微生物來源的果膠相關(guān)裂解酶的研究進(jìn)展

鄭 玲，李 謙，徐寅嘯，寧利敏，朱本偉，姚 忠

(1. 南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800；2. 南京中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)院·整合醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

果膠(pectin)是一種帶負(fù)電荷的酸性雜多糖，主要存在于高等植物細(xì)胞壁中[1-2]，當(dāng)它與植物組織中的纖維素、木質(zhì)素等相互交聯(lián)時(shí)，可賦予細(xì)胞壁剛性，成為阻礙病原微生物入侵的天然屏障。因此，對于植物病原體來說，自然界中存在的大量細(xì)胞壁降解酶(包括果膠酶、纖維素酶和蛋白酶等)使其能夠突破植物細(xì)胞壁屏障進(jìn)入宿主細(xì)胞，其中，果膠酶(pectinase)是能夠催化果膠物質(zhì)分解的一類酶的總稱[3-4]。目前，果膠酶已經(jīng)成為最重要的生物催化劑之一，廣泛應(yīng)用于果汁提取、動(dòng)物飼料生產(chǎn)、棉纖維的紡織加工、植物韌皮纖維的脫膠和廢水處理等領(lǐng)域[5-6]。

在果膠酶中，果膠裂解酶(pectin lyase，EC 4.2.2.10)和果膠酸裂解酶(pectate lyase，EC 4.2.2.2)都能通過β-消除機(jī)制裂解果膠或果膠酸分子骨架的α-1,4-糖苷鍵，從而生成不飽和的果膠寡糖，并且不會(huì)產(chǎn)生高毒性的甲醇，這引起了人們極大的興趣[7-8]。果膠裂解酶和果膠酸裂解酶又分別稱多聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(PMGL)和多聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)。根據(jù)CAZy數(shù)據(jù)庫，它們分屬于不同的多糖裂解酶(PLs)家族，其中已經(jīng)得到表征的果膠酸裂解酶(PGL)主要來源于PL1、PL2、PL3、PL9和PL10家族，而已知的果膠裂解酶(PMGL)目前僅集中在PL1家族。從結(jié)構(gòu)上來看，來自PL1、PL3和PL9家族的裂解酶采用平行的β-螺旋結(jié)構(gòu)，而來自PL2的PGLs采用(α/α)7桶狀結(jié)構(gòu)，來自PL10家族的PGLs則呈現(xiàn)(α/α)3桶狀結(jié)構(gòu)。

迄今為止，已經(jīng)有大量果膠酶相關(guān)的研究得以發(fā)表[5,9-12]，本文將從這些裂解酶的來源、分類、序列分析、作用模式、三維結(jié)構(gòu)及催化機(jī)制等方面進(jìn)行綜述，以利于加深人們對果膠相關(guān)裂解酶的系統(tǒng)認(rèn)知。此外，由于果膠是這些裂解酶的主要底物，因此簡要探討其結(jié)構(gòu)和組成等特征。

1 果膠結(jié)構(gòu)和特性

美國化學(xué)協(xié)會(huì)(ACS)將果膠類物質(zhì)分為原果膠、果膠酸、果膠酯酸和果膠4種主要類型[7]，其中，果膠是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子多糖，廣泛存在于柑橘、檸檬、蘋果和南瓜等高等植物的細(xì)胞壁中[2,13]。來源不同的果膠酯化度也不同，以酯化度(degree of esterification，DE)50%為界限，可將果膠分為高甲氧基果膠(high methoxyl pectin，DE>50%)和低甲氧基果膠(low methoxyl pectin，DE<50%)[14]。工業(yè)上，柑橘、蘋果和柚果等的果皮和廢渣是果汁生產(chǎn)的副產(chǎn)物，也是生產(chǎn)果膠的重要原材料之一。

果膠是一種酸性雜多糖，通過α-1,4糖苷鍵連接D-半乳糖醛酸形成多糖主鏈，側(cè)鏈則由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和木糖等單元構(gòu)成[11]，其中，聚半乳糖醛酸的羧基部分被甲基酯化，未甲酯化的羧基以游離形式存在或被K+、Na+和NH4+部分或完全中和。一般來說，天然的果膠分子并非呈線形，而是具有多分支的結(jié)構(gòu)，可大致分為均勻區(qū)(smooth region)和毛發(fā)區(qū)(hairy region)[15]。它主要由3種結(jié)構(gòu)特征良好的多糖組分構(gòu)成：同型半乳糖醛酸聚糖(homogalacturonan，HGA)、鼠李半乳糖醛酸聚糖I(rhamnogalacturonan Ⅰ，RG Ⅰ)、鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅱ(rhamnogalacturonan Ⅱ，RG Ⅱ)以及小部分的木糖半乳糖醛酸聚糖(xylogalacturonan，XGA)[3,16](圖1)。

圖1 果膠的結(jié)構(gòu)[3,16]Fig.1 The structure of pectin[3,16]

