CRISPR/Cas系統(tǒng)在生物核酸檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展

王 倩，趙俊桃，陳 聰，曹英秀

(1.天祥(天津)質(zhì)量技術(shù)服務(wù)有限公司，天津 300384；2.天津大學(xué) 化工學(xué)院 教育部系統(tǒng)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300350)

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins，CRISPR/Cas)是古細(xì)菌和大多數(shù)細(xì)菌在生物進(jìn)化過程中抵御病毒入侵而形成的一種適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)[1]。早在1987年，Ishino等[2]在大腸桿菌中首次發(fā)現(xiàn)CRISPR序列，但并未引起廣泛的關(guān)注。直到2012年，Doudna J A和Charpentier E等指導(dǎo)的學(xué)生Jinek等[3]首次證明CRISPR/Cas9可以在體外識(shí)別并切割靶標(biāo)DNA，隨后張鋒團(tuán)隊(duì)的Cong等[4]和Church G M團(tuán)隊(duì)的Mali等[5]成功地將該系統(tǒng)應(yīng)用于真核細(xì)胞。從此，基于CRISPR/Cas基因組編輯技術(shù)受到了科學(xué)界的高度重視，并取得了巨大進(jìn)展。2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予Charpentier E和Doudna J A，以表彰她們?cè)诨蚪M編輯開發(fā)方面做出的巨大貢獻(xiàn)。大量CRISPR/Cas新系統(tǒng)和新技術(shù)的發(fā)現(xiàn)與開發(fā)[6-11]，促進(jìn)了基因編輯[12-16]、藥理研究[17]、遺傳篩選[18-19]、疾病建模與治療[17,20]及分子診斷[21]等學(xué)科的快速發(fā)展。此外，科研人員發(fā)現(xiàn)部分Cas蛋白(如Cas12、Cas13和Cas14)具有“附帶切割”活性，即Cas核酸酶可以裂解熒光報(bào)告分子，而被應(yīng)用于生物傳感中，并開發(fā)為有效、快速、低成本和高靈敏度的分子檢測(cè)工具，推動(dòng)了核酸檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，并取得一系列重要成果。本文主要介紹CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類及特征，綜述了基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸檢測(cè)領(lǐng)域的最新進(jìn)展，并展望了CRISPR/Cas系統(tǒng)在生物檢測(cè)領(lǐng)域所面臨的挑戰(zhàn)。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)簡介

CRISPR/Cas系統(tǒng)是由Cas效應(yīng)蛋白和CRISPR RNAs(crRNAs)組合而成的免疫防御系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要通過適應(yīng)、crRNA成熟和干擾這3個(gè)階段實(shí)現(xiàn)免疫功能[11,22](圖1)。在適應(yīng)階段，當(dāng)外源的噬菌體、病毒或質(zhì)粒DNA序列首次入侵時(shí)，Cas1-Cas2蛋白復(fù)合物識(shí)別外源DNA序列的前間隔區(qū)序列鄰近基序(PAM)，并截取一段非重復(fù)序列將其作為新的間隔序列整合到宿主基因組的CRISPR序列中[22]。在crRNA成熟階段，當(dāng)外源的噬菌體、病毒或質(zhì)粒DNA序列再次入侵時(shí)，CRISPR序列在RNA聚合酶的作用下轉(zhuǎn)錄成一條單一的前體CRISPR RNA(pre-crRNA)，之后被RNA內(nèi)切酶切割成成熟的crRNA[23]。在干擾階段，成熟的crRNA與具有核酸內(nèi)切酶活性的Cas蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，crRNA與特定序列互補(bǔ)配對(duì)，并引導(dǎo)Cas蛋白識(shí)別PAM位點(diǎn)并完成切割[24]。

圖1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的工作原理[22]Fig.1 Schematic diagram of the CRISPR/Cas system[22]

不同CRISPR/Cas系統(tǒng)的效應(yīng)器模塊存在很大差異[11]。在最新的分類中，根據(jù)Cas蛋白編碼基因及干擾復(fù)合物的特性，CRISPR/Cas系統(tǒng)分為兩類，并進(jìn)一步分為6種、33亞型[22,25](圖2)。在1類系統(tǒng)(Ⅳ型、Ⅲ型和Ⅰ型)中，干擾階段由多個(gè)Cas效應(yīng)蛋白復(fù)合物執(zhí)行；2類系統(tǒng)包括Ⅵ型、Ⅴ型和Ⅱ型，使用單個(gè)效應(yīng)器進(jìn)行干擾[22]。由于單個(gè)Cas效應(yīng)蛋白更有利于開發(fā)新的工具，所以目前常選擇2類CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)行應(yīng)用工具的開發(fā)及改造。

圖2 Cas相關(guān)蛋白的分類[25]Fig.2 Classification of Cas related proteins[25]

