貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）的研究進(jìn)展

尉婧，王碧香，李詩(shī)瑤，李二峰

（天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300392）

芽孢桿菌（Bacillusspp.）分布范圍廣，對(duì)外界有害因子抵抗力強(qiáng)，屬內(nèi)絕大多數(shù)是有益微生物。它包含的部分種越來(lái)越多地被應(yīng)用于抗蟲(chóng)殺菌劑、表面活性劑、生物制劑、增味劑和營(yíng)養(yǎng)保健劑等方面[1]。貝萊斯芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一個(gè)新種，最早于 1999年被分離到，但直到 2005年才被首次報(bào)道與命名[2]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)貝萊斯芽孢桿菌的報(bào)道越來(lái)越多，主要集中在貝萊斯芽孢桿菌的分類、應(yīng)用及抗菌機(jī)理等方面。本研究就貝萊斯芽孢桿菌的發(fā)現(xiàn)與分類、基因組研究、生防作用及應(yīng)用幾個(gè)方面展開(kāi)綜述，以期為后續(xù)的研究與開(kāi)發(fā)提供參考。

1 貝萊斯芽孢桿菌的發(fā)現(xiàn)與分類

貝萊斯芽孢桿菌最早被分離于西班牙馬拉加省一條名為貝萊斯的河流[2]，其分類地位的確定比枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）等芽孢桿菌的報(bào)道都要晚[3]。由于貝萊斯芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）、暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）具有高表型相似性[4]，因此只通過(guò)表型很難將其區(qū)分。通過(guò)對(duì)DNA親緣值的分析，WANG等[5]認(rèn)為貝萊斯芽孢桿菌是解淀粉芽孢桿菌的同種異名。在此基礎(chǔ)上，DUNLAP等[6]通過(guò)對(duì)貝萊斯芽孢桿菌B-41580T菌株與解淀粉芽孢桿菌的基因組分析認(rèn)為，貝萊斯芽孢桿菌不是解淀粉芽孢桿菌的同種異名，而是甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌的同種異名。為了更好地分析這些相似菌株之間的系統(tǒng)遺傳學(xué)，DUNLAP等[6]還將居水稻芽孢桿菌（Bacillus oryzicola，KACC18228）的全基因組序列與貝萊斯芽孢桿菌NRRL B-41580T、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌KACC 13015T和解淀粉芽孢桿菌植物亞種FZB42T的全基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示它們的基因組之間僅有微小差異，且菌株間的 DNA雜交值均大于 84%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于種間閾值70%。這些菌株具有相似的表型和基因型，因此提出居水稻芽孢桿菌、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌植物亞種是貝萊斯芽孢桿菌的同種異名。2018年，F(xiàn)AN等[7]通過(guò)使用TETRA、ANI、AAI和dDDH等技術(shù)對(duì)相關(guān)菌株進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果顯示菌株FZB42T與貝萊斯芽孢桿菌代表菌株間的TETRA、ANT、AAI、ddH以及16S-rRNA值分別為0.999 1%、98.30%、99.11%、87.10%和99%，它們具有表型與基因型的高度一致性，遠(yuǎn)高于物種閾值，因此提出了“operational groupB.amyloliquefaciens”的新概念，并將Bacillus amyloliquefacienssubp.plantarumFZB42T更名為Bacillus velezensisFZB42T。除此之外，由于貝萊斯芽孢桿菌的發(fā)現(xiàn)早于其他菌株，因此將Bacillus oryzicola、Bacillus methylotrophicus、Bacillus amyloliquefacienssubp.plantarum重新歸類并命名為Bacillus velezensis。近年來(lái)，有學(xué)者通過(guò)分析管家基因解旋酶亞基A（gyrA）、解旋酶亞基B（gyrB）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)并結(jié)合貝萊斯芽孢桿菌特異性引物PCR驗(yàn)證的方法，研究了其在貝萊斯芽孢桿菌及其近緣物種鑒定中的效果，為貝萊斯芽孢桿菌的快速篩選和分類鑒定奠定了基礎(chǔ)[8]。