商業(yè)果膠一般為白色至淡黃色粉末，而且不同來源的果膠成分存在較大差異，但其性質(zhì)與甲酯化程度密切相關(guān)。果膠分子可溶于水形成黏稠的膠體溶液，但不溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑。它在水中的溶解性與果膠分子的聚合度和酯化度有關(guān)。在酸、堿或果膠酶等存在下，果膠分子可發(fā)生酯水解或者糖苷鍵斷裂，生成半乳糖醛酸或醇等物質(zhì)。在適當(dāng)條件下，果膠能夠與糖、酸或者Ca2+形成凝膠[1]：在高糖濃度和低pH條件下，高甲氧基果膠可形成凝膠；而低甲氧基果膠在Ca2+存在的情況下，即使沒有糖也可形成凝膠[13]。因此，果膠形成凝膠的能力在食品和制藥工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用，如作為增稠劑等[17]。具體來說，絕大部分的果膠被用于食品行業(yè)，如凝膠軟糖、果凍、乳制品和蜜餞等的生產(chǎn)，或是在食品加工時(shí)作為穩(wěn)定劑、乳化劑等。除此之外，果膠也被用于醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)，如生產(chǎn)防治糖尿病、肥胖癥等的保健品。

2 果膠酶分類和來源

果膠酶是一類能夠催化果膠物質(zhì)轉(zhuǎn)化的酶的總稱，也是細(xì)菌、真菌和植物中分布最廣泛的酶之一。復(fù)雜果膠的完全降解需要一組具有明顯底物特異性的果膠酶的協(xié)同作用[5,18]。由于底物結(jié)構(gòu)的多樣性，果膠酶存在不同的分類標(biāo)準(zhǔn)，可將果膠酶大致分為果膠酯酶(pectin esterase)、果膠水解酶(pectin hydrolases)、原果膠酶(protopectinase)、果膠裂解酶和果膠酸裂解酶(表1)[3,11]。按照其作用的最適pH，可分為堿性果膠酶和酸性果膠酶，其中，果膠裂解酶(PMGL)和果膠酸裂解酶(PGL)都屬于多糖裂解酶(polysaccharide lyases，PLs)，它們能通過β-消除機(jī)制直接裂解果膠分子骨架的α-1，4糖苷鍵，而不產(chǎn)生高毒性的甲醇，這引起了人們的極大興趣[3]。迄今為止，所研究的降解果膠分子的裂解酶大多數(shù)來自細(xì)菌、真菌等微生物(表2)，在植物和動(dòng)物中也有少量報(bào)道。如，Yadav等[4]對來自黃曲霉的堿性PMGL進(jìn)行了純化和表征，Dong等[10]從尖孢鐮刀菌中分離、表達(dá)并比較了2種PGLs特性，Jenkins等[19]探究了來自菊歐氏桿菌的PGL(Pel9A)的晶體結(jié)構(gòu)等?？傊?，來源各異的果膠酶往往扮演著不同的角色：致病菌來源的PGLs可以促進(jìn)病原微生物的入侵，而大多數(shù)來自絲狀真菌的PGLs與植物腐爛相關(guān)；植物來源的PGLs往往參與了植物生長發(fā)育過程中的細(xì)胞壁降解和修飾，動(dòng)物來源的PGLs則具有與植物病原細(xì)菌和真菌相似的降解植物細(xì)胞壁的作用[2]。此外，由于微生物所處的環(huán)境不同，PGLs和PMGLs呈現(xiàn)多樣化的特征，特別是最適pH與溫度，具體參見生化特性部分。

表1 果膠酶的分類[3,11]

表2 果膠裂解酶和果膠酸裂解酶的部分來源

PMGL和PGL均屬于PLs家族，但具有不同的底物特異性。PMGL可以直接降解高甲氧基果膠，無需依靠酯酶去除甲酯基團(tuán)[3,35]。大多數(shù)PGL可降解聚半乳糖醛酸以及低甲氧基果膠，但是對高甲氧基果膠活性較差[36]。值得注意的是，與聚半乳糖醛酸酶和果膠酯酶催化的反應(yīng)不同，PMGL和PGL在降解果膠的同時(shí)均不產(chǎn)生高毒性的甲醇，還能保護(hù)對果汁特定香味負(fù)責(zé)的酯基團(tuán)，使其不被破壞。因此，它們被廣泛應(yīng)用于果汁提取、咖啡和茶葉發(fā)酵、植物油提取、紅酒的色度和穩(wěn)定性提高、動(dòng)物飼料生產(chǎn)、棉纖維的紡織加工和生物處理、植物韌皮纖維的脫膠和廢水處理等領(lǐng)域。