最常用的核酸檢測(cè)工具箱為Cas9、Cas12、Cas13和Cas14，均屬于第2類CRISPR/Cas系統(tǒng)[26](表1)。CRISPR/Cas9屬于Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)，是目前最常用的CRISPR/Cas系統(tǒng)[3-4,27]。典型的化膿鏈球菌的Cas9主要包括3個(gè)功能元件：crRNA、反式作用CRISPR RNA(tracrRNA)和Cas9核酸酶蛋白。crRNA與靶標(biāo)雙鏈DNA(dsDNA)序列同源，并與tracrRNA部分互補(bǔ)構(gòu)成蛋白復(fù)合體，引導(dǎo)Cas9蛋白識(shí)別PAM位點(diǎn)并在特定位點(diǎn)切割[24]。為了簡化基因編輯的過程，crRNA和tracrRNA通常被整合成單個(gè)向?qū)NA(sgRNA)用于識(shí)別靶標(biāo)雙鏈(dsDNA)[3]。Cas9蛋白由α-螺旋識(shí)別區(qū)(REC)、羧基端的PAM結(jié)合區(qū)和兩個(gè)活性區(qū)域組成，包括HNH活性區(qū)域和RuvC活性區(qū)域。HNH結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)靶鏈(sgRNA互補(bǔ)鏈)裂解，RuvC活性區(qū)域誘導(dǎo)非靶鏈裂解，產(chǎn)生平末端雙鏈斷裂(DSB)[28-30]。DSBs的產(chǎn)生會(huì)刺激細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制啟動(dòng)。細(xì)胞中存在2種不同的酶輔助DNA修復(fù)途徑，包括易錯(cuò)非同源端連接(NHEJ)和無錯(cuò)同源修復(fù)(HDR)途徑[31-32]。NHEJ途徑通常會(huì)引入缺失或插入突變，通過在開放閱讀框中誘導(dǎo)移碼突變，可以破壞靶基因的遺傳功能；而HDR途徑可以實(shí)現(xiàn)精確的基因編輯，在供體DNA模板存在的情況下，在體內(nèi)外實(shí)現(xiàn)精確的基因編輯[33]。

表1 用于核酸檢測(cè)的Cas效應(yīng)蛋白的主要特征

最近發(fā)現(xiàn)的新型Cas蛋白(Cas12、Cas13和Cas14)具有不同于Cas9的新特性。在Cas12和Cas13中，重點(diǎn)介紹Cas12a和Cas13a。Cas12a也被稱為Cpf1，屬于Ⅴ型CRISPR系統(tǒng)[11]。Cas12a系統(tǒng)不需要tracrRNA，只需要與crRNA結(jié)合形成復(fù)合物就能識(shí)別PAM序列，在5′PAM下游切割dsDNA，產(chǎn)生黏性末端[34]。與Cas9產(chǎn)生的平末端相比，黏性末端可提高DNA修復(fù)時(shí)基因編輯的準(zhǔn)確性。此外，與Cas9系統(tǒng)相比，Cas12a具有特異切割靶標(biāo)單鏈DNA(ssDNA)的cis-和trans-切割活性，其中cis-切割不需要PAM序列輔助就可以特異切割靶標(biāo)ssDNA。Cas12-crRNA與靶序列結(jié)合后，單鏈脫氧核糖核酸酶(DNase)活性被激活，能夠非特異、無差別的任意切割體系中的ssDNA，這種特性就是trans-切割活性[35-36]，也被稱為“附帶切割活性”[36]。Cas13a，原名C2c2，屬于Ⅵ型CRISPR系統(tǒng)，僅需要輔助單個(gè)crRNA就可以對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行識(shí)別與裂解。與Cas9和Cas12a不同，Cas13a靶向切割單鏈RNA(ssRNA)，而不是DNA[6]。與Cas12a一樣，Cas13a也具有附帶切割活性。Cas13a的發(fā)現(xiàn)將基因編輯的范圍從DNA拓寬到了RNA[37]。Cas14是一種僅在古菌中發(fā)現(xiàn)的Ⅴ型CRISPR系統(tǒng)，能夠在無PAM序列的情況下識(shí)別并裂解ssDNA[9]，也具有附帶切割活性。Cas14蛋白是目前為止發(fā)現(xiàn)的最小RNA引導(dǎo)效應(yīng)蛋白，僅含有400～700個(gè)氨基酸(aa)，約為Cas9和Cas12a(950～1 400 aa)的一半[9]。

2 用于核酸檢測(cè)的CRISPR/Cas系統(tǒng)

核酸是分子診斷技術(shù)檢測(cè)感染性疾病、抗菌素耐藥性基因、癌癥或遺傳疾病發(fā)展相關(guān)的突變(如杜氏肌營養(yǎng)不良癥等)、單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和生物標(biāo)記物的重要目標(biāo)[9]。CRISPR/Cas系統(tǒng)具有高效識(shí)別核酸的能力，已被證明是可用于核酸檢測(cè)的高效工具。通過聯(lián)合CRISPR/Cas系統(tǒng)與傳統(tǒng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)或等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，科學(xué)家們開發(fā)出多個(gè)基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸檢測(cè)系統(tǒng)[38]。近年來，納米技術(shù)、生物分子識(shí)別技術(shù)、界面修飾技術(shù)和分子組裝技術(shù)等[39]核酸檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用到多個(gè)領(lǐng)域，如轉(zhuǎn)基因(GMO)食品檢測(cè)[40]、血液供應(yīng)篩選[41-42]、疾病診斷[43-44]、基因表達(dá)譜分析[45-46]、基因座標(biāo)記[47]、跟蹤環(huán)境中的生物污染[48-49]和新型冠狀病毒檢測(cè)[50-51]等。

