錦鯉源維氏氣單胞菌的鑒定及致病性分析

龐月，郭美玲 ，劉芯睿 ，薛淑霞 ，通信作者，孫金生 ，2

（1. 天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2. 天津師范大學(xué) 天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

錦鯉（Cyprinus carpiovar.koi）屬于鯉形目（Cypriniforms）鯉科（Cyprinidae）鯉魚屬（Cypriuus）[1]，養(yǎng)殖環(huán)境改變導(dǎo)致體色突變，經(jīng)過多年雜交選育形成眾多錦鯉品系[2]。錦鯉觀賞性強，經(jīng)濟效益可觀，市場和文化價值深厚[3]。但細菌性疾病發(fā)生，會給錦鯉養(yǎng)殖生產(chǎn)造成較大經(jīng)濟損失[4-5]。

養(yǎng)殖錦鯉常見的細菌性疾病有許多，如細菌性敗血癥、爛鰓病、腸炎病、赤皮病、豎鱗病，腐皮病等。2013年，韓娜娜等[6]從山東地區(qū)患病錦鯉體內(nèi)分離出摩氏摩根氏菌（Morganella morganii），藥敏試驗結(jié)果表明復(fù)達欣、慶大霉素和新霉素等11種藥物對其有效抑制；2015年，周陽等[7]從四川地區(qū)患病錦鯉體內(nèi)分離出假單胞菌（Pseudomonassp.），藥敏試驗結(jié)果顯示慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素對其具有一定的抑菌作用；2015年，陳凱等[8]在江蘇地區(qū)患病錦鯉體內(nèi)分離出銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），藥敏試驗發(fā)現(xiàn)頭孢曲松、卡那霉素、四環(huán)素等35種藥物抑菌效果較好；姜艷麗[9]從東北地區(qū)患病錦鯉體內(nèi)分離出嗜水氣單胞菌，檢測出其攜帶氣溶素（aer）基因，有致病性，發(fā)現(xiàn)其對四環(huán)素、洛美沙星、頭孢噻肟等藥物高度敏感。以上研究結(jié)果表明，養(yǎng)殖錦鯉細菌性疾病會因時間和地域不同出現(xiàn)不同的流行病原。即使是同一種病原，因為時間和地域不同，也具有不同的致病特性。例如，2017年，楊昆明等[10]從新疆患病錦鯉體內(nèi)分離出維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii），用108CFU/mL濃度的菌液注射健康錦鯉每尾0.5 mL后出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，藥敏試驗發(fā)現(xiàn)其對慶大霉素、氧氟沙星、頭孢噻肟等藥物敏感；而2022年，張鳳賢等[11]從河北患病錦鯉體內(nèi)分離出的維氏氣單胞菌同等濃度注射錦鯉1 mL后未出現(xiàn)死亡情況，藥敏試驗結(jié)果顯示其對鹽酸多西環(huán)素、恩諾沙星、氟苯尼考敏感。因此，分析闡釋不同病原分離株的致病特性是十分重要的。

我們從天津地區(qū)養(yǎng)殖患病錦鯉體內(nèi)分離獲得一株優(yōu)勢菌株，在確定該菌株為錦鯉致病病原的基礎(chǔ)上，進行了菌株鑒定及致病性分析，旨在闡釋錦鯉細菌性致病病原的致病特性，為養(yǎng)殖錦鯉細菌性疾病防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

患病錦鯉由天津某錦鯉養(yǎng)殖基地提供?；疾◆~體消瘦，體表有潰瘍灶，魚鰭基部有出血（圖1）。健康錦鯉購自水產(chǎn)市場，平均體重28 g，平均體長15 cm。