3 果膠相關(guān)裂解酶結(jié)構(gòu)及特性

3.1 序列分析

目前，蛋白質(zhì)序列、結(jié)構(gòu)和功能間的對應(yīng)關(guān)系尚不明確：序列一致性高的蛋白，其結(jié)構(gòu)與功能高度相似；然而部分序列一致性較低的蛋白卻也具有類似的結(jié)構(gòu)和功能。值得注意的是：在保持蛋白質(zhì)功能方面具有重要作用的殘基往往是高度保守的，并且與結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)進(jìn)行多重序列比對分析，有助于確定具有重要功能的氨基酸殘基和進(jìn)化軌跡[37]。因此，本文對來源于相同PL家族的一些序列進(jìn)行了比對分析(圖2～6)，并構(gòu)建了一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹來分析5個(gè)不同PLs家族PMGL和PGL的進(jìn)化歷程(圖7)。由此發(fā)現(xiàn)，同一PL亞家族，總的序列同源性一般大于50%，但是亞家族之間的序列同源性要低得多。有的蛋白雖然序列同源性不高，但具有相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如，來源于Erwiniachrysanfhem的PelC[38]，來源于Erwiniachrysanfhemi的PelE[23]以及來源于Bacillussubtilis的Pel[39]都具有類似的β-螺旋結(jié)構(gòu)，此外，通過序列比對還發(fā)現(xiàn)：不同PLs家族都存在一些保守的氨基酸殘基，這些殘基通過疏水作用和靜電效應(yīng)參與了底物結(jié)合過程。具體來看，PGLs的底物結(jié)合口袋富含帶正電的氨基酸，從而有利于與帶負(fù)電荷的果膠酸底物相結(jié)合；而PMGLs的結(jié)合裂隙以芳香族殘基為主，往往需要保守位點(diǎn)處的精氨酸去輔助結(jié)合底物[32]。

圖2 來自PL1家族的果膠酸裂解酶的序列分析Fig.2 Multiple sequences alignment of pectate lyase from PL1 family

來自PL1、3和9家族的PGLs和PMGLs均具有β-螺旋結(jié)構(gòu)，其中，有大量PL1家族的PGLs被報(bào)道[26-27,40]。將PL1家族中得到表征的PGLs進(jìn)行多序列比對，結(jié)果表明在PL1家族中幾個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)是高度保守的。根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)得到解析的CAB12585.1(PDB:1BN8)[39]來看，Asp244和Asp248與初級(jí)鈣的結(jié)合密切相關(guān)，而Lys268和Arg305與底物結(jié)合相關(guān)(圖2)。PL3家族結(jié)構(gòu)解析的PGLs間序列同源性較低(20%～65%)。將結(jié)構(gòu)得到解析的BAA87892.1(PDB:1EE6)[41]與該家族的酶進(jìn)行多序列比對可知，與Ca2+結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)的3個(gè)殘基：Asp90、Glu110和Asp84以及與催化相關(guān)的殘基Lys134、Lys156和Arg159在PL3家族中都是高度保守的(圖3)。PL9家族只有Pel9A(PDB:1RU4)的結(jié)構(gòu)被解析，它的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)為Asp209、Asp233和Asp237，催化位點(diǎn)為Lys273[19]，這些殘基在PL9家族中同樣是高度保守的(圖4)。

圖3 來自PL3家族的果膠酸裂解酶的序列分析Fig.3 Multiple sequences alignment of pectate lyase from PL3 family

圖4 來自PL9家族的果膠酸裂解酶的序列分析Fig.4 Multiple sequences alignment of pectate lyase from PL9 family

迄今為止，PL2家族僅3種PGLs的結(jié)構(gòu)得到了解析，均為(α/α)7桶狀結(jié)構(gòu)。此外，還有6種PGLs和1種PMGL的生化特性得到表征。序列比對結(jié)果顯示，PL2家族的PGLs具有高度的序列同源性(78%～99%)，如，來源于Yersiniaenterocolitica的YePL2A(PDB:2V8I)的催化殘基(Arg194和Arg295)、底物結(jié)合位點(diǎn)(Glu153、Lys155和Glu538)和金屬結(jié)合位點(diǎn)(His132、His195和Glu153)[28]，在PL2家族中高度保守(圖5)。此外，雖然PL10家族PGLs的序列同源性較低(25%～37%)，但它們都為(α/α)3桶狀結(jié)構(gòu)，其中，Pel10A的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)Asp451、催化堿Arg524和維持催化中心基團(tuán)結(jié)構(gòu)完整性的Glu535，在PL10家族中都是保守的，它們很有可能起著類似于Pel10A中的作用(圖6)。

圖5 來自PL2家族的果膠酸裂解酶的序列分析Fig.5 Multiple sequences alignment of pectate lyase from PL2 family

3.2 生化特性及作用模式

目前所表征的PMGLs和PGLs主要來源于細(xì)菌和真菌等微生物[2]，本文對來源于不同PLs家族的裂解酶進(jìn)行了比較(表3)，如，來自Yersiniaenterocolitica的YePL2A優(yōu)先作用于聚半乳糖醛酸，而YePL2B優(yōu)先作用于半乳糖醛酸三糖[28]。并且YePL2A和YePL2B都顯示出PGLs常見的底物抑制特性：在達(dá)到最佳濃度后，隨著底物濃度增加，產(chǎn)物卻減少。