2.1 基于CRISPR/Cas9的核酸檢測(cè)系統(tǒng)

可編程的Cas9核酸內(nèi)切酶已被證明是核酸檢測(cè)的強(qiáng)大生物識(shí)別元件[9]。通過將Cas9與不同的核酸擴(kuò)增方法相結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)病毒分型和單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的檢測(cè)。最近開發(fā)的三代CRISPR型PCR(ctPCR)利用Cas9-sgRNA復(fù)合物識(shí)別并切割目標(biāo)DNA，然后將切割后的DNA修飾成可以通過PCR或qPCR擴(kuò)增的形式。在ctPCR1.0中，切割后的DNA末端帶有腺嘌呤A，通過胸腺嘧啶T銜接子連接上一對(duì)引物并進(jìn)行擴(kuò)增[52]；而ctPCR2.0中，切割后的產(chǎn)物可以進(jìn)行分子間串聯(lián)，從而形成線性DNA或環(huán)狀DNA[53]。由于連接過程的差異，2.0版的檢測(cè)靈敏度得到了提高。二者都可以區(qū)分人類乳頭瘤病毒(HPV病毒)的HPV16和HPV18，但它們都需要在Cas9切割之前先進(jìn)行一輪PCR擴(kuò)增，以保證檢測(cè)的靈敏度。ctPCR3.0版利用一輪qPCR過程就實(shí)現(xiàn)了對(duì)靶DNA的檢測(cè)，簡化了檢測(cè)流程[54]。

表2比較了幾種基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)開發(fā)的核酸檢測(cè)相關(guān)生物傳感系統(tǒng)。2016年，Pardee等[55]首次使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為病毒診斷工具，結(jié)合了基于核酸序列的擴(kuò)增反應(yīng)(NASBA)和CRISPR/Cas9系統(tǒng)，并借助toetold開關(guān)開發(fā)出一種低成本且實(shí)現(xiàn)寨卡病毒(ZIKV)的檢測(cè)和分型的紙基傳感器，這種生物傳感系統(tǒng)被命名為NASBACC(NASBA-CRISPR Cleavage)。該系統(tǒng)基于一種工程寡核苷酸傳感器，采用NASBA擴(kuò)增ZIKV的靶標(biāo)后，將Cas9與寡核苷酸傳感器結(jié)合進(jìn)行靶標(biāo)檢測(cè)：在識(shí)別目標(biāo)RNA時(shí)，觸發(fā)β-半乳糖苷酶(LacZ酶)的翻譯，將紙盤上的黃色底物(氯酚紅-D-半乳糖苷)轉(zhuǎn)化為紫色產(chǎn)物(氯酚紅)，通過肉眼觀察顏色變化即可實(shí)現(xiàn)ZIKV的檢測(cè)。2018年，Zhou等[56]開發(fā)了一種稱為CRISPR/Cas9觸發(fā)的缺口內(nèi)切酶介導(dǎo)的鏈位移擴(kuò)增(CRISDA)的方法，可將Cas9的檢測(cè)限提高到了10-18(阿摩爾級(jí)，amol)水平，用于人乳腺癌基因分型和轉(zhuǎn)基因大豆的檢測(cè)：首先，利用HNH催化殘基突變的Cas9識(shí)別特異性靶標(biāo)DNA并在非靶標(biāo)DNA中切出一對(duì)獨(dú)特的缺口，使引物對(duì)雜交到非靶標(biāo)鏈上；其次，加入鏈置換擴(kuò)增(SDA)混合物后，依次利用線性切口內(nèi)切酶和指數(shù)切口內(nèi)切酶進(jìn)行擴(kuò)增；最后，通過與肽核酸(PNA)入侵介導(dǎo)的終點(diǎn)測(cè)量結(jié)合實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。同年，Huang等[57]利用CRISPR/Cas9觸發(fā)等溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)(CAS-EXPAR)，開發(fā)了一種位點(diǎn)特異性NT試劑盒，該試劑盒不需要任何外部引物，而是將Cas9蛋白切割后的產(chǎn)物作為引物，利用Cas9的靶特異性刻痕內(nèi)切酶介導(dǎo)EXPAR完成擴(kuò)增，并采用實(shí)時(shí)熒光法檢測(cè)反應(yīng)。該策略結(jié)合了CRISPR/Cas9和指數(shù)擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)，特異性高，擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)快，為高效核酸擴(kuò)增提供一個(gè)新的范例，并具有分子診斷應(yīng)用的潛力。2020年，一種用于非洲豬瘟病毒(ASFV)診斷的新型便攜式核酸檢測(cè)系統(tǒng)被開發(fā)，稱為Cas介導(dǎo)的橫向流動(dòng)分析(CASLFA)[58]，該診斷試劑盒采用基于CRISPR/Cas9的超靈敏側(cè)流核酸診斷ASFV病毒。

表2 基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的便攜式核酸檢測(cè)系統(tǒng)

