miRNA-323-3p 聯(lián)合miRNA-873 在異位妊娠早期診斷中的價(jià)值研究

葉瑛瑛，王金輝，謝靈平

（玉環(huán)市人民醫(yī)院婦科，浙江 玉環(huán) 317600）

受精卵在子宮體腔以外著床稱為異位妊娠（ectopic pregnancy，EP），習(xí)慣稱宮外孕[1]。EP 是婦產(chǎn)科常見的急腹癥，是妊娠期出血相關(guān)死亡的主要原因，近年來其發(fā)病率有上升趨勢[2-4]。輸卵管妊娠未發(fā)生流產(chǎn)或破裂時(shí)，癥狀與體征往往不典型，很難早期診斷。目前診斷EP 的方法主要有經(jīng)陰道超聲、血清人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）及孕酮等檢查，但仍難以實(shí)現(xiàn)早期快速診斷[5-7]。因此，開發(fā)一種能夠早期快速診斷EP的標(biāo)志物具有重要臨床意義。本研究以我院收治的EP、自然流產(chǎn)及正常宮內(nèi)妊娠的90 例婦女為研究對象，通過檢測血清miR-323-3p、miR-873 的表達(dá)水平，分析其在不同妊娠結(jié)局中的表達(dá)差異，并與β-HCG、孕酮等傳統(tǒng)檢測方法進(jìn)行比較，以期為尋找一種能快速有效診斷EP 的新指標(biāo)提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020 年1 月-2022 年2 月玉環(huán)市人民醫(yī)院婦科住院的EP 患者30 例為異位妊娠組，同期在我院婦科住院或門診就診的自然流產(chǎn)患者30 例為自然流產(chǎn)組，以及在我院婦科門診體檢的正常宮內(nèi)妊娠者30 例為對照組。異位妊娠組年齡24～35 歲，平均年齡（27.53±2.79）歲；停經(jīng)天數(shù)35～54 d，平均停經(jīng)天數(shù)（44.20±4.94）d；既往孕次0～4 次，平均孕次（1.33±0.96）次。自然流產(chǎn)組年齡20～35歲，平均年齡（27.47±3.10）歲；停經(jīng)天數(shù)39～54 d，平均停經(jīng)天數(shù)（46.17±4.20）d；既往孕次0～2 次，平均孕次（0.97±0.67）次。對照組年齡22～35 歲，平均年齡（27.53±3.06）歲；停經(jīng)天數(shù)39～56 d，平均停經(jīng)天數(shù)（45.77±3.77）d；既往孕次0～3 次，平均孕次（1.13±0.73）次。三組年齡、停經(jīng)天數(shù)、既往孕次比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。所有研究對象均知曉研究內(nèi)容，并簽署知情同意書。

1.2 納入及排除標(biāo) 納入標(biāo)準(zhǔn)：異位妊娠組患者均為輸卵管妊娠，自然流產(chǎn)組均為早期流產(chǎn)，對照組為所有正常宮內(nèi)妊娠者，且為早期妊娠；年齡20～35 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：有體外受精胚胎移植術(shù)史、有EP 史、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)史、雙胎妊娠史者。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 所有研究對象于清晨空腹采集外周靜脈血5 ml，立即送至實(shí)驗(yàn)室離心，經(jīng)3600 r/min離心10 min，離心半徑12.5 cm，離心后，取上層血清2 ml 放置在-80 ℃冰箱保存待檢測,剩余血液進(jìn)行β-HCG 和孕酮檢測。

1.3.2 β-HCG 和孕酮檢測 采用羅氏全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀β-HCG 和孕酮，試劑盒為羅氏公司生產(chǎn)的配套試劑。

1.3.3 miRNA-323-3p、miRNA-873 檢測 采用RTPCR 法，實(shí)驗(yàn)分為以下3 個(gè)步驟：①RNA 提取及濃度和純度測定；②RNA 逆轉(zhuǎn)錄；③熒光定量檢測。核酸提取試劑盒由天根生物科技有限公司提供（DP503），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由東洋紡生物科技有限公司提供（FSQ-201），由杭州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心負(fù)責(zé)檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。對不符合正態(tài)分布或者方差不齊的計(jì)量資料，以中位數(shù)（M）和四分位數(shù)間距（P25，P75）表示，兩組間比較采用Mann-WhientyU檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以（n）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征曲線（ROC）分析不同指標(biāo)的診斷價(jià)值。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組miRNA-323-3p、miRNA-873、β-HCG 和孕酮比較 異位妊娠組、自然流產(chǎn)組及對照組miRNA-323-3p 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中異位妊娠組miRNA-323-3p 水平高于對照組（P＜0.05），而自然流產(chǎn)組與異位妊娠組及對照組miRNA-323-3p 水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。異位妊娠組、自然流產(chǎn)組及對照組miRNA-873 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中異位妊娠組miRNA-873 水平低于自然流產(chǎn)組及對照組（P＜0.05），而自然流產(chǎn)組與對照組miRNA-873 水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。異位妊娠組β-HCG 水平低于自然流產(chǎn)組及對照組（P＜0.05），自然流產(chǎn)組β-HCG 水平低于對照組（P＜0.05）。異位妊娠組、自然流產(chǎn)組及對照組孕酮水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中異位妊娠組及自然流產(chǎn)組孕酮水平低于對照組（P＜0.05），而異位妊娠組與自然流產(chǎn)組之間孕酮水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 三組miRNA-323-3p、miRNA-873、β-HCG 和孕酮比較[M（P25，P75）]