表3 不同PLs家族果膠酸裂解酶的生化特性

PGLs和PMGLs在不同條件(pH、溫度等)下，其酶活有著明顯的差異。目前，酸性和中性果膠酶主要為聚半乳糖醛酸酶和PMGLs，也有少部分PGLs的最適pH呈酸性；大多數(shù)堿性PGLs的最適pH為8.0～11.5[2]，如，PGL(recPEL S6)在最適pH 10.0和60 ℃時(shí)顯示出最高酶活[42]。此外，由于產(chǎn)生果膠酶的天然微生物來源不同，PGLs和PMGLs可在不同溫度范圍內(nèi)發(fā)揮作用，從而大致分為嗜熱酶(>60或70 ℃)、中溫酶(40～70 ℃)和冷適應(yīng)酶(<40 ℃)。

嚴(yán)格保守的殘基以紅色背景突出顯示，保守取代的殘基位于框內(nèi)。結(jié)構(gòu)得到解析的果膠酸裂解酶：CAB12585.1(PDB:1BN8)、CAL14085.1(PDB:2V8I)、BAA87892.1(PDB:1EE6)、ADM99100.1(PDB:1RU4)和ACE85516.1(PDB:1GXM)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成(α-螺旋、β-折疊等)分別顯示在比對序列的上方。序列比對圖使用ESPript 3.0繪制，圖中的裂解酶統(tǒng)一以GenBank登錄號(hào)表示。預(yù)測高度保守的氨基酸：與金屬結(jié)合相關(guān)的用★對應(yīng)標(biāo)出，涉及底物結(jié)合的用▲對應(yīng)標(biāo)出，與催化殘基相關(guān)的用●對應(yīng)標(biāo)出圖6 來自PL10家族的果膠酸裂解酶的序列分析Fig.6 Multiple sequences alignment of pectate lyase from PL10 family

圖7 不同PLs家族的果膠裂解酶和果膠酸裂解酶的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic trees of PGLs and PMGLs from different PLs families

不同金屬離子和化學(xué)試劑對PGLs和PMGLs具有顯著不同的影響。如，大多數(shù)PGLs是依賴Ca2+的金屬酶，需要在底物結(jié)合袋內(nèi)形成金屬離子結(jié)合位點(diǎn)，其最佳Ca2+濃度范圍為0.5～1.0 mmol/L[2]。然而，有研究報(bào)道，部分PGL的最佳Ca2+濃度<0.5 mmol/L或>1.0 mmol/L。如，來自Aspergillusluchuensisvar.saitoi的PGL的最佳Ca2+濃度為0.3 mmol/L[5]。在2.5 mmol/L Ca2+的存在下，PpPel10a的相對酶活得到了顯著提高[43]。此外，5 mmol/L的Mn2+、Mg2+和Cu2+對AsPelA的酶活有一定抑制作用；在0.5%表面活性劑(SDS、Triton X-100和Tween-20)存在下，AsPelA卻能保留其原始活性90%以上[5]。然而，這些金屬離子對ApPel產(chǎn)生顯著不同的影響[36]：1 mmol/L或10 g/L的Mn2+、Cu2+、Mg2+和Tween 20可以激活A(yù)pPel1活性；而一價(jià)的Ag+和K+幾乎不影響ApPel1活性。此外，143 mmol/L的β-巰基乙醇，能顯著抑制ApPel1酶活。還有研究通過EDTA抑制活性后加入過渡金屬，發(fā)現(xiàn)來自Yersiniaenterocolitica的YePL2B在Mn2+存在下有最高的酶活回收[28]。

多糖裂解酶的作用模式可以通過研究其產(chǎn)物分布來確定，如，外切作用的PGLs通常僅產(chǎn)生單體或二聚體，而內(nèi)切作用的PGLs產(chǎn)生較大的低聚物。目前得到表征的PMGL僅通過內(nèi)切作用來降解底物，而PGL則可以通過內(nèi)切或者外切模式起作用[42]。通過不同作用模式，PGLs和PMGLs可以利用果膠底物生產(chǎn)出聚合度不同的單糖和寡糖，這有利于果膠分子在更多領(lǐng)域得到充分的應(yīng)用，因此有必要對其作用模式進(jìn)行更深入的研究。