此外，失去切割活性的Cas9(dCas9)仍然可以在sgRNA的引導(dǎo)下特異性地結(jié)合到目的位點(diǎn)，這個(gè)特性也可以用于開發(fā)新的基于CRISPR/Cas的核酸生物傳感系統(tǒng)[59]。2017年，Guk等[60]將CRISPR/dCas9系統(tǒng)納入熒光原位雜交(FISH)技術(shù)流程，開發(fā)了一種檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的方法，稱為DNA-FISH。在該體系中，靶序列被磁性納米珠綴合的dCas9/sgRNA識(shí)別后，在磁場(chǎng)的作用下富集，進(jìn)而與熒光染料SYBR Green Ⅰ反應(yīng)產(chǎn)生熒光信號(hào)。該方法可檢出低至10 CFU的MRSA，并能高特異性地區(qū)分MRSA與對(duì)甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(MSSA)。Azhar等[50]于2020年開發(fā)了基于CRISPR/dCas9系統(tǒng)的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)診斷試劑盒，該試劑盒被命名為FnCas9編輯器鏈接統(tǒng)一檢測(cè)法(FELUDA)，通過使用熒光素酰胺(FaM)tracrRNA-sgRNA和抗FaM抗體與納米顆粒結(jié)合，利用高度精確的酶識(shí)讀來檢測(cè)核苷酸序列，識(shí)別堿基身份，并精確推斷合子性，適用于新型冠狀病毒肺炎等傳染病暴發(fā)期間的快速診斷。

2.2 基于CRISPR/Cas12的核酸檢測(cè)系統(tǒng)

與CRISPR/Cas9系統(tǒng)相比，Casl2a可直接在crRNA的引導(dǎo)下與dsDNA結(jié)合并完成切割。表3比較了幾種基于CRISPR/Cas12系統(tǒng)開發(fā)的核酸檢測(cè)相關(guān)生物傳感系統(tǒng)。2018年，Doudna等[36]利用Cas12a的附帶切割活性開發(fā)了DNA內(nèi)切核酸酶靶向CRISPR反式報(bào)告基因(DETECTR)的方法。該方法首先利用重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)樣品，CRISPR/Cas12a與擴(kuò)增產(chǎn)物混合后被靶標(biāo)序列激活，切割靶序列和反應(yīng)體系中的ssDNA熒光探針，釋放熒光信號(hào)，從而對(duì)HPV病毒進(jìn)行準(zhǔn)確、快速檢測(cè)。DETECTR已顯示出從臨床標(biāo)本中檢測(cè)病毒的巨大能力，僅需1 h即可完成病毒檢測(cè)，且具有amol級(jí)的靈敏度。Broughton等[61]在2020年將DETECTR用于SARS-CoV-2的檢測(cè)，他們使用逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)擴(kuò)增提取的嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)-CoV-2 RNA，從而產(chǎn)生dsDNA產(chǎn)物，之后用Cas12對(duì)報(bào)告基因進(jìn)行側(cè)枝裂解檢測(cè)dsDNA產(chǎn)物，然后用橫向流動(dòng)條產(chǎn)生讀出信號(hào)。受DETECTR方法的啟發(fā)，Teng等[62]于2019年開發(fā)了Cas12b介導(dǎo)的DNA檢測(cè)方法(CDetection)，可以在單堿基水平上區(qū)分HPV病毒核酸序列的差異?；贑as12b的反應(yīng)溫度與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)相同，Li等[63]開發(fā)了基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的最簡單RNA檢測(cè)平臺(tái)，稱為“第二版一小時(shí)低成本多用途高效系統(tǒng)”(HOLMESv2)檢測(cè)平臺(tái)，在1 h內(nèi)即可快速檢測(cè)乙型腦炎病毒。這是因?yàn)镠OLMESv2可以特異性鑒別SNPs，在恒溫條件下結(jié)合LAMP擴(kuò)增一步系統(tǒng)可以方便地定量目標(biāo)核酸，通過結(jié)合Cas12b檢測(cè)和亞硫酸氫鹽的處理可以準(zhǔn)確定量靶點(diǎn)DNA甲基化。

表3 基于CRISPR/Cas12系統(tǒng)的便攜式核酸檢測(cè)系統(tǒng)

除了核酸檢測(cè)外，Cas12a還被開發(fā)為小分子檢測(cè)的高通量平臺(tái)。2019年，Liang等[64]開發(fā)了CRISPR/Cas12a和變構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子(aTF)介導(dǎo)的小分子探測(cè)器(CaT-SMelor)方法，成功地檢測(cè)了人類血清樣本中的尿酸。功能性的dsDNA包含1個(gè)可被纖維素結(jié)合域-變構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子(CBD-aTF)識(shí)別的序列，并因此被固定在微晶纖維素上，當(dāng)目標(biāo)分子出現(xiàn)并與aTF結(jié)合時(shí)，aTF的構(gòu)象發(fā)生變化，從而釋放dsDNA，觸發(fā)Cas12的附帶切割活性。因此，通過測(cè)定ssDNA熒光探針?biāo)a(chǎn)生的熒光信號(hào)的變化，就可以對(duì)目標(biāo)小分子進(jìn)行定性定量分析。Xiong等[65]開發(fā)出一種通用的功能DNA(fDNA)調(diào)節(jié)的CRISPR/Cas12a傳感器，將CRISPR系統(tǒng)用于常溫(25 ℃)環(huán)境下三磷酸腺苷(ATP)和Na+快速定量檢測(cè)，僅需要15 min；在不存在非核酸靶標(biāo)時(shí)，fDNA與靶標(biāo)DNA結(jié)合，阻止其與Cas12a結(jié)合，而在非核酸靶標(biāo)存在的情況下，靶標(biāo)DNA被釋放，激活Cas12a，從而導(dǎo)致熒光信號(hào)的增加。