2 貝萊斯芽孢桿菌基因組的研究

近期，越來(lái)越多的研究人員對(duì)貝萊斯芽孢桿菌的不同亞種進(jìn)行了全基因組測(cè)序。劉國(guó)強(qiáng)等[9]對(duì)貝萊斯芽孢桿菌 LS69菌株進(jìn)行了全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該菌株有一個(gè)約 3.92 Mbp的環(huán)形染色體，具有3 643個(gè)開(kāi)放閱讀框，確定了大環(huán)內(nèi)酯（Macrolactin）、表面活性素（Surfactin）、泛革素（Fengycin）等10個(gè)化合物合成的基因簇，這些化合物均與貝萊斯芽孢桿菌的生防作用有關(guān)。此外，還發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌LS69菌株有植物促生基因dhaS、ysnE和yhcX與促進(jìn)植物免疫的基因tufA 、fliD、hag和flgK。PETROVA 等[10]對(duì)貝萊斯芽孢桿菌5R8菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該菌株含有一個(gè)3.91 Mbp的環(huán)形染色體，不含質(zhì)粒，基因組中很大一部分基因用于碳水化合物的代謝，編碼大多數(shù)參與多糖利用的酶，amyE、malL、sacA、xynA、xynB、xynD、xynC和eglS基因均編碼糖苷水解酶。這種豐富的酶譜使纖維素、半纖維素、淀粉和菊粉的轉(zhuǎn)化成為可能，并有望將貝萊斯芽孢桿菌應(yīng)用于工業(yè)原料 2，3-丁二醇的生物生產(chǎn)中。CHEN等[11]通過(guò)全基因組測(cè)序，在貝萊斯芽孢桿菌157菌株的基因組中發(fā)現(xiàn)了編碼與纖維素、木聚糖、木質(zhì)素、淀粉、甘露聚糖、半乳糖苷和阿拉伯聚糖降解有關(guān)的酶的基因，表明貝萊斯芽孢桿菌有將農(nóng)工業(yè)廢棄材料（小麥秸稈、麥麩、甘蔗渣等）進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵的潛力。基因組研究使研究對(duì)貝萊斯芽孢桿菌的遺傳、生物和生理特性等有了更深入的了解，有利于揭示其生物機(jī)制，為貝萊斯芽孢桿菌的分子機(jī)理研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供信息基礎(chǔ)。

3 貝萊斯芽孢桿菌的生防作用

3.1 次生代謝產(chǎn)物及其相關(guān)基因

次生代謝產(chǎn)物是芽孢桿菌發(fā)揮生防作用的重要手段[12]，近年來(lái)對(duì)貝萊斯芽孢桿菌生防作用的研究熱點(diǎn)集中于次生代謝產(chǎn)物及其相關(guān)基因。貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)生的具有抗菌活性的次生代謝產(chǎn)物包括脂肽類化合物（Lipopeptides）、聚酮類化合物（Polyketides）、細(xì)菌素類（Bacteriocins）和抑菌蛋白（Peptides）等。脂肽類化合物是通過(guò)非核