已經(jīng)有不少研究對PGLs和PMGLs的作用模式以及產(chǎn)物分布進(jìn)行了分析。Abbott等[28]對來自Yersiniaenterocolitica的PGL進(jìn)行了研究后發(fā)現(xiàn)：YePL2A可以通過內(nèi)切作用模式產(chǎn)生聚合度為2～5的寡聚半乳糖醛酸；而YePL2B通過外切作用模式將聚半乳糖醛酸降解為不飽和半乳糖醛酸二糖。為了確定PGL(PelB)對聚半乳糖醛酸的作用方式，Wang等[44]通過HPLC-TOF-MS對終產(chǎn)物進(jìn)行了分析后發(fā)現(xiàn)：在351、527、703和879m/z處顯示出主要的強(qiáng)峰，表明其最終產(chǎn)物主要為不飽和半乳糖醛酸(GalpA)的二聚體、三聚體和四聚體，并沒有產(chǎn)生任何單體，為典型的內(nèi)切作用模式。

3.3 蛋白結(jié)構(gòu)與功能

果膠酶的結(jié)構(gòu)和功能有著十分密切的聯(lián)系。根據(jù)CAZy數(shù)據(jù)庫，本文總結(jié)了不同PLs家族果膠酶的種類及其主要結(jié)構(gòu)(表4)。目前，已經(jīng)有大量果膠酶的生化特性得以表征，但是晶體結(jié)構(gòu)得到解析的PGLs和PMGLs仍為少數(shù)。值得注意的是，來自PL1、PL3和PL9家族的PGLs和PMGLs均為平行的β-螺旋結(jié)構(gòu)，來自PL2家族的PGLs呈較罕見的(α/α)7桶狀結(jié)構(gòu)，而來自PL10家族的PGLs則為(α/α)3桶狀結(jié)構(gòu)(表4)。本文將對這3種類型的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行簡要的分析，以便從結(jié)構(gòu)水平理解其對果膠酶功能產(chǎn)生的不同影響(圖8)。

表4 不同PLs家族果膠裂解酶和果膠酸裂解酶的結(jié)構(gòu)

3.3.1β-螺旋

在PL1、PL3和PL9家族中，PGLs和PMGLs均采用相似的β-螺旋結(jié)構(gòu)。具體來看，β-螺旋主要由3個(gè)平行的β折疊片(PB1、PB2和PB3)組成，這些β折疊片由3個(gè)轉(zhuǎn)角(Turn1、Turn2和Turn3)依次連接而成。一般連接PB1和PB2的T1轉(zhuǎn)角較短，而T2和T3轉(zhuǎn)角是從β折疊片中延伸出來的較長環(huán)，它們分別連接PB2和PB3，PB3和PB1[51]。值得注意的是，T3轉(zhuǎn)角通常是較長且構(gòu)象復(fù)雜的環(huán)，構(gòu)成了主環(huán)區(qū)域；它們從平行的β-螺旋核心突出，與PB1堆積到一起，形成了底物結(jié)合裂隙[32,52]。因此，各個(gè)PGLs之間的主要區(qū)別在于從平行的β-螺旋核心突出并覆蓋的環(huán)的數(shù)量、大小和構(gòu)象不同[40]。

Bsp165PelA是一種來自Bacillussp. N16-5的新型PGL，它具有與PL1家族其他PGLs相似的特征：平行的β-螺旋結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)殘基和底物結(jié)合裂隙。它在三級(jí)結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為平行的β-螺旋上有7個(gè)完整的環(huán)，與其他PGLs最明顯的區(qū)別在于從核心結(jié)構(gòu)向外延伸的T3長環(huán)(圖8(a))。Bsp165PelA的T3轉(zhuǎn)角和T1轉(zhuǎn)角在結(jié)構(gòu)幾乎沒有相似之處。平行的β折疊片PB1一共有10條，PB2和PB3分別有9條和7條[40]。

此外，β-螺旋通常以兩端的環(huán)開始和結(jié)束，稱為β-螺旋帽。這個(gè)帽子是兩親性的：它的一邊有時(shí)包含帶電殘基，暴露在溶劑中；而另一邊則覆蓋β-螺旋的疏水核心。Bryan等[53]研究認(rèn)為，帽子不僅可以保護(hù)β-螺旋的核心免受溶劑侵蝕，還可以防止β-螺旋的進(jìn)一步聚集。如，來自Erwiniachrysanfhemi的PelE[23]也可以折疊成中心平行的β-螺旋結(jié)構(gòu)(圖8(b))；它在N端區(qū)域形成了一個(gè)由26個(gè)氨基酸組成的長環(huán)，并沿著平行β-螺旋的一側(cè)折疊，以保護(hù)蛋白質(zhì)內(nèi)部不受溶劑的侵蝕；而在β-螺旋的C端，多肽折疊成了3個(gè)不同的環(huán)，其中一個(gè)環(huán)主要負(fù)責(zé)覆蓋并保護(hù)C端免受溶劑的侵蝕。類似地，還有PL1家族來自Acidovoraxcitrulli的PGL(AcPel)，它由一個(gè)典型的右手β-螺旋和一個(gè)Ca2+組成(圖8(c))，其中β-螺旋被一個(gè)帽子結(jié)構(gòu)所覆蓋，其T2轉(zhuǎn)角較短，保守且有序；T3轉(zhuǎn)角比T1或T2轉(zhuǎn)角長，可以形成帽結(jié)構(gòu)域并參與構(gòu)成活性位點(diǎn)。初級(jí)Ca2+位于PB1鏈和T3轉(zhuǎn)角之間，與底物結(jié)合位點(diǎn)密切相關(guān)，而位于β-螺旋內(nèi)側(cè)的酸性殘基的側(cè)鏈相同，指向內(nèi)部可以起到穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用。