圖1 患病錦鯉的臨床癥狀

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌分離純化

無菌操作從患病錦鯉的肝臟分離接種細菌于腦心浸出液（Brain Heart Infusion，BHI）固體培養(yǎng)基（購自英國Oxoid公司）上，于28 ℃恒溫箱中倒置18 h，選擇優(yōu)勢菌落，再次劃線得到純培養(yǎng)菌株CTJ206，挑取長到適合大小的單菌落到BHI液體培養(yǎng)基中180 r/min培養(yǎng)12 h，加入無菌甘油混勻后，轉(zhuǎn)移到- 80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2.2 生理生化特性鑒定

將菌株CTJ206接種于BHI平板上。28 ℃培養(yǎng)18 h，觀察菌落形態(tài)特征。用一次性接種環(huán)接種單菌落于弧菌科和腸桿菌科細菌生化鑒定管（購自杭州微生物試劑有限公司）中，28 ℃培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果，依據(jù)《常見細菌鑒定手冊》[12]進行判定。

1.2.3 16S rDNA、gyrB、rpoD基因克隆及序列分析

細菌基因組DNA用細菌基因組DNA提取試劑盒（購自天根生化科技有限公司）提取。引物（表1）均由生工生物工程（北京）股份有限公司合成。

表1 引物序列信息

PCR反應(yīng)體系：2×TaqMasterMix酶（購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司）25 μL，上下游引物各 2 μL，ddH2O 19 μL，模板 2 μL，共 50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 2 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。測序結(jié)果利用MEGA11軟件采用鄰接法進行系統(tǒng)進化分析。

1.2.4 毒力基因檢測

以菌株CTJ206的基因組DNA為模板，參照NAWAZ等[13]和李淑妃等[14]的方法，分別合成氣溶素（aerA）、細胞毒性腸毒素（act）、熱穩(wěn)定性腸毒素（ast）、溶血素（hly A）、鞭毛（fla）、核酶（exu）、絲氨酸蛋白酶（ser）、彈性蛋白酶（ahy B）、酯酶（lip）、Ⅲ型分泌系統(tǒng)（ascV）和胞外酶（gcaT）11種毒力基因引物后進行擴增（引物序列見表1）。PCR反應(yīng)體系25 μL：DNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，2×TaqMasterMix酶 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃ 45 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸 7 min。

1.2.5 人工感染試驗

健康錦鯉在實驗室循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)。將錦鯉隨機分為6組，每組10尾。感染試驗前每組隨機取一尾魚解剖分菌，未分離出致病菌，證明魚體健康。其中5組腹腔注射濃度分別為4.7×108、4.7×107、4.7×106、4.7×105、4.7×104CFU/mL的CTJ206菌懸液作為試驗組，1組注射滅菌生理鹽水，作為對照組。每尾注射劑量為0.2 mL。持續(xù)曝氣，注射前24 h禁食，每兩天更換三分之一的水，每日更換濾棉，觀察7 d，并記錄錦鯉的發(fā)病癥狀和死亡情況。從人工感染后發(fā)病魚的肝臟、脾臟和腎臟中再次進行分菌并鑒定。根據(jù)寇氏法計算菌株CTJ206的半數(shù)致死量LD50。

1.2.6 藥敏試驗

將1.0×108CFU/mL菌液吹勻后吸100 μL進行涂布，選用29種藥敏紙片（購自杭州微生物試劑有限公司）進行藥敏試驗。37 ℃培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈直徑，取平均值來判定CTJ206菌株的藥物敏感性。

1.2.7 病理組織切片觀察

采集人工感染瀕死錦鯉的肝臟和脾臟組織，用4 %的多聚甲醛溶液固定，制備病理組織切片，觀察錦鯉的組織病理學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 致病菌分離純化

菌株CTJ206在BHI平板上28 ℃恒溫培養(yǎng)18 h后，菌落呈圓形，其邊緣整齊、直徑接近1 mm、光滑、灰白色，較不透明，微隆起，用BHI液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后菌懸液呈云霧狀，生長迅速。

2.2 生理生化鑒定

參考《常見細菌鑒定手冊》[12]，菌株 CTJ206與維氏氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC35624）的生化試驗結(jié)果基本一致（表2），初步鑒定為維氏氣單胞菌。