2.3 基于CRISPR/Cas13的核酸檢測(cè)系統(tǒng)

CRISPR/Cas13的附帶切割活性、特異性靶向ssRNA的特性及SHERLOCK技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了該系統(tǒng)在核酸檢測(cè)方向的應(yīng)用。與HOLMES類似，基于Cas13的檢測(cè)系統(tǒng)需要對(duì)目標(biāo)基因組、crRNA和熒光ssRNA探針進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增。此外，該技術(shù)還需要一個(gè)合成體外RNA的額外步驟，一旦crRNA與擴(kuò)增RNA結(jié)合，Cas13對(duì)其進(jìn)行切割，并開始對(duì)附近的ssRNA探針進(jìn)行側(cè)切，之后通過熒光技術(shù)進(jìn)行測(cè)量和定量[21]。表4比較了幾種基于CRISPR/Cas13系統(tǒng)開發(fā)的核酸檢測(cè)相關(guān)生物傳感系統(tǒng)。2017年，張鋒團(tuán)隊(duì)的Caliendo等[66]和Gootenberg等[67]開發(fā)了基于CRISPR/Cas13a的特異性高敏酶報(bào)告基因解鎖(SHERLOCK)檢測(cè)平臺(tái)技術(shù)：首先，利用RPA擴(kuò)增或逆轉(zhuǎn)錄-RPA(RT-RPA)將樣品擴(kuò)增為含有T7啟動(dòng)子的DNA模板；隨后，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，RNA產(chǎn)物作為靶標(biāo)被Cas13a識(shí)別并切割；最后，Cas13a的附帶切割特性被激活，同時(shí)切割反應(yīng)體系內(nèi)的ssRNA熒光探針，使其發(fā)出熒光信號(hào)。該方法能夠以單堿基特異性快速對(duì)DNA或RNA進(jìn)行檢測(cè)，已成功應(yīng)用于檢測(cè)ZIKV、登革熱病毒、耐藥菌、人類基因型和癌癥突變等方面。2018年，該團(tuán)隊(duì)將SHERLOCK進(jìn)一步改進(jìn)為第二代SHERLOCK(SHERLOCKv2)，將Cas13a與一種輔助的CRISPR Ⅲ型核酸酶Csm6聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)了多通道檢測(cè)與橫向流讀數(shù)并進(jìn)一步提高了靈敏度[68]，能夠在非常低濃度(低至1拷貝/微升)的生物液體中直接檢測(cè)致病樣品的核酸。目前，SHERLOCK技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于檢測(cè)鼻咽喉拭子樣本的SARS-CoV-2，實(shí)現(xiàn)了極限內(nèi)100%敏感的熒光信號(hào)的監(jiān)測(cè)[69]。與此同時(shí)，Myhrvold等[70]研制出了加熱未提取的診斷樣品以消除核酸酶(HUDSON)技術(shù)，利用加熱和化學(xué)還原方法，可以同時(shí)裂解病毒顆粒并滅活體液中的高水平核糖核酸酶，通過將HUDSON和SHERLOCK結(jié)合起來，可以在不使用儀器的條件下，在2 h內(nèi)從病人的樣本中檢測(cè)出登革熱病毒，這具有在低技術(shù)水平的條件下檢測(cè)病毒的潛力。

近期，針對(duì)SARS-CoV-2的診斷，Rauch等[51]還引入了一種基于CRISPR/Cas13系統(tǒng)的新方法，該方法是堅(jiān)固的、合理的、可擴(kuò)展的測(cè)試技術(shù)(CREST)，利用低成本的儀器進(jìn)行檢測(cè)，但不影響檢測(cè)靈敏度。CREST利用廣泛使用的酶、低成本的熱循環(huán)儀和易于使用的熒光顯像儀，解決了限制基于Cas13測(cè)試可擴(kuò)展性的3個(gè)主要障礙:試劑可及性、設(shè)備可用性和成本。同時(shí)，CREST與COVID-19檢測(cè)中最常用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)法的靈敏度相當(dāng)。Shen等[71]開發(fā)了一種稱為APC-Cas的檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了沙門氏菌的定量檢測(cè)，該體系利用特異性變構(gòu)探針(AP)識(shí)別目標(biāo)病原體：在病原體存在的情況下，AP能特異性與目標(biāo)病原體結(jié)合，改變構(gòu)象，并在引物和DNA聚合酶的作用下合成dsDNA；隨后，利用T7 RNA聚合酶產(chǎn)生大量ssRNA，用于激活Cas13a的附帶切割能力；最后，Cas13a裂解ssRNA探針，產(chǎn)生熒光信號(hào)。

2.4 基于CRISPR/Cas14的核酸檢測(cè)系統(tǒng)