(a)～ (c)來自PL1家族的果膠酸裂解酶Bsp165PelA、PelE和AcPel，均呈現(xiàn)典型的β-螺旋結(jié)構(gòu)；(d)和(e)來自PL10家族的果膠酸裂解酶PelA和Pel10A，呈(α/α)3桶狀結(jié)構(gòu)；(f)來自Yersinia enterocolitica的PL 2家族果膠酸裂解酶YePL2A，呈現(xiàn)罕見的(α/α)7桶狀結(jié)構(gòu)；每個(gè)結(jié)構(gòu)圖下方標(biāo)記為對應(yīng)的PDB號(hào)圖8 不同PLs家族果膠酸裂解酶的三維結(jié)構(gòu)圖Fig.8 Three-dimensional structures of pectate lyase from different PL families

3.3.2 (α/α)3桶狀

與PL1、3和9家族中普遍的β-螺旋結(jié)構(gòu)不同，來自PL10家族的PelA[31]和Pel10A具有類似的(α/α)3桶狀結(jié)構(gòu)(圖8(d)和(e))[54]，并且它們都表現(xiàn)為2個(gè)域，底物結(jié)合和催化殘基被認(rèn)為存在于2個(gè)結(jié)構(gòu)域之間開放的中心凹槽處。然而，關(guān)于PGLs和PMGLs呈現(xiàn)(α/α)3桶狀的報(bào)道很少，目前僅PL10家族的上述2種裂解酶的結(jié)構(gòu)得到解析，為其結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步探究提供了重要的信息。

PelA表現(xiàn)為一種環(huán)狀折疊狀態(tài)，其結(jié)構(gòu)以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主，伴隨著不規(guī)則的卷曲和短的β鏈。PelA的384個(gè)氨基酸殘基，分布在11條反向平行的β鏈，11個(gè)螺旋和6個(gè)310-螺旋中，其余殘基位于環(huán)狀和卷曲結(jié)構(gòu)中[31]。PelA的結(jié)構(gòu)顯示為2個(gè)“結(jié)構(gòu)域”，它們之間的接口是一個(gè)寬闊的開放的中央凹槽。與其他內(nèi)切作用的多糖裂解酶(如木聚糖酶)所報(bào)道的一致，該凹槽被認(rèn)為承載了底物結(jié)合位點(diǎn)和催化活性位點(diǎn)。具體來看，PelA的N端“結(jié)構(gòu)域”以短β鏈和無規(guī)卷曲開始，然后是一些螺旋結(jié)構(gòu)，β轉(zhuǎn)角和結(jié)構(gòu)中最大的α-螺旋，其中，前2個(gè)螺旋穿過主要由α-螺旋組成的α環(huán)的最后一個(gè)螺旋，顯示出緊密的(α/α)3桶狀。C末端的“結(jié)構(gòu)域”主要由短的β鏈，不規(guī)則的環(huán)狀和最末端的α-螺旋組成，該結(jié)構(gòu)的這一部分比N端結(jié)構(gòu)域更靈活。

3.3.3 (α/α)7桶狀

目前，不同PLs家族中關(guān)于(α/α)7桶狀結(jié)構(gòu)的報(bào)道相對較少，其中，來自Yersiniaenterocolitica的PL2家族的PGL(YePL2A)呈現(xiàn)(α/α)7桶狀結(jié)構(gòu)(圖8(f))，這在原核蛋白中屬于首次發(fā)現(xiàn)[28]。具體來看，(α/α)7桶狀是指將2個(gè)反平行的α-螺旋堆積成7個(gè)亞結(jié)構(gòu)，其中每個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)的長度為10～20個(gè)氨基酸，這些亞結(jié)構(gòu)以逆時(shí)針方向排列構(gòu)成了桶狀結(jié)構(gòu)的核心。

值得注意的是，在YePL2A中這個(gè)α桶狀結(jié)構(gòu)起著類似結(jié)構(gòu)平臺(tái)的作用，在這個(gè)平臺(tái)上“嫁接”了2個(gè)可以利用催化機(jī)制的“大臂”。這些臂主要由β鏈組成，不僅限定了活性位點(diǎn)通道的壁，還使酶具有整體的“虎鉗”形狀(“vice-like” shape)，并且兩條臂之間的距離跨度為～1.5 nm，長度為～5.0 nm，足以容納寡半乳糖醛酸底物[28]。此外，酶壁區(qū)具有充分的靈活性：一般情況下，通道兩端都是開放的，而當(dāng)酶與三半乳糖醛酸底物結(jié)合后，這些臂可圍繞底物閉合，以充分定位催化中心并進(jìn)行β-消除反應(yīng)。