糖體途徑合成的，主要包括表面活性素（Surfactin）、伊枯草菌素（Iturin）、泛革素（Fengycin）、桿菌霉素（Bacillomycin）等；聚酮類化合物通過(guò)聚酮合酶合成途徑合成，包含大環(huán)內(nèi)酯（Macrolactin）、桿菌烯（Bacillaene）、地非西丁（Difficidin）等；細(xì)菌素類和抑菌蛋白類是通過(guò)核糖體途徑合成的。其中細(xì)菌素類主要指的是羊毛硫抗生素（Lantibiotics）等，根據(jù)核糖體合成之后是否經(jīng)過(guò)修飾可將細(xì)菌素分為ClassⅠ和ClassⅡ[13-14]；抑菌蛋白包括蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、β-葡聚糖酶。以上這些物質(zhì)對(duì)多種病原菌具有良好的抑制作用，是潛在的傳統(tǒng)抗生素的替代物。貝萊斯芽孢桿菌具有生防作用的次生代謝產(chǎn)物的合成是由多基因控制的，并且這些基因通常是成簇出現(xiàn)在基因組上，如表面活性素合成相關(guān)的基因簇是srfABCD，其中srfAB包含2個(gè)模塊，srfC含有一個(gè)模塊，該基因末端連接srfD；溶桿菌素合成相關(guān)基因是bacABCDEFGH，其中bacA、bacB、bacC、bacD、bacE和bacF分別編碼不同的酶，而基因bacG編碼催化蛋白。產(chǎn)生這些具有生防作用次生代謝物的相關(guān)基因（簇）如表1[3，15]所示。隨著研究的不斷深入，將會(huì)有更多的具有生防作用的次生代謝產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)，更多的合成基因被鑒定，進(jìn)一步闡釋抑菌物質(zhì)的生物合成途徑。

表1 貝萊斯芽孢桿菌合成具有生防作用的次生代謝產(chǎn)物相關(guān)的基因簇

3.2 其他生防相關(guān)基因的研究

貝萊斯芽孢桿菌除了次生代謝產(chǎn)物以外，還有一些基因也是貝萊斯芽孢桿菌具有生防作用的因素。其中最為典型的是β-1，3-1，4-葡聚糖基因。為了解B.velezensis的β-1，3-1，4-葡聚糖酶對(duì)真菌的作用機(jī)制，XU 等[25]克隆了該酶的 β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因，發(fā)現(xiàn)其能在大腸桿菌BL21中高表達(dá)，且該重組蛋白可以破壞真菌菌絲的形態(tài)而使其致病力降低，表明該酶具有較大的應(yīng)用潛力。

4 貝萊斯芽孢桿菌的應(yīng)用

近年來(lái)，越來(lái)越多貝萊斯芽孢桿菌的作用被發(fā)掘，除生防作用以外，貝萊斯芽孢桿菌還具有良好的固氮作用，它能促進(jìn)養(yǎng)分的吸收和生物膜的形成、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)系統(tǒng)性抗性，對(duì)煙嘧磺隆、苯磺隆、吡嘧磺隆、砜嘧磺隆、甲嘧磺隆等磺酰脲類除草劑也有良好的降解效果[26]。因此，貝萊斯芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)、工業(yè)以及生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。

4.1 貝萊斯芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用

貝萊斯芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)上有著廣泛的應(yīng)用，是常見(jiàn)生防菌之一。從土壤中分離出來(lái)的貝萊斯芽孢桿菌 Jnb16菌株能有效的抑制水稻稻瘟病菌的生長(zhǎng)，并對(duì)水稻具有良好的促生作用[27]。貝萊斯芽孢桿菌 MT310對(duì)煙草赤星病菌（Alternaria alternata）、黃連根腐病菌（Fusariumsp.）、石榴干腐病菌（Phomopsissp.）、高粱葉斑病菌（Phyllosticta sorghina）和高粱炭疽病菌（Colletotrichum graminicola）等植物病原真菌有明顯抑制效果，并對(duì)煙草赤星病菌的抑制效果最好，抑制率達(dá)49.96%[28]。