表2 分離菌株CTJ206和維氏氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC35624）的生理生化性狀

2.3 16S rDNA、gyrB及rpoD基因序列分析

利用保守基因序列比對方法對菌株 CTJ206進行進一步鑒定。利用16S rDNA通用引物擴增得到1 424 bp的片段，gyrB基因和rpoD基因特異性引物擴增后分別得到815 bp和560 bp的片段。測序比對結(jié)果顯示，菌株CTJ206的16S rDNA序列與維氏氣單胞菌（NR044845.1、NR119045.1和NR112838.1）同源性達到99 %，CTJ206的gyrB基因與維氏氣單胞菌（MT371999.1和MW838052.1）同源性達到99 %，CTJ206的rpoD基因與維氏氣單胞菌（KT970667.1和 MW122075.1）同源性達到 99 %。MEGA11構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹顯示菌株CTJ206所在分支與維氏氣單胞菌聚為一支（圖2）。結(jié)合形態(tài)學(xué)、理化特性、保守基因序列分析，可鑒定其為維氏氣單胞菌。

圖2 CTJ206的保守基因序列系統(tǒng)進化樹

2.4 毒力基因檢測

毒力基因檢測結(jié)果（圖 3）顯示，11種毒力基因中，有 8種（ahyB、ascV、gcaT、act、lip、exu、aerA、fla）可以從菌株 CTJ206中擴增到單一且與預(yù)期片段相符合的條帶，而ast、ser和hlyA，未檢測到陽性條帶。

圖3 CTJ206的毒力基因擴增結(jié)果

2.5 人工感染試驗

人工感染后發(fā)病錦鯉臨床癥狀主要表現(xiàn)為魚體反應(yīng)較遲鈍，胸鰭基部出血，肛門紅腫，發(fā)病癥狀與自然發(fā)病錦鯉相似。對瀕死錦鯉進行分菌處理，所分離菌株鑒定結(jié)果為維氏氣單胞菌，說明菌株CTJ206具有致病作用，證實其為此次錦鯉發(fā)病的致病病原。對照組魚則未分離出該致病菌。統(tǒng)計得到菌株 CTJ206對錦鯉的半數(shù)致死量LD50為 1.77×106CFU/g（表 3）。

表3 分離菌株CTJ206注射感染結(jié)果

2.6 藥敏試驗

29種抗生素藥敏結(jié)果見表 4。分離菌株CTJ206對阿奇霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星等21種抗生素敏感；對卡那霉素和阿米卡星2種抗生素中度敏感；對紅霉素、萬古霉素、鏈霉素等6種抗生素耐藥。

表4 分離菌株CTJ206的藥物敏感性

2.7 病理組織切片觀察結(jié)果

病理組織切片觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖4），肝臟組織可見紅細胞淤積嚴(yán)重，細胞腫脹、核溶解，細胞壞死，空泡變性；脾臟可見鐵血黃素在組織沉積（由血管反復(fù)出血造成）。

圖4 錦鯉感染維氏氣單胞菌后的病理組織學(xué)變化

3 討論

生理生化特性和分子生物學(xué)相結(jié)合是細菌鑒定的經(jīng)典方法[15]，正確率較高，但很難區(qū)分同一屬的不同種細菌，且試驗流程繁瑣，耗時較長。研究表明，氣單胞菌屬的多個菌種都是養(yǎng)殖魚類的致病病原。鱖魚（Siniperca chuatsi）[16]、鯉魚[17]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[18]、團頭魴（Megalobrama amblycephala）[19]等可感染嗜水氣單胞菌；一些研究者發(fā)現(xiàn)鰱魚（Cypriniformes:Cyprinidae）[20]、泥鰍（Misgurnus mizolepis）[21]、斑馬魚（Danio rerio）[22]等可感染溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）；鯰魚（Rhamdia quelen）[23]、鱘魚（Acipenser sinensis）[24]、南方鲇（Silurus meridionalis）[25]等可感染豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae）。這些氣單胞菌的表型特征相似，所以很難僅僅通過表型特征鑒定菌株到種。16S rDNA序列分析是分子遺傳學(xué)中細菌種屬鑒定標(biāo)準(zhǔn)方法，但是16S rDNA高度保守，對于同一屬內(nèi)的鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確[26]。相關(guān)研究表明，管家基因存在一定的突變率且相對保守，可以很好地區(qū)分氣單胞菌的不同種，其中最常應(yīng)用的有促旋酶B亞單位基因gyrB和編碼細菌 RNA聚合酶 σ70因子基因rpoD[27-29]。在16S rDNA序列比對的基礎(chǔ)上，我們引入了管家基因gyrB和rpoD進行序列比對。依據(jù)分子生物學(xué)和生理生化結(jié)果，判定分離菌株CTJ206為維氏氣單胞菌。