3.4 PGLs和PMGLs的催化機(jī)制

PGLs和PMGLs都能通過反式β-消除機(jī)制使果膠分子中D-半乳糖醛酸的α-1，4糖苷鍵斷裂。具體來說，這些裂解酶通過攻擊底物的糖苷鍵，在鄰近羧基或酯化的羧基一邊發(fā)生β-消除，即在C4位置上斷開糖苷鍵。同時(shí)，在C5位置消去一個(gè)H原子，在新形成的低聚半乳糖醛酸鹽的非還原端生成不飽和C4和C5鍵[26,55](圖9(a))。

從酸堿質(zhì)子理論的角度來看：位于活性位點(diǎn)的Ca2+往往起到酸化底物的作用，催化堿從被酸化底物的C5原子中提取質(zhì)子，從而生成烯醇中間體，催化酸則提供質(zhì)子以協(xié)同作用。在最后一步，離去基團(tuán)的消除則是通過另一個(gè)酸性基團(tuán)使O4原子質(zhì)子化來實(shí)現(xiàn)的，烯醇中間體則由Ca2+來穩(wěn)定[55]。根據(jù)輔助β-消除的金屬離子不同，可以將催化機(jī)制分為Ca2+輔助(圖9(b))和過渡金屬離子輔助型。此外，根據(jù)催化堿的不同，可分為Lys型和Arg型β-消除催化機(jī)制(圖9(c))。

3.4.1 金屬離子輔助β-消除反應(yīng)

3.4.1.1 Ca2+輔助的β-消除機(jī)制

大多數(shù)PGLs的催化活性都需要Ca2+，圖9(b)為常見的Ca2+輔助β-消除機(jī)制。PGLs中存在兩類Ca2+：初級(jí)Ca2+，在沒有底物的情況下，可以與酶分子結(jié)合；附加Ca2+，是酶和低聚半乳糖醛酸復(fù)合物之間的橋梁[40,56-57]。在酶-Ca2+-低聚半乳糖醛酸的復(fù)合物中，靜電相互作用占主導(dǎo)，低聚半乳糖醛酸鹽中帶負(fù)電荷的部分主要與Ca2+或蛋白質(zhì)中帶正電荷的基團(tuán)相互作用。

圖9 果膠酸裂解酶中的β-消除催化機(jī)制Fig.9 The catalytic mechanism of β-elimination in pectate lyase

PGLs降解聚半乳糖醛酸的催化機(jī)制是典型的β-消除過程，其基本機(jī)制是通過催化堿從一個(gè)半乳糖醛酸的C5部分提取質(zhì)子。Rao等[58]提出：質(zhì)子提取可能是由于酶活性位點(diǎn)上賴氨酸，導(dǎo)致了C—O鍵的斷裂，并在C4和C5之間形成了雙鍵。他們將酸堿催化理論推廣到β-消除反應(yīng)中，催化堿提取C5質(zhì)子(假定為賴氨酸)需要一種作用于羧基的催化酸。因此，提出PGL的Ca2+可以作為路易斯酸(Lewis acid)來滿足這一要求。首先，Ca2+對羧基的極化作用會(huì)使C5處的質(zhì)子酸化，從而被酶的催化堿提取。其次，由于PGLs的最適pH較高，蛋白質(zhì)中側(cè)鏈基團(tuán)不能滿足作為催化酸的要求。雖然Ca2+在大多數(shù)含鈣金屬酶中主要起結(jié)構(gòu)作用，但在某些酶中也具有催化作用。因此，果膠酸裂解酶似乎以Ca2+為路易斯酸、賴氨酸為催化堿來催化β-消除反應(yīng)。

3.4.1.2 過渡金屬離子輔助的β-消除機(jī)制

PL2家族來自小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica)的PGL(YePL2A)呈現(xiàn)罕見的(α/α)7桶狀結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的過渡金屬輔助β-消除[28]。盡管它的折疊很少見，但YePL2A的催化中心可以與結(jié)構(gòu)上不相關(guān)的家族重疊，突出了β-消除機(jī)制保守的催化氨基酸結(jié)構(gòu)。YePL2A還具有其他2個(gè)特性：①可利用鈣以外的金屬原子進(jìn)行催化；②其布朗斯特堿(Br?nstead base)呈交替構(gòu)象，可以直接與底物的糖醛酸基團(tuán)相互作用。

