲酯的誘導。進一步利用VIGS技術沉默SlNAP2后接種青枯菌，番茄植株對青枯病的抗性降低，表明SlNAP2在番茄抗青枯病過程中起正調控作用。