與Cas12和Cas13類似，Cas14a也具有非特異性附帶切割活性。與Cas12a相比，Cas14a對(duì)ssDNA的特異性識(shí)別能力更強(qiáng)，且不受PAM序列的限制，所以Cas14a可應(yīng)用于單堿基突變的核酸檢測(cè)系統(tǒng)[38]。Harrington等[9]在DETECTR的基礎(chǔ)上，對(duì)Cas14效應(yīng)蛋白進(jìn)行改進(jìn)，使它能用于當(dāng)前使用Cas12和Cas13快速檢測(cè)傳染性生物和基因突變存在的診斷系統(tǒng)，稱為Cas14-DETECTR系統(tǒng)，該系統(tǒng)用于檢測(cè)人類HERC2基因；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，Cas14-DETECTR不受PAM序列的限制，可以對(duì)SNPs進(jìn)行高保真檢測(cè)，但由于其僅能靶向ssDNA，因此需將擴(kuò)增后的dsDNA的一條鏈降解，在一定程度上增加了操作的復(fù)雜性。

3 CRISPR/Cas系統(tǒng)用于核酸檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)與挑戰(zhàn)

CRISPR/Cas系統(tǒng)具有作為疾病和病原體檢測(cè)診斷工具的潛力。大多數(shù)已報(bào)道的CRISPR/Cas生物傳感系統(tǒng)具有易于開發(fā)/再開發(fā)、高分辨率、高靈敏度和低成本的優(yōu)點(diǎn)。

3.1 生物核酸檢測(cè)的通用性

雖然上述每一種檢測(cè)方法都只涵蓋一到兩種應(yīng)用領(lǐng)域，但有的系統(tǒng)成功地展示了其作為一種通用型生物感應(yīng)策略在更為廣泛的領(lǐng)域中使用的潛力。例如，Wang等[58]開發(fā)了CRISPR/Cas9介導(dǎo)的CASLFA，以識(shí)別單核增生李斯特菌和ASFV病毒。Dai等[72]設(shè)計(jì)了一種基于CRISPR/Cas12a的電化學(xué)生物傳感器(E-CRISPR)，用于檢測(cè)臨床樣本中的病毒核酸(HPV-16和PB-19)以及轉(zhuǎn)化生長因子b1(TGF-b1)蛋白。由于gRNA序列易于被修改，因此基于CRISPR的診斷設(shè)備可以檢測(cè)任何目標(biāo)核酸序列，具有隨時(shí)適應(yīng)檢測(cè)突發(fā)性病毒感染的潛力。在DETECTR基礎(chǔ)上，Broughton等[61]開發(fā)了SARS-CoV-2 DETECTR，用于快速、準(zhǔn)確地從患者樣本中檢測(cè)SARS-CoV-2。雖然已有多種基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸檢測(cè)方法用于細(xì)菌、病毒和癌癥突變等靶標(biāo)的檢測(cè)，但是使用這些方法的一個(gè)潛在風(fēng)險(xiǎn)是對(duì)基因組序列的脫靶效應(yīng)不能完全避免，而且脫靶效應(yīng)可能導(dǎo)致假陰性或假陽性的出現(xiàn)。我們推測(cè)，找到新的Cas效應(yīng)蛋白或可替代的Cas變體以改變CRISPR系統(tǒng)的特異性，采用線上工具合理設(shè)計(jì)gRNA或?qū)RNA進(jìn)行化學(xué)修飾可能促進(jìn)脫靶效應(yīng)的解決。未來，隨著脫靶點(diǎn)的改進(jìn)及脫靶效應(yīng)的解決，CRISPR/Cas技術(shù)在分子檢測(cè)中的準(zhǔn)確性也將得到大幅度提高。

3.2 高分辨率和高靈敏度

以傳統(tǒng)的PCR為基礎(chǔ)的診斷方法具有較高的靈敏度和特異性，但需要特殊的儀器，操作人需要專業(yè)技能，限制了其廣泛應(yīng)用。與基于PCR的傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，在結(jié)合適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增方法的條件下，大多數(shù)基于CRISPR的核酸診斷系統(tǒng)都顯示出了單堿基分辨率和amol級(jí)靈敏度的核酸檢測(cè)能力。例如，SHERLOCK技術(shù)采用的RPA擴(kuò)增方法將檢測(cè)靈敏度從皮摩爾(pmol)級(jí)提高到amol級(jí)[67]。在最近的研究中，Shi等[73]基于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)精準(zhǔn)序列識(shí)別特性及附帶切割催化活性，構(gòu)建出一種CRISPR/Cas12a自催化核酸正反饋網(wǎng)絡(luò)(CONAN)，利用CRISPR/Cas12a驅(qū)動(dòng)的人工核酸回路實(shí)現(xiàn)了臨床樣品中基因組核酸靶標(biāo)的超靈敏和高特異性檢測(cè)。與傳統(tǒng)的基于CRISPR/Cas的核酸診斷系統(tǒng)相比，這種方法不需要結(jié)合其他核酸擴(kuò)增技術(shù)，僅依賴CRISPR/Cas12a系統(tǒng)自身就可以實(shí)現(xiàn)超靈敏的核酸檢測(cè)，使操作系統(tǒng)更加簡便，為推進(jìn)核酸回路應(yīng)用于醫(yī)療分子診斷提供了一種切實(shí)可行的策略，也在推動(dòng)早期診斷、疾病治療、傳染病防治等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。未來的工作可以進(jìn)一步開發(fā)出更加精簡、靈敏度高的人工核酸回路用于特異性核酸分子診斷。