首先，YePL2A中假定的催化堿(Arg171)從與PL1和PL10家族PGLs相反的方向接近底物。在這種構(gòu)象中，亞氨基N與底物糖醛酸基團(tuán)形成了新的相互作用，有助于穩(wěn)定反應(yīng)中間體。其次，在YePL2A結(jié)構(gòu)復(fù)合物中，金屬離子位于底物糖醛酸基團(tuán)的2個(gè)氧原子之間，與PL1和PL10家族的酶相比，它具有更合適的幾何形狀。此外，還有2種氨基酸在催化中起輔助作用：Arg272參與了O2和O3底物識(shí)別，Glu130參與了金屬配位。最后，綜合考慮生化和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，都強(qiáng)烈支持了YePL2A中過渡金屬M(fèi)n2+或者Ni2+輔助了β-消除機(jī)制。然而，更多關(guān)于過渡金屬離子輔助β-消除機(jī)制的細(xì)節(jié)仍有待進(jìn)一步的研究。

3.4.2 Arg作為催化堿的β-消除機(jī)制

Ma等[59]探究了PL1家族來自枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的PGL(BsPel)的反式β-消除機(jī)制：Arg279作為催化堿可以從底物的C原子中提取質(zhì)子，從而形成不穩(wěn)定的碳負(fù)離子中間體(圖9(c))。該中間體的糖苷鍵很容易被切割，生成4，5-不飽和二半乳糖醛酸產(chǎn)物和帶負(fù)電的R1-O-基團(tuán)?；钚晕稽c(diǎn)的3個(gè)Ca2+在通過配位相互作用緊密結(jié)合底物方面起著至關(guān)重要的作用，其中2個(gè)Ca2+通過酸化質(zhì)子促進(jìn)其轉(zhuǎn)移，并穩(wěn)定了生成的中間體。Lys247和Arg279則是通過與底物形成氫鍵來促進(jìn)催化作用。此外，還證實(shí)了Arg284不是潛在質(zhì)子供體。離去基團(tuán)的質(zhì)子來自溶劑水分子，而不是活性位點(diǎn)的任何酸性殘基。

3.4.3 Lys作為催化堿的β-消除機(jī)制

Alahuhta等[55]研究了PL3家族的PGL(PL3)后發(fā)現(xiàn)，Lys108作為β-消除反應(yīng)的催化堿，卻沒有明確的催化酸候選物。該反應(yīng)機(jī)制可以通過反平面反式消除反應(yīng)來解釋：其中Lys108從C5原子中提取質(zhì)子，不需要通過酸性殘基提供質(zhì)子，酸化的水分子則通過質(zhì)子化底物的O4原子完成反式β-消除反應(yīng)。除此之外，酸性殘基Glu84、Glu39和Asp107參與了Ca原子配位作用：活性中心有3個(gè)Ca原子，Glu84是其中2個(gè)Ca結(jié)合所必需的。Gln111和Arg133參與了底物結(jié)合，Arg133則有助于底物的正確定位，其中Gln111對底物結(jié)合的影響較小，可能在反應(yīng)的最后一步穩(wěn)定了O4原子。

4 結(jié)論與展望

首先，對PGLs和PMGLs的來源、分類、生化特性及作用模式等進(jìn)行了闡述，還對不同PLs家族的相關(guān)裂解酶進(jìn)行了序列比對和進(jìn)化歷程分析，這有助于加深人們的系統(tǒng)認(rèn)知。其次，為了探究其功能與結(jié)構(gòu)之間的聯(lián)系，對不同PLs家族PGLs和PMGLs的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。目前，PL1、3和9家族的裂解酶均為平行的β-螺旋結(jié)構(gòu)，PL2家族的PGLs呈現(xiàn)較為罕見的(α/α)7桶狀結(jié)構(gòu)，而PL10家族的PGLs則為(α/α)3桶狀結(jié)構(gòu)。最后，關(guān)于催化機(jī)制：PGLs和PMGLs都能通過反式β-消除反應(yīng)裂解果膠分子中的α-1,4糖苷鍵。從酸堿質(zhì)子理論的角度來看：位于活性位點(diǎn)的Ca2+往往起到酸化底物的作用，催化堿(通常是精氨酸)從被酸化底物的C5原子中提取質(zhì)子，從而生成烯醇中間體，催化酸提供質(zhì)子，在C4和C5之間形成雙鍵從而導(dǎo)致糖苷鍵的斷裂。根據(jù)輔助β-消除的金屬離子不同，將催化機(jī)制分為Ca2+輔助和過渡金屬離子輔助；根據(jù)催化堿的不同，可分為Lys型和Arg型β-消除催化機(jī)制。

總之，作為全球酶市場最受關(guān)注的生物催化劑之一，微生物來源的PMGLs和PGLs日益成為食品、造紙和紡織等工業(yè)領(lǐng)域的重要候選者。然而，目前關(guān)于PMGLs和PGLs的研究主要集中在來源、生化特性及其應(yīng)用等基礎(chǔ)層面，未來的研究將不再局限于新酶的克隆及生化特性的表征等較基礎(chǔ)的研究，也許會(huì)更多地聚焦于三維結(jié)構(gòu)解析、催化機(jī)制的深入研究、酶分子改造和工業(yè)化應(yīng)用等諸多領(lǐng)域。