CHEN等[30]從發(fā)病異育銀鯽中分離出的維氏氣單胞菌攜帶aerA、alt、gcaT、ser、ahyB和lip6個毒力基因，LI等[31]從患病鯰魚中分離出的維氏氣單胞菌主要攜帶alt、ast、aerA、lip、flaA和hlyA等毒力基因，CHANDRARATHNA等[32]從患病斑馬魚中分離出的維氏氣單胞菌攜帶aerA、lip、ser、exu和gcaT5種毒力基因，本研究顯示，分離菌株CTJ206可以檢測到8種毒力基因，為fla、exu、ahyB、aerA、act、lip、ascV和gcaT。綜合分析以上研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)維氏氣單胞菌均攜帶的毒力基因有aerA和lip兩種，且不同研究檢測的毒力基因類別不完全相同。aerA是一種溶血毒素基因，能提高維氏氣單胞菌致病能力[33]，LI等[34]發(fā)現(xiàn)春季分離的氣單胞菌菌株lip基因的攜帶率明顯高于夏季。這說明維氏氣單胞菌不同菌株間可檢測出的毒力基因呈現(xiàn)出多態(tài)性，也說明毒力基因的分布具有漂變性。

抗生素是防治水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病的主要手段[35]。通過開展藥敏試驗，選擇對病原菌敏感的非禁用抗生素，是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細菌性疾病防治的科學(xué)手段，同時水產(chǎn)品食用安全也得到了保障[36]。藥敏試驗結(jié)果顯示，菌株CTJ206對慶大霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星等21種抗生素敏感，這與CHEN等[30]和康雪微等[37]研究結(jié)果部分一致，可根據(jù)這些結(jié)果，結(jié)合水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙，選擇相應(yīng)藥物來治療感染維氏氣單胞菌的患病錦鯉。菌株CTJ206對卡那霉素和阿米卡星2種抗生素中度敏感；對紅霉素、鏈霉素、氨芐西林、阿莫西林、萬古霉素和甲硝唑6種藥物產(chǎn)生耐藥，包含β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和多肽類等藥物，這可能是因為滅活酶或鈍化酶產(chǎn)生使抗菌藥物在作用于菌體之前即被破壞、失效、藥物作用靶位改變或是細胞外膜通透性改變等原因[38]。這與王家禎等[39]在黃河鯉魚源、楊小強[40]在金魚、藺凌云等[41]在團頭魴源中分離的維氏氣單胞菌耐藥情況不盡相同，原因可能是魚類品種不同、菌的來源及地區(qū)用藥差異等。該試驗結(jié)果可為錦鯉感染維氏氣單胞菌提供依據(jù)，但由于地域和菌株來源不同，治療時要進行對應(yīng)菌株測定，有針對性地選擇藥物以達到國家漁業(yè)用藥準(zhǔn)則的要求[42]。

4 結(jié)論

本研究從患病錦鯉體內(nèi)分離到1株維氏氣單胞菌，該菌株攜帶多種毒力因子，具有強致病性，通過藥敏試驗為臨床用藥提供可選擇的藥物，為錦鯉細菌性疾病防治提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。