3.3 低成本

基于CRISPR/Cas的檢測(cè)方法擺脫了復(fù)雜的儀器、昂貴的試劑和專業(yè)操作人員，因此在成本方面有了很大的優(yōu)勢(shì)。膠體金試紙條可以大批量生產(chǎn)，在室溫下能儲(chǔ)存一年以上，并可在日常生活中使用[55]。例如，SHERLOCK試紙條的檢測(cè)費(fèi)用約為0.61美元[65]，這十分適合于低成本的即時(shí)診斷。除了試紙條，借助生物傳感器將檢測(cè)信號(hào)轉(zhuǎn)換為一系列易讀信號(hào)，并借助裸眼或便攜式儀器進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的輸出，也可以大大降低成本。為了實(shí)現(xiàn)SARS-CoV-2的便攜式及時(shí)檢測(cè)，基于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的磁性下拉輔助比色法(M-CDC)和RT-RPA偶聯(lián)CRISPR/Cas12a比色法都使用金納米顆粒(Au NPs)探針作為信號(hào)輸出，無需使用精密的光學(xué)儀器，通過肉眼即可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)[74-75]?；贑RISPR/Cas12a系統(tǒng)的CRISPR集群檢測(cè)方法利用逆轉(zhuǎn)錄重組酶輔助擴(kuò)增技術(shù)(RT-RAA)擴(kuò)增樣品后，結(jié)合CRISPR/Cas12a系統(tǒng)和葡萄糖將檢測(cè)信號(hào)轉(zhuǎn)化為葡萄糖信號(hào)，使用便攜式的個(gè)人血糖儀在幾秒內(nèi)即可讀取結(jié)果，大大降低了材料成本及檢測(cè)時(shí)間[76]。與依賴特定儀器的RT-qPCR檢測(cè)方法相比，已研究的新型核酸檢測(cè)系統(tǒng)成本大大降低。為了進(jìn)一步降低成本，這些新型核酸檢測(cè)系統(tǒng)已經(jīng)用來生產(chǎn)可用于現(xiàn)場(chǎng)的檢測(cè)試劑盒，這些試劑盒不需要特定的儀器或昂貴的試劑，具有高效、低成本、簡單易用的優(yōu)點(diǎn)，非常適合低成本的醫(yī)療點(diǎn)診斷。相信通過進(jìn)一步的系統(tǒng)優(yōu)化，預(yù)計(jì)檢測(cè)的價(jià)格會(huì)更低。

3.4 定量檢測(cè)

對(duì)于待檢物質(zhì)的定量分析對(duì)于疾病診斷來說是十分必要的。目前已有多種方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的半定量或定量檢測(cè)。Hajian等[77]開發(fā)了CRISPR-CHIP系統(tǒng)，用于快速識(shí)別和量化目標(biāo)DNA序列，該系統(tǒng)結(jié)合了CRISPR/dCas9和石墨烯基場(chǎng)效應(yīng)晶體管(gFET)的優(yōu)點(diǎn)，gFET對(duì)其表面分子的靜電相互作用十分敏感，目標(biāo)DNA一旦與被dCas9 CRISPR復(fù)合物功能化的石墨烯識(shí)別，就可以在15 min內(nèi)影響電信號(hào)的輸出。隨后，Bruch等[78]將Cas13a與電化學(xué)微流體生物傳感器結(jié)合在了一起，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在靶標(biāo)存在的情況下，生物素和6-羧基熒光素(FAM)雙重標(biāo)記的報(bào)告RNA將被裂解；如果體系中不存在靶標(biāo)，葡萄糖氧化酶會(huì)被報(bào)告RNA固定在電極附近，催化葡萄糖產(chǎn)生H2O2，進(jìn)而產(chǎn)生電流。目前，該系統(tǒng)已被用于定量檢測(cè)潛在的腫瘤標(biāo)志物microRNAs。2020年，徐志南課題組的Huang等[79]將RAA和CRISPR/Cas12a組成的目標(biāo)識(shí)別系統(tǒng)與基于金納米棒的級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)多色信號(hào)讀出策略相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因作物的半定量檢測(cè)。同年，丁顯廷課題組的Wang等[80]基于CRISPR/Cas12a的附帶切割活性開發(fā)了一種高精度超靈敏的單鍋工具箱(OCTOPUS)，該方法將基因組DNA提取、RPA擴(kuò)增和Cas12a切割在同一離心管完成，只需在RPA擴(kuò)增后，通過離心將原本附于離心管蓋上的Cas12a立即添加到反應(yīng)體系，即可快速完成amol級(jí)的定量核酸檢測(cè)。2021年，一種基于CRISPR/Cas13a系統(tǒng)trans-切割活性的視覺檢測(cè)系統(tǒng)(vCas)也被用于定量檢測(cè)潛在的腫瘤標(biāo)志物microRNAs[81]，這種方法通過DNA聚合酶介導(dǎo)的滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)擴(kuò)增靶標(biāo)microRNAs，之后將RCA產(chǎn)物與氯化血紅素和2,2-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽混合顯色，用肉眼即可定量觀測(cè)目標(biāo)microRNAs。

3.5 多通路檢測(cè)