貝萊斯芽孢桿菌的孢子不僅具有耐保存的特性，而且能夠耐受極端的外界環(huán)境，因此容易被制作成生物制劑。馮江鵬等[29]的研究結(jié)果顯示,貝萊斯芽孢桿菌JK3菌株含有脂肽類抗菌物質(zhì)生物合成相關(guān)基因srfAA、bymB、fenD、bacA和ituC,提前24 h或接種膠孢炭疽菌孢子的同時(shí)噴施JK3發(fā)酵上清液對(duì)草莓炭疽病的防治效果超過(guò) 95%，表明貝萊斯芽孢桿菌有開(kāi)發(fā)為防治膠孢炭疽菌生防制劑的潛力。貝萊斯芽孢桿菌AH2菌株，已經(jīng)作為植物殺菌劑投入生產(chǎn)應(yīng)用，可用于防治白粉病、灰霉病、紋枯病、菌核病、晚疫病等[30]，并且AH2菌株的生物制劑對(duì)煙草赤星病的防治效果與化學(xué)防治效果無(wú)顯著差異。除此之外，貝萊斯芽孢桿菌FZB42菌株能產(chǎn)生具有抑菌作用的次生代謝產(chǎn)物，能夠產(chǎn)生生物膜，具有高效的根部定殖能力，可以有效幫助植物抵御病原微生物的侵染，已經(jīng)作為生物肥料和生物防治試劑在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[31]。截止到2021年3月底，在中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)（http://www.chinapesticide.org.cn/hysj/index.jhtml）登記的有效成分為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（現(xiàn)已被歸類為貝萊斯芽孢桿菌）有4條記錄，暫無(wú)有效成分為貝萊斯芽孢桿菌的記錄。其中甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌LW-6主要?jiǎng)┬蜑槟杆幒涂蓾裥苑蹌?，主要防治柑橘潰瘍病、黃瓜細(xì)菌性條斑病和水稻細(xì)菌性條斑病。甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌9912的主要?jiǎng)┬鸵彩悄杆幒涂蓾裥苑蹌饕乐尾葺?、黃瓜灰霉病和蘋果樹(shù)腐爛病。

目前，貝萊斯芽孢桿菌作為生防菌的應(yīng)用也存在一些問(wèn)題。大多數(shù)已被分離的菌株的防治機(jī)理暫未明確，大田防效暫未得到驗(yàn)證，也并未得到規(guī)?；纳a(chǎn)和應(yīng)用，這些問(wèn)題還需在后續(xù)的研究和應(yīng)用中解決。生物制劑的劑型、使用方式和使用周期對(duì)藥效都有影響，因此在應(yīng)用中還要注意貝萊斯芽孢桿菌生物制劑的生產(chǎn)和使用方式。

4.2 貝萊斯芽孢桿菌在工業(yè)上的應(yīng)用

研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌含有豐富的蛋白酶和纖維素酶，而這兩類酶在工業(yè)酶中占有很大的比例。如貝萊斯芽孢桿菌157菌株內(nèi)含有大量的內(nèi)切纖維素酶、木質(zhì)素酶和果膠酶等，其中內(nèi)切纖維素酶的含量最高，在飼料添加劑、洗滌劑和造紙行業(yè)具有良好的應(yīng)用前景[32]。貝萊斯芽孢桿菌P11菌株具有顯著的角蛋白溶解活性、蛋白酶水解活性和纖維素酶活性[33-34]，在工業(yè)生產(chǎn)上具有應(yīng)用潛力。甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（現(xiàn)已歸屬于貝萊斯芽孢桿菌）FBKL1.0190[35]能產(chǎn)生高活性的中性蛋白酶、纖維素酶等，可應(yīng)用于水產(chǎn)業(yè)和紡織業(yè)。張德峰等[36]通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌LF01菌株含有大量抗菌合成物質(zhì)合成基因簇，其抗菌活性物質(zhì)具有較高的生物安全性，能顯著提高尼羅羅非魚(yú)對(duì)無(wú)乳鏈球菌的抗病力，該菌株產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)可用于水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌病的防控。貝萊斯芽孢桿菌還可用于降解有毒有害的工業(yè)副產(chǎn)品，例如處理屠宰場(chǎng)的廢水、降解紡織業(yè)垃圾等。此外，貝萊斯芽孢桿菌具有將染料DR28降解為聯(lián)苯胺和4-氨基聯(lián)苯的能力，這兩種物質(zhì)都是有效的誘變劑。它們會(huì)在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)一步降解，降低染料的毒性和致突變性。因此，貝萊斯芽孢桿菌還可應(yīng)用于偶氮染料的脫色和解毒[37]。