2.2 miRNA-323-3p、miRNA-873、β-HCG 和孕酮及聯(lián)合檢測預(yù)測EP 的價(jià)值 miRNA-323-3p 和miRNA-873 兩者聯(lián)合檢測及miRNA-323-3p、miRNA-873、β-HCG 和孕酮四者聯(lián)合檢測均具有較高的敏感度和特異度，見表2、圖1。

表2 miRNA-323-3p、miRNA-873、β-HCG 和孕酮及聯(lián)合檢測預(yù)測EP 的效能評價(jià)

圖1 miRNA-323-3p、miRNA-873、β-HCG 和孕酮及聯(lián)合檢測的ROC 曲線圖

3 討論

EP 部位復(fù)雜多元化，不同部位的EP 其臨床表現(xiàn)有較大差異，特別是特殊部位EP，發(fā)病率較低，臨床癥狀及體征不典型，早期診斷困難，易出現(xiàn)誤診、漏診而延誤治療，其一旦破裂容易引起腹腔大出血，嚴(yán)重者可導(dǎo)致失血性休克危及患者生命[8，9]。有研究顯示[10，11]，EP 是妊娠早期導(dǎo)致孕婦死亡的重要原因，且死亡占比有所上升。因此，早期診斷EP 對指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。

Lu Q 等[12]對36 例正常宮內(nèi)妊娠、30 例自然流產(chǎn)和34 例EP 患者進(jìn)行了21 種miRNAs 分析，在21 種miRNAs 中，EP 中miRNA-873 和miRNA-223顯著低于自然流產(chǎn)和正常宮內(nèi)妊娠，而miRNA-323在EP 中顯著升高；miRNA-873 作為單項(xiàng)指標(biāo)診斷EP 的敏感性最高，為61.76%，miRNA-873 聯(lián)合hCG 和孕酮的敏感性為79.41%（90%固定特異性區(qū)間）。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-323-3p 診斷EP 的敏感度為83.30%，特異度為51.70%，其診斷EP 的價(jià)值明顯較miRNA-873 高；此外，異位妊娠組miRNA-323-3p 水平高于對照組（P＜0.05），而miRNA-873 水平低于自然流產(chǎn)組及對照組（P＜0.05），提示不同的miRNAs 在EP 的作用機(jī)制各不相同，可能存在相互抑制的情況。目前臨床診斷EP 主要通過經(jīng)陰道超聲檢查，但難以實(shí)現(xiàn)早期快速診斷的目的，且部分少見部位如卵巢EP、腹腔妊娠超聲常難以診斷[13，14]。未來或許可以通過miRNAs 檢測實(shí)現(xiàn)早期診斷EP，同時(shí)可以彌補(bǔ)超聲診斷的不足，這需要更多大樣本的早期前瞻性研究予以證實(shí)。

陳國強(qiáng)等[15]對48 例早期先兆流產(chǎn)、32 例EP、30例正常妊娠孕婦血清β-HCG、雌二醇、孕酮及CAl25 水平進(jìn)行分析，4 項(xiàng)血清標(biāo)志物單獨(dú)預(yù)測EP準(zhǔn)確性低，4 項(xiàng)聯(lián)合檢測對EP 的診斷靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為90.9%、98.4%、96.9%、93.8%和97.7%。孫秋瑾等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在EP 診斷價(jià)值由高到低的順序依次為孕酮、E2、INHA、β-HCG、F-β-HCG、PAPP-A、CA125 及AFP，其中效能較高的前4 項(xiàng)血清標(biāo)志物聯(lián)合檢測AUC 為0.970，靈敏度為86.8%，特異度為98.0%，可見β-HCG 和孕酮單獨(dú)預(yù)測EP 準(zhǔn)確性低，聯(lián)合檢測能夠彌補(bǔ)單項(xiàng)指標(biāo)存在的診斷敏感性或特異性不足的問題，使診斷效能提高[17，18]。本研究經(jīng)ROC 曲線分析顯示，miRNA-323-3p、miRNA-323-3p 和miRNA-873 兩者聯(lián)合及miRNA-323-3p、miRNA-873、β-HCG 和孕酮四者聯(lián)合檢測對診斷EP 準(zhǔn)確性較高，曲線下面積分別為0.673（95%CI：0.558～0.789）、0.772（95%CI：0.665～0.880）、0.908（95%CI：0.849～0.968），敏感度分別為83.30%、76.70%及83.30%，特異度分別為51.70%、78.30%及88.30%。可見，miRNA-323-3p、miRNA-873、β-HCG 和孕酮聯(lián)合檢測對診斷EP 價(jià)值較高。目前關(guān)于miRNAs 在EP 發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制研究少見，LIN28B/Let-7 和KISS1/kisspeptins 通路已被證實(shí)參與EP 的病理生理過程[19，20]。未來需尋找調(diào)控EP 相關(guān)基因如VEGFA、EGFR、ESR1 和免疫應(yīng)答相關(guān)基因表達(dá)的miRNAs，對其在EP 患者的組織樣本和血清中的表達(dá)進(jìn)行分析，可為了解miRNAs 在EP 發(fā)病機(jī)制中的作用提供新的見解。

綜上所述，EP 患者miRNA-323-3p 表達(dá)水平升高，miRNA-873 表達(dá)水平下降，miRNA-323-3p、miRNA-873、β-HCG 和孕酮四者聯(lián)合檢測對診斷EP 準(zhǔn)確性較高。本研究樣本量偏少，今后還需多中心、大樣本量進(jìn)一步研究。