SHERLOCKv2是第一個(gè)具有多重檢測(cè)能力的系統(tǒng)，但是，目前這種方法僅限于同時(shí)檢測(cè)4種靶標(biāo)，限制了其實(shí)際應(yīng)用。最近，Ackerman等[82]開發(fā)了一個(gè)可擴(kuò)展的多路核酸檢測(cè)平臺(tái)，稱為用于核酸多重評(píng)估的組合排列反應(yīng)(CARMEN)：向每種待測(cè)樣品和檢測(cè)物中加入一種獨(dú)特的熒光染料，并將其分成小液滴，芯片上的每一個(gè)微孔都能捕獲一滴樣品溶液和一滴檢測(cè)物溶液，當(dāng)核酸序列被識(shí)別時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)，CARMEN和Cas13檢測(cè)的結(jié)合能夠在單個(gè)芯片上進(jìn)行超過4 500次測(cè)試?？梢?，CRISPR/Cas系統(tǒng)的多通路靶向潛力使研究人員能夠?qū)?xì)胞代謝過程的復(fù)雜的操縱。

3.6 新型Cas蛋白的發(fā)現(xiàn)與工程化改造

Cas9和Cas12能夠在任何需要的位置識(shí)別和切割，但它們大多數(shù)都需要PAM序列的輔助[83]，只有部分Cas12a效應(yīng)蛋白進(jìn)行附帶切割時(shí)不嚴(yán)格依賴于PAM序列[84-85]。這就部分限制了其在進(jìn)行較短序列檢測(cè)方面的應(yīng)用[86]。此外，CRISPR/Cas檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)時(shí)間仍較長。第一，Cas蛋白檢測(cè)靈敏度較低，因此需要結(jié)合適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增方法。但是，即使是最快速的LAMP和RPA擴(kuò)增方法也需要15～60 min[87]；第二，Cas蛋白的反應(yīng)速度較慢。Cas12-DETECTR的檢測(cè)時(shí)間為1 h[36]，Cas13-SHERLOCK則需要0.5～3 h[67]。為了提高反應(yīng)速度，科學(xué)家們正在尋找新的Cas蛋白，并通過添加新的成分來優(yōu)化反應(yīng)。因此，新Cas蛋白的開發(fā)及對(duì)現(xiàn)有的Cas蛋白進(jìn)行合理的工程化改造，對(duì)于開發(fā)新一代檢測(cè)方法至關(guān)重要。

4 總結(jié)與展望

CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)和Cas內(nèi)切酶的表征正在掀起一場(chǎng)基因編輯和分子診斷的革命。傳統(tǒng)的核酸檢測(cè)技術(shù)耗時(shí)長且對(duì)操作人員的專業(yè)水平要求高，因此開發(fā)精準(zhǔn)、快速、便攜、低成本、高特異性和靈敏度的新核酸檢測(cè)系統(tǒng)具有重要意義。目前的系統(tǒng)在檢測(cè)核酸、小分子和細(xì)菌病原體方面已經(jīng)成功地展示了高靈敏度、超分辨率特異性、低成本和高效率的潛力。然而，現(xiàn)有的檢測(cè)系統(tǒng)大多不能實(shí)現(xiàn)定量、多通道檢測(cè)，PAM序列的依賴性和檢測(cè)時(shí)間的延長也限制了其應(yīng)用。隨著CRISPR/Cas技術(shù)的快速發(fā)展，這一檢測(cè)系統(tǒng)將在疾病診斷、環(huán)境評(píng)估、食品質(zhì)量快速評(píng)估等其他領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用前景。

目前應(yīng)用于核酸檢測(cè)的CRISPR/Cas系統(tǒng)主要涉及Cas9、Cas12、Cas13和Cas14。隨著各種Cas效應(yīng)蛋白的出現(xiàn)，多種核酸檢測(cè)方法(SHERLOCK、HOLMES、DETECTR和HUDSON等)得到了迅速發(fā)展，而這些代號(hào)只是這種新型生物傳感技術(shù)在診斷領(lǐng)域的開端。雖然現(xiàn)有的核酸檢測(cè)方法已經(jīng)向我們展示了它們?cè)谠\斷領(lǐng)域的強(qiáng)大作用，但是在應(yīng)用于臨床診斷之前，科學(xué)家們依舊需要做大量研究以保證核酸診斷過程的準(zhǔn)確性。除此之外，現(xiàn)有的CRISPR/Cas系統(tǒng)雖然有助于核酸檢測(cè)方法的開發(fā)與改進(jìn)，但是其進(jìn)一步開發(fā)及常規(guī)應(yīng)用仍面臨著很多挑戰(zhàn)，如大多數(shù)基于CRISPR/Cas12與CRISPR/Cas9系統(tǒng)的核酸檢測(cè)技術(shù)對(duì)檢測(cè)設(shè)備及靶標(biāo)核酸富集的依賴性強(qiáng)。因此，為了開發(fā)出更加完善的核酸檢測(cè)方法，挖掘新的Cas蛋白并對(duì)其進(jìn)行工程化改造、新擴(kuò)增方法的建立、結(jié)合高效的技術(shù)平臺(tái)都是值得關(guān)注和期待的。CRISPR/Cas生物傳感技術(shù)的巨大潛力正在不斷激發(fā)人們開發(fā)下一代核酸檢測(cè)平臺(tái)的研究及應(yīng)用。我們相信，在不久的將來，新Cas效應(yīng)蛋白的發(fā)現(xiàn)將會(huì)進(jìn)一步解開生物認(rèn)知元素的多面謎題。