4.3 貝萊斯芽孢桿菌在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

芽孢桿菌及其胞外多糖（Exopolysaccharide，EPS）可以調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，改善機(jī)體免疫能力，對(duì)醫(yī)療保健、生物納米技術(shù)等行業(yè)具有特殊價(jià)值。MOGHANNEM 等[38]使用響應(yīng)面法對(duì) M7，E1和9I三個(gè)菌株進(jìn)行篩選得出結(jié)論：編號(hào)為9I的菌株（鑒定為貝萊斯芽孢桿菌KY498625菌株）可生產(chǎn)相對(duì)最多的胞外多糖，易于使用二乙氨基乙基纖維素柱（DEAE-Cellulose column）進(jìn)行提取和純化，且這種胞外多糖易于被生物降解，方便被應(yīng)用于健康和生物納米技術(shù)部門、食品和化妝品行業(yè)的膠凝劑以及環(huán)境部門的生物絮凝劑，被認(rèn)為是環(huán)境可持續(xù)方面的重大突破。從貝萊斯芽孢桿菌MHM3菌株中提取出的EPS化合物在極低濃度下就具有極高的抗癌能力，且對(duì)健康的宿主細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒性[39]。此外，從貝萊斯芽孢桿菌 RA5401中提取的五種化合物對(duì)乳腺癌細(xì)胞有抗增殖活性，其中兩種通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)癌蛋白酶發(fā)揮作用，其余三種通過(guò)抑制癌細(xì)胞的G蛋白偶聯(lián)受體發(fā)揮作用[40]。YOO等[41]從某種韓國(guó)食品中提取出了貝萊斯芽孢桿菌K68菌株，它可以通過(guò)脫氧野尻霉素（Deoxynojirimycin，DNJ）的產(chǎn)生抑制變異鏈球菌生物膜的形成、粘附和GTF基因的表達(dá)來(lái)預(yù)防齲齒。隨著研究的不斷深入，貝萊斯芽孢桿菌在生物醫(yī)學(xué)方面更多的用途會(huì)被發(fā)掘。

5 小結(jié)

貝萊斯芽孢桿菌廣泛分布于自然界，它作為生防菌是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。2016年以來(lái)，貝萊斯芽孢桿菌引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，發(fā)表的研究論文數(shù)量呈明顯上升態(tài)勢(shì)。其中研究主要集中在分離鑒定、生防作用以及基因功能等方面，對(duì)適宜特定環(huán)境菌株的篩選、貝萊斯芽孢桿菌的生防機(jī)制、定殖能力等方面的報(bào)道較少。

在未來(lái)的研究中，應(yīng)該通過(guò)大數(shù)據(jù)解析功能基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，更加深入的研究貝萊斯芽孢桿菌與寄主生物互相作用的機(jī)制；通過(guò)設(shè)計(jì)不同的環(huán)境，進(jìn)行適宜生存菌株的篩選，使其能更好的在特定的農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮作用；通過(guò)熒光示蹤方法分析貝萊斯芽孢桿菌在植物根、葉圍等部位以及動(dòng)物腸道中的定殖能力；挖掘與定殖相關(guān)基因（簇），通過(guò)分子遺傳改良技術(shù)增強(qiáng)菌株的定殖能力，提高其應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)在實(shí)際應(yīng)用的過(guò)程中，應(yīng)更加重視其規(guī)?；纳a(chǎn)和使用、生物安全性的合理評(píng)定及監(jiān)管。貝萊斯芽孢桿菌對(duì)綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展有重大意義，其在工業(yè)、生物醫(yī)學(xué)等方面的應(yīng)用潛力也不容小覷，相信貝萊斯芽孢桿菌很快將在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、生物醫(yī)學(xué)等行業(yè)發(fā)揮